王正寬,劉圓,石曉朦,王振中,蕭偉#(1.江蘇康緣藥業(yè)股份有限公司康緣現(xiàn)代中藥研究院,江蘇連云港222047;2.中藥制藥過程新技術(shù)國家重點實驗室,江蘇連云港222047;3.中藥提取精制新技術(shù)重點研究室,江蘇連云港222047)
·制劑與工藝·
Box-Behnken 設(shè)計-響應(yīng)面法優(yōu)化桂枝茯苓膠囊的閃式提取工藝Δ
王正寬1,2,3*,劉圓1,2,3,石曉朦1,2,3,王振中1,2,3,蕭偉1,2,3#(1.江蘇康緣藥業(yè)股份有限公司康緣現(xiàn)代中藥研究院,江蘇連云港222047;2.中藥制藥過程新技術(shù)國家重點實驗室,江蘇連云港222047;3.中藥提取精制新技術(shù)重點研究室,江蘇連云港222047)
目的:優(yōu)化桂枝茯苓膠囊的閃式提取工藝。方法:以內(nèi)刃轉(zhuǎn)速、液固比、提取時間等為考察因素,以沒食子酸、芍藥苷、苯甲酸、肉桂酸、苯甲酰芍藥苷、苦杏仁苷轉(zhuǎn)移率的綜合評價值為考察指標,在單因素試驗基礎(chǔ)上結(jié)合Box-Behnken設(shè)計-響應(yīng)面法對桂枝茯苓膠囊閃式提取工藝進行優(yōu)化;進行驗證試驗,并與常規(guī)的煎煮提取法(提取2次,共用時240 min)進行效果比較。結(jié)果:閃式提取桂枝茯苓膠囊的最優(yōu)工藝為以水為提取溶劑,內(nèi)刃轉(zhuǎn)速5 600 r/min,液固比10.5∶1,提取時間60 s。在此條件下驗證試驗的平均綜合評價值為85.40%(n=3),與預(yù)測值85.55%的相對誤差為0.15%,并高于煎煮提取法(72.65%)。結(jié)論:優(yōu)化的閃式提取工藝用于桂枝茯苓膠囊的提取,具有高效、快速的特點。
桂枝茯苓膠囊;單因素試驗;Box-Behnken設(shè)計;響應(yīng)面法;閃式提??;工藝優(yōu)化
桂枝茯苓膠囊為東漢張仲景《金匱要略》中古方桂枝茯苓丸的改進劑型,由桂枝、茯苓、牧丹皮、白芍和桃仁組成,諸藥合用,達活血化瘀、消腫散結(jié)之功[1]。其還可與米非司酮聯(lián)合用于治療子宮肌瘤等[2],是治療婦科疾病的首選良方。目前,現(xiàn)有的桂枝茯苓膠囊提取方法具有水提取時間長(4 h)、指標成分保留率低(約70%)、蒸汽耗能大等缺點。近幾年,國內(nèi)開始研究應(yīng)用閃式提取技術(shù)提取中藥的指標成分,該技術(shù)利用閃式提取器設(shè)備中內(nèi)刃高速轉(zhuǎn)動,并與外刃發(fā)生切割的過程中產(chǎn)生強力渦流,從而產(chǎn)生劇烈攪拌作用使指標成分快速轉(zhuǎn)移至溶劑中,最終達到分離指標成分的目的。與傳統(tǒng)煎煮提取方法比較,閃式提取技術(shù)提取中藥有效成分具有快速、高效、節(jié)能、熱穩(wěn)定[3]等優(yōu)點。但目前報道的閃式提取技術(shù)研究的對象多為單一中藥材,用于中藥復(fù)方提取的研究文獻報道較少[4]。因此,筆者嘗試利用閃式提取技術(shù)對中藥復(fù)方桂枝茯苓膠囊的提取工藝進行改進,并期望為其他復(fù)方中藥提供一項新的提取工藝技術(shù)。
JHBE-100閃式提取器(西安金南生物科技有限公司);2695高效液相色譜(HPLC)儀[美國Waters科技(上海)有限公司];H1650-W臺式高速離心機(湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司);AG-135電子分析天平[瑞士梅特勒-托利多(上海)有限公司]。
桂枝、茯苓、牡丹皮、白芍、桃仁飲片均購自江蘇省連云港市康緣醫(yī)藥商業(yè)有限公司(批號分別為:Y1607054、Y1607047、Y160819、Y160805、Y1606045),經(jīng)連云港康濟大藥房連鎖有限公司吳舟執(zhí)業(yè)藥師鑒定,符合2015年版《中國藥典》(一部)標準,均為真品;芍藥苷、沒食子酸、苯甲酸、苯甲酰芍藥苷、肉桂酸、苦杏仁苷對照品(中國食品藥品檢定研究院,批號分別為:110736-201539、110831-201204、100419-201302、B-024120905、110786-200503、110820-201506,純度分別為:96.4%、89.9%、100%、≥98%、≥98%、93.4%);三氟乙酸、乙腈、甲醇等為色譜純;其余試劑均為分析純。
2.1.1 色譜條件按2015年版《中國藥典》(一部)“桃仁”項下苦杏仁苷含量測定方法[5]測定。以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑,甲醇-水(20∶80)為流動相,流速為1 mL/min,檢測波長為218 nm,進樣量為10 μL。取“2.1.2”和“2.1.3”項下對照品和供試品溶液進樣分析,色譜圖見圖1。理論板數(shù)按苦杏仁苷峰計,應(yīng)不低于2 500。
圖1 苦杏仁苷的高效液相色譜圖Fig1 HPLC chromatograms of amygdalin
2.1.2 對照品溶液的制備取苦杏仁苷對照品適量,精密稱定,加50%乙醇制成260 μg/mL的對照品溶液。
2.1.3 供試品溶液的制備精密吸取單因素考察中內(nèi)刃轉(zhuǎn)速第一次試驗的提取液1 mL至10 mL量瓶中,加50%乙醇稀釋至刻度,搖勻,離心(轉(zhuǎn)速:16 500 r/min,半徑:90 mm,下同)5 min,取上清液,得供試品溶液。
2.1.4 線性關(guān)系考察分別精密吸取上述對照品溶液1、2、4、6、8、10 mL置于10 mL量瓶中,加50%乙醇定容至刻度,搖勻,即得系列對照品溶液。分別進樣10 μL,以進樣質(zhì)量濃度為橫坐標(x)、峰面積為縱坐標(y)繪制標準曲線,得回歸方程為y=23.61x+19.64(r=0.999 5)。結(jié)果表明,苦杏仁苷檢測質(zhì)量濃度線性范圍為26.0~260 μg/mL。
2.2.1 色譜條件參考文獻[6]及前期試驗確定的色譜條件。以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑,色譜柱為Waters Symmetry C18(250 mm×4.6 mm,5 μm);以含0.02%三氟乙酸的水溶液為流動相A,以乙腈為流動相B,流速為1 mL/min,梯度洗脫(程序見表1);檢測波長為230 nm;進樣量為10 μL。分別取“2.2.2”和“2.2.3”項下混合對照品和供試品溶液進樣分析。各相鄰峰間分離度均大于1.5,理論板數(shù)按芍藥苷峰計,應(yīng)不低于4 000,色譜圖見圖2。
表1 梯度洗脫程序Tab1 Gradient elution program
圖2 沒食子酸、芍藥苷、苯甲酸、肉桂酸、苯甲酰芍藥苷的高效液相色譜圖Fig2 HPLC chromatograms of gallic acid,paeoniflorin,benzoicacid,cinnamicacidand benzoyl paeoniflorin
2.2.2 混合對照品溶液的制備分別取沒食子酸、芍藥苷、苯甲酸、肉桂酸、苯甲酰芍藥苷對照品適量,精密稱定,加50%甲醇制成質(zhì)量濃度分別為101.5、260.6、30.7、22.4、58.3 μg/mL的混合對照品溶液,即得。
2.2.3 供試品溶液的制備精密吸取單因素考察中內(nèi)刃轉(zhuǎn)速第一次試驗的提取液1 mL至10 mL量瓶中,加50%甲醇稀釋至刻度,搖勻,離心5 min,取上清液,得供試品溶液。
2.2.4 線性關(guān)系考察分別精密吸取“2.2.2”項下混合對照品溶液1.0、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0 mL置于10 mL量瓶中,加50%甲醇稀釋至刻度,搖勻,即得系列對照品溶液。按“2.2.1”項下色譜條件分別進樣10 μL,以進樣質(zhì)量濃度為橫坐標(x)、峰面積為縱坐標(y)繪制標準曲線,得沒食子酸、芍藥苷、苯甲酸、肉桂酸、苯甲酰芍藥苷的回歸方程分別為y=13.975x+1.323 2(r=0.999 9)、y=13.068x-5.531 4(r=0.999 9)、y=49.391x-3.286 9(r=1.000 0)、y=89.04x+0.218 9(r=0.999 9)、y=51.09x+5.323(r=1.000 0)。結(jié)果表明,沒食子酸、芍藥苷、苯甲酸、肉桂酸、苯甲酰芍藥苷的檢測質(zhì)量濃度線性范圍分別為10.15~101.5、26.06~260.6、3.07~30.7、2.24~22.4、5.83~58.3 μg/mL,定量限分別為10.15、26.06、3.07、2.24、5.83 μg/mL。
2.2.5 精密度考察精密吸取“2.2.2”項下混合對照品溶液10 μL,連續(xù)進樣6次。分別計算沒食子酸、芍藥苷、苯甲酸、肉桂酸、苯甲酰芍藥苷峰面積的RSD,結(jié)果分別為1.01%、1.22%、1.05%、1.17%、1.08%(n=6)。
2.2.6 穩(wěn)定性考察取“2.2.3”項下供試品溶液,分別在室溫下放置0、4、8、12、16、20、24 h后進樣分析。分別計算沒食子酸、芍藥苷、苯甲酸、肉桂酸、苯甲酰芍藥苷峰面積的RSD,結(jié)果分別為1.12%、1.28%、1.20%、1.15%、0.98%(n=7)。
2.2.7 重復(fù)性考察取單因素考察中內(nèi)刃轉(zhuǎn)速第一次試驗的提取液,按“2.2.3”項下方法制備成供試品溶液,共6份,進樣測定。分別計算沒食子酸、芍藥苷、苯甲酸、肉桂酸、苯甲酰芍藥苷峰面積的RSD,結(jié)果分別為2.08%、1.95%、2.37%、1.93%、2.04%(n=6)。
2.2.8 準確度考察量取已知含量的單因素考察中內(nèi)刃轉(zhuǎn)速第一次試驗的提取液適量,加入定量的沒食子酸、芍藥苷、苯甲酸、肉桂酸、苯甲酰芍藥苷對照品,按“2.2.3”項下方法制備成供試品溶液,進樣測定并計算。結(jié)果,沒食子酸、芍藥苷、苯甲酸、肉桂酸、苯甲酰芍藥苷平均加樣回收率分別為99.31%、99.43%、100.03%、99.42%、100.01%,RSD分別為2.08%、1.98%、1.79%、2.04%、2.07%(n=6)。
根據(jù)閃式提取器的提取原理[7]及桂枝茯苓膠囊產(chǎn)品的性能特點,對其進行閃式提取工藝考察。所有試驗藥材均進行粗粉碎(16目,下同),每份試驗用藥材粗粉為1.2 kg(1個處方量),以水為提取溶劑,選擇對閃式提取效果可能有影響的因素,如內(nèi)刃轉(zhuǎn)速、液固比、提取時間等進行考察。在單因素試驗的基礎(chǔ)上結(jié)合Box-Behnken設(shè)計-響應(yīng)面法進行優(yōu)化,得到各自試驗提取液。由于桂枝茯苓膠囊藥液中各指標成分[8-9]含量不同,其中芍藥苷、苦杏仁苷含量較高,故各給予二者30%的權(quán)重比例;而沒食子酸、苯甲酸、肉桂酸、苯甲酰芍藥苷含量相對較低,故各給予10%的權(quán)重比例。權(quán)重共計100%。分別測定各指標成分含量并計算其轉(zhuǎn)移率[轉(zhuǎn)移率(%)=藥液中指標成分總量/藥材中指標成分總量×100%]。
按權(quán)重對各指標成分轉(zhuǎn)移率進行綜合評價,以綜合評價值作為提取效果的評判依據(jù)。綜合評價值=(芍藥苷轉(zhuǎn)移率×30%+苦杏仁苷轉(zhuǎn)移率×30%+沒食子酸轉(zhuǎn)移率×10%+苯甲酸轉(zhuǎn)移率×10%+肉桂酸轉(zhuǎn)移率×10%+苯甲酰芍藥苷轉(zhuǎn)移率×10%)×100%。
2.4.1 內(nèi)刃轉(zhuǎn)速固定液固比為10∶1、提取時間為60 s,考察內(nèi)刃轉(zhuǎn)速(2 000、3 000、4 000、5 000、6 000 r/min)對各指標成分轉(zhuǎn)移率的影響。結(jié)果,綜合評價值分別為56.3%、73.8%、83.6%、85.3%、84.4%,故選擇內(nèi)刃轉(zhuǎn)速4 000、5 000、6 000 r/min為后續(xù)優(yōu)化試驗的考察水平。2.4.2液固比固定內(nèi)刃轉(zhuǎn)速為5 000 r/min、提取時間為60 s,考察不同液固比(6∶1、8∶1、10∶1、12∶1、14∶1)對各指標成分轉(zhuǎn)移率的影響。結(jié)果,綜合評價值分別為72.3%、83.8%、85.6%、83.3%、79.5%。從生產(chǎn)效率及成本考慮,選擇液固比為8∶1、10∶1、12∶1為后續(xù)優(yōu)化試驗的考察水平。
2.4.3 提取時間固定內(nèi)刃轉(zhuǎn)速為5 000 r/min、液固比為10∶1,考察不同提取時間(30、60、90、120、150 s)對各指標成分轉(zhuǎn)移率的影響。結(jié)果,綜合評價值分別為62.3%、83.2%、83.7%、83.1%、80.5%,故選擇提取時間60、90、120 s為后續(xù)優(yōu)化試驗的考察水平。
2.5.1 試驗設(shè)計在單因素試驗的基礎(chǔ)上以內(nèi)刃轉(zhuǎn)速(A)、液固比(B)、提取時間(C)為考察因素,根據(jù)Box-Behnken設(shè)計原理[10-13],每個因素設(shè)3個水平,用代碼值-1、0、1表示。因素與水平見表2。
表2 因素與水平Tab2 Factor and levels
2.5.2 試驗結(jié)果與方差分析根據(jù)Box-Behnken設(shè)計方案,對桂枝茯苓膠囊閃式提取工藝進行試驗。提取所得藥液按“2.1.3”“2.2.3”項下方法制成供試品溶液,按“2.1.1”“2.2.1”項下色譜條件進樣測定,分別計算苦杏仁苷、芍藥苷、沒食子酸、苯甲酸、苯甲酰芍藥苷、肉桂酸轉(zhuǎn)移率,按不同權(quán)重進行綜合評價,試驗結(jié)果見表3。采用Design-Expert 8.0.6軟件對綜合評價數(shù)據(jù)進行回歸方差分析,結(jié)果見表4。
表3 Box-Behnken設(shè)計與結(jié)果Tab3 Box-Behnken design and results
表4 回歸模型方差分析結(jié)果Tab4 Variance analysis result of regression model
表3中,試驗1~12號為析因試驗,13~17號為中心驗證試驗,以估計試驗誤差。對表3中綜合評價數(shù)據(jù)進行二次多元回歸擬合,綜合評價值以Y表示,得回歸方程:Y=84.972 00+1.786 25A+0.608 75B+0.187 50C+0.320 00AB-0.382 50AC+0.047 50BC-1.678 50A2-1.503 50B2-1.616 00C2。
由表4可知,一次項A及二次項A2、B2、C2對提取效果有極顯著性影響;一次項B、C及交互項AB、AC、BC對提取效果無顯著性影響。本試驗?zāi)P偷腜>F且小于0.01,提示模型顯著性較高;而失擬誤差項的P>0.05,提示模型對試驗擬合情況較好,試驗誤差小,可采用此模型對桂枝茯苓膠囊閃式提取效果進行分析和預(yù)測。
利用Design-Expert 8.0.6軟件,根據(jù)回歸方程繪制不同影響因素對響應(yīng)值(綜合評價值)的三維曲線圖[12],響應(yīng)面圖見圖3。
圖3 3個因素與綜合評價值間的響應(yīng)面三維圖Fig3 Three-dimensional response surface of 3 factors and comprehensive evaluation value
根據(jù)Design-Expert 8.0.6軟件及回歸方程等求解得桂枝茯苓膠囊閃式提取最優(yōu)工藝為內(nèi)刃轉(zhuǎn)速5 557 r/min、液固比10.522∶1、提取時間60.15 s,此時綜合評價值的預(yù)測值為85.55%。從設(shè)備及實際可操作性考慮,對該最優(yōu)工藝進行適當(dāng)修正,即設(shè)定內(nèi)刃轉(zhuǎn)速5 600 r/min、液固比10.5∶1、提取時間60 s。
按修正工藝進行3批中試再驗證試驗,每份藥材粗粉量均為1.2 kg。結(jié)果,綜合評價均值為85.40%(RSD=0.51%,n=3),與預(yù)測值結(jié)果幾乎一致,相對誤差為0.15%。這提示建立的綜合評價結(jié)果與內(nèi)刃轉(zhuǎn)速、液固比、提取時間之間關(guān)系的回歸模型是科學(xué)、合理的。驗證試驗結(jié)果見表5。
表5 閃式提取工藝驗證試驗結(jié)果(%%)Tab5 Verification result of flash extraction technology(%%)
為進一步比較桂枝茯苓膠囊閃式提取法與常規(guī)煎煮提取法的提取效果,首先對其煎煮提取工藝進行正交優(yōu)化試驗研究(具體內(nèi)容略),得到優(yōu)化后的煎煮提取工藝,然后按最優(yōu)工藝進行放大驗證試驗(稱取1.2 kg藥材粗粉),在同等條件下比較煎煮提取與閃式提取的提取效果,結(jié)果見表6。
表6 桂枝茯苓膠囊閃式提取與煎煮提取效果比較Tab6 Comparison of effects of flash extraction and decocting extraction for Guizhi fuling capsule
由表6可知,閃式提取所用時間與煎煮提取用時比較大大縮短,溶劑用量也減少一半,且綜合評價值明顯更高。
通過單因素及響應(yīng)面優(yōu)化試驗,確定閃式提取桂枝茯苓膠囊的最優(yōu)工藝為以水為提取溶劑,設(shè)定內(nèi)刃轉(zhuǎn)速5 600 r/min、液固比10.5∶1、提取時間60 s。此優(yōu)化工藝下,桂枝茯苓膠囊中指標成分轉(zhuǎn)移率的綜合評價值達85%左右,提取效果明顯優(yōu)于常規(guī)的煎煮提取。
閃式提取在常溫下即可對中藥中的指標成分進行提取,故能有效保護熱敏性成分,最大限度地保留植物原有成分;提取時間短,數(shù)秒至幾分鐘內(nèi)即可完成,提取速度遠高于傳統(tǒng)方法;且大大降低了能耗,從而降低了生產(chǎn)成本,操作簡便、易行,使用安全可靠[14]。閃式提取法適用于中藥各個部位、多種溶劑、多種成分的提取[3],
是一種具有發(fā)展?jié)摿Φ男滦吞崛〖夹g(shù)。但目前該技術(shù)也有一定局限性,即該技術(shù)尚處在實驗室階段,且大多只針對單味藥材進行研究。本試驗嘗試用該技術(shù)進行了復(fù)方中藥有效成分的提取研究,結(jié)果顯示該技術(shù)在復(fù)方中的應(yīng)用也具有明顯的優(yōu)勢。本研究為其他中藥復(fù)方的提取研究提供了一種新思路、新方法,同時也為閃式提取技術(shù)向產(chǎn)業(yè)化過渡應(yīng)用提供了技術(shù)支持,具有一定的參考意義。
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Optimization of Flash Extraction Technology for Guizhi Fuling Capsule by Box-Behnken Design-response Surface Method
WANG Zhengkuan1,2,3,LIU Yuan1,2,3,SHI Xiaomeng1,2,3,WANG Zhenzhong1,2,3,XIAO Wei1,2,3(1.Kanion Modern Chinese Medicine Research Institute,Jiangsu Kanion Pharmaceutical Co.,Ltd.,Jiangsu Lianyungang 222047,China;2.State Key Laboratory of New-tech for Chinese Medicine Pharmaceutical Process,Jiangsu Lianyungang 222047,China;3.The Key Laboratory for the New-tech Research of TCM Extraction and Purification,Jiangsu Lianyungang 222047,China)
OBJECTIVE:To optimize the flash extraction technology for Guizhi fuling capsule.METHODS:Using blade speed,liquid-solid ratio,extraction time as investigation factors,using the comprehensive evaluation values consisting of transfer rates of gallic acid,paeoniflorin,benzoic acid,cinnamic acid,benzoyl paeoniflorin,amygdalin as investigation index,single factor test was combined with Box-Behnken design-response surface method to optimize the flash extraction technology for Guizhi fuling capsule.Verification test was conducted and compared with conventional decoction extraction method(extracting twice,totally 240 min).RESULTS:The optimal flash extraction technology for Guizhi fuling capsule was using water as extraction solvent with blade speed of 5 600 r/min and liquid-solid ratio of 10.5∶1,extracting for 60 s.The average comprehensive evaluation value of verification test was 85.40%(n=3),with relative error of 0.15%to the predicted value(85.55%),higher than decoction extraction method(72.65%).CONCLUSIONS:Optimized flash extraction technology for Guizhi fuling capsule is efficient and rapid.
Guizhi fuling capsule;Single factor test;Box-Behnken design;Response surface method;Flash extraction;Technology extraction
R284.2
A
1001-0408(2017)31-4429-05
DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2017.31.28
國家“重大新藥創(chuàng)制”科技重大專項——現(xiàn)代中藥創(chuàng)新集群與數(shù)字制藥技術(shù)平臺課題(No.2013ZX09402203)
*高級工程師。研究方向:中藥新技術(shù)、新工藝。電話:0518-81152363。E-mail:wangzk781@126.com
#通信作者:研究員級高級工程師,博士。研究方向:中藥新藥的研究與開發(fā)。電話:0518-81152367。E-mail:Kanionlunwen@163.com
2017-03-27
2017-06-14)
(編輯:劉萍)