熟地黃、山茱萸、茯苓單煎液與合煎液中毛蕊花糖苷、沒食子酸煎出量的變化Δ

楊明明，王慧娜，繆紅，2，張萬紅，趙桂琴，2#（.承德醫(yī)學(xué)院中藥研究所，河北承德067000；2.河北省中藥研究與開發(fā)重點實驗室，河北承德067000；.承德市中醫(yī)院中醫(yī)門診部，河北承德067000）

·實驗研究·

熟地黃、山茱萸、茯苓單煎液與合煎液中毛蕊花糖苷、沒食子酸煎出量的變化Δ

楊明明1＊，王慧娜1，繆紅1，2，張萬紅3，趙桂琴1，2#（1.承德醫(yī)學(xué)院中藥研究所，河北承德067000；2.河北省中藥研究與開發(fā)重點實驗室，河北承德067000；3.承德市中醫(yī)院中醫(yī)門診部，河北承德067000）

目的：考察熟地黃、山茱萸及茯苓單煎液與合煎液中毛蕊花糖苷、沒食子酸煎出量的變化，為深入研究合煎液的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)提供科學(xué)依據(jù)。方法：分別制備熟地黃、山茱萸、茯苓的單煎液、兩兩合煎液及三藥合煎液，采用高效液相色譜法檢測各煎液中熟地黃的有效成分毛蕊花糖苷和山茱萸的有效成分沒食子酸的煎出量，并進(jìn)行比較。結(jié)果：與熟地黃單煎液比較，茯苓+熟地黃合煎液中毛蕊花糖苷煎出量降低（P＜0.01），山茱萸+熟地黃和三藥合煎液中毛蕊花糖苷煎出量升高（P＜0.01）；與山茱萸單煎液比較，各合煎液中沒食子酸煎出量均降低（P＜0.01）。結(jié)論：山茱萸、茯苓與熟地黃合煎時對熟地黃中毛蕊花糖苷的煎出分別具有一定的促進(jìn)、抑制作用；熟地黃、茯苓與山茱萸合煎對山茱萸中沒食子酸的煎出均有一定的抑制作用。推測毛蕊花糖苷可能是合煎液發(fā)揮藥效作用的主要成分之一。

熟地黃；茯苓；山茱萸；合煎；單煎；毛蕊花糖苷；沒食子酸；煎出量

山茱萸、熟地黃及茯苓多以單味或復(fù)方入藥，均有改善學(xué)習(xí)記憶能力的作用[1]。藥理研究表明，熟地黃水提物可增加腦內(nèi)促紅細(xì)胞生成素的表達(dá)并改善衰老大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力[2]；山茱萸多糖可改善血管性癡呆大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力[3]；茯苓水提物能改善化學(xué)藥物所致學(xué)習(xí)記憶障礙小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力[4]。

本課題組前期選取臨床或藥理試驗結(jié)果顯示具有良好增強(qiáng)學(xué)習(xí)記憶能力的幾種藥材，根據(jù)補(bǔ)腎、補(bǔ)肝脾、利水的原則組方并制備成水煎液，通過小鼠水迷宮實驗進(jìn)行活性篩選。實驗結(jié)果表明，熟地黃、山茱萸、茯苓合煎液組與單煎液組及空白對照組比較，合煎液組在增強(qiáng)小鼠學(xué)習(xí)記憶能力方面作用較強(qiáng)。

毛蕊花糖苷為熟地黃中的代表性成分[5]，能明顯改善D-半乳糖所致亞急性衰老模型小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力障礙[6]。山茱萸中的代表性成分為馬錢苷、莫諾苷、沒食子酸等[7]，其中馬錢苷、莫諾苷可通過提高D-半乳糖致衰星形膠質(zhì)細(xì)胞的增殖能力，使衰老細(xì)胞的抗氧化能力增強(qiáng)，從而發(fā)揮抗衰老作用[8]；沒食子酸能夠顯著改善側(cè)腦室注射鏈脲霉素所造成的大鼠記憶障礙[9]。結(jié)合前期藥理實驗結(jié)果，本課題組推測合煎液中毛蕊花糖苷、沒食子酸、馬錢苷及莫諾苷煎出量的變化或許與合煎液藥效的提高有一定關(guān)系。為探討合煎液增強(qiáng)小鼠學(xué)習(xí)記憶作用優(yōu)于單煎液的物質(zhì)基礎(chǔ)，本研究擬對合煎液中的已知活性成分毛蕊花糖苷、沒食子酸的煎出量與其單煎液中的煎出量進(jìn)行比較。

1 材料

1.1 儀器

AG-245電子分析天平（瑞士Mettler-Toledo公司）；1200高效液相色譜儀，包括Chemstation化學(xué)工作站、二極管陣列檢測器（DAD），均來源于美國安捷倫科技有限公司。

1.2 藥材、對照品與試劑

熟地黃（批號：1608001）、山茱萸（批號：1608001）、茯苓（批號：1608003）均購自北京同仁堂承德連鎖藥店有限公司，經(jīng)軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院生藥學(xué)博士李彬鑒定，分別是玄參科地黃（Rehmanniae glutinosa Libosch.）塊根的加工炮制品熟地黃（Rehmanniae radix preparata）、山茱萸科山茱萸（Cornus officinalis Sieb.et Zucc.）的干燥成熟果肉和多孔菌科真菌茯苓[Poria cocos（Schw.）Wolf]的干燥菌核；毛蕊花糖苷對照品（成都普菲德生物技術(shù)有限公司，批號：150401，純度：99.9%）；沒食子酸對照品（北京盈澤納新化工技術(shù)研究院，批號：16022801，純度：99.0%）；水為超純水，乙腈為色譜純，其余試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 浸膏的制備與出膏率的測定

2.1.1 組別設(shè)計試驗共設(shè)7組，分別為單煎液-1組（山茱萸20 g）、單煎液-2組（熟地黃20 g）、單煎液-3組（茯苓20 g）、合煎液-1組（山茱萸、熟地黃、茯苓各20 g）、合煎液-2組（山茱萸、熟地黃各20 g）、合煎液-3組（山茱萸、茯苓各20 g）、合煎液-4組（熟地黃、茯苓各20 g）。

2.1.2 浸膏的制備（1）合煎液-1組：稱取熟地黃20 g、山茱萸20 g、茯苓20 g，置于燒杯中，加10倍量的水浸泡12 h，煎煮45 min后濾過，保留煎液；在藥渣中加入約600 mL水，再煎煮20 min，濾過，保留煎液。參考文獻(xiàn)[10-11]方法，將2次煎液合并且濃縮至150 mL左右，置于蒸發(fā)皿中，在鼓風(fēng)干燥箱中60℃干燥72 h，再置于干燥器中干燥30 min后，迅速精密稱質(zhì)量。（2）其余各組：按各組藥材取量后，參照合煎液-1組方法制備干浸膏。

2.1.3 出膏率的測定將7組煎液按照“2.1.2”項下方法濃縮、干燥、稱質(zhì)量后計算出膏率（%）[浸膏質(zhì)量（g）/原藥材質(zhì)量（g）×100%]。經(jīng)計算，各組出膏率分別為單煎液-1組58.0%、單煎液-2組46.5%、單煎液-3組5.5%、合煎液-1組35.8%、合煎液-2組52.1%、合煎液-3組31.6%、合煎液-4組35.5%。

2.2 毛蕊花糖苷和沒食子酸的含量測定

2.2.1 色譜條件2種成分采用的色譜柱均為ZORBAX Eclipse XDB-Phenyl C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）。（1）毛蕊花糖苷。流動相：乙腈-0.1%醋酸水溶液（17∶83）；流速：1 mL/min；檢測波長：334 nm；柱溫：30℃；進(jìn)樣量：20 μL。（2）沒食子酸。流動相：乙腈-0.3%磷酸水溶液（7∶93）；流速：1 mL/min；檢測波長：240 nm；柱溫：30℃；進(jìn)樣量：10 μL。

2.2.2 對照品溶液的制備分別精密稱定毛蕊花糖苷對照品及沒食子酸對照品適量，分別加入各自的流動相，制備成毛蕊花糖苷、沒食子酸質(zhì)量濃度分別為4.1、11.3 μg/mL的對照品溶液。

2.2.3 毛蕊花糖苷供試品溶液的制備（1）合煎液-1組。參考2015年版《中國藥典》（一部）方法[5]，以1 g熟地黃原藥材為準(zhǔn)，根據(jù)出膏率計算后，精密稱定1.1 g干浸膏于圓底燒瓶中，精密加入甲醇50 mL，稱定質(zhì)量；加熱回流30 min，放冷，再稱定質(zhì)量，用甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過。精密量取續(xù)濾液25 mL，減壓回收至溶劑近干，殘渣用流動相溶解后，將溶液轉(zhuǎn)移至5 mL量瓶中，加流動相至刻度，搖勻，即得。（2）其他組。均以1 g熟地黃原藥材為準(zhǔn)，根據(jù)出膏率計算后，精密稱定一定質(zhì)量干浸膏，參照“2.2.3（1）”項下方法制備。

2.2.4 沒食子酸供試品溶液的制備（1）合煎液-1組。參考文獻(xiàn)[7]方法，以0.2 g山茱萸原藥材為準(zhǔn)，根據(jù)出膏率計算后，精密稱定0.22 g干浸膏置于具塞錐形瓶中，精密加入25 mL的80%甲醇，密塞，稱量；加熱回流1 h，放冷，再稱量，用80%甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過。精密量取續(xù)濾液10 mL，減壓回收至溶劑近干，殘渣用流動相溶解后轉(zhuǎn)移至10 mL量瓶中，加流動相至刻度，搖勻，即得。（2）其他組。均以0.2 g山茱萸原藥材為準(zhǔn)，根據(jù)出膏率計算后，精密稱定一定質(zhì)量干浸膏后，參照“2.2.4（1）”項下方法制備。

2.2.5 測定方法取上述各組供試品溶液及對照品溶液，進(jìn)樣測定；計算煎出量，即每煎1 g熟地黃原藥材所煎出的毛蕊花糖苷量（mg/g）、每煎1 g山茱萸原藥材所煎出的沒食子酸量（mg/g）。

各供試品溶液及對照品溶液的色譜圖見圖1、圖2。

圖1 毛蕊花糖苷高效液相色譜圖Fig1 HPLC chromatograms of verbascoside

圖2 沒食子酸高效液相色譜圖Fig2 HPLC chromatograms of gallic acid

2.2.6 線性關(guān)系考察精密稱定毛蕊花糖苷對照品0.5 mg，置于50 mL量瓶中，加流動相溶解并稀釋至刻度；分別精密量取1、2、3、4、6、8 mL，置于10 mL量瓶中，加流動相稀釋至刻度，搖勻，按上述色譜條件，分別進(jìn)樣20 μL。以峰面積為縱坐標(biāo)（y）、毛蕊花糖苷進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)（x）進(jìn)行線性回歸，得回歸方程為y＝33.946 x－6.821 9（r2＝0.999 5）。結(jié)果表明，毛蕊花糖苷進(jìn)樣量線性范圍為0.000 4～0.003 2 μg。另精密吸取沒食子酸對照品溶液0.5、1、5、10、15、20 μL，進(jìn)樣測定。以峰面積為縱坐標(biāo)（y）、進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)（x）進(jìn)行線性回歸，得回歸方程為y＝1 037.8x+0.376 6（r2＝1.000 0），表明沒食子酸進(jìn)樣量線性范圍為0.005 7～0.226 4 μg。

2.2.7 精密度試驗按相關(guān)方法操作并計算，結(jié)果毛蕊花糖苷與沒食子酸對照品溶液峰面積的RSD分別為1.7%、2.2%（n＝6），表明儀器精密度良好。

2.2.8 重復(fù)性試驗按相關(guān)方法操作并計算，結(jié)果毛蕊花糖苷與沒食子酸煎出量的平均值分別為0.042 7、0.705 6 mg/g，RSD分別為2.5%、1.6%（n＝6），表明方法重復(fù)性良好。

2.2.9 穩(wěn)定性試驗按相關(guān)方法操作，分別將供試品溶液（合煎液-1組）放置0、2、4、8、12、24 h后進(jìn)樣分析并計算，結(jié)果毛蕊花糖苷、沒食子酸峰面積的RSD分別為2.1%、2.2%（n＝6），表明供試品溶液在24 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.2.10 準(zhǔn)確度試驗按相關(guān)方法操作并計算，結(jié)果毛蕊花糖苷、沒食子酸的加樣回收率分別為98.4%～102.5%（平均值為100.2%，RSD＝1.5%，n＝6）、98.7%～102.2%（平均值為100.2%，RSD＝1.4%，n＝6）

2.2.11 樣品測定結(jié)果取“2.1.1”項下7個組樣品，每組6份，按照“2.1.2”“2.2.3”“2.2.4”項下方法分別制備毛蕊花糖苷及沒食子酸供試品溶液。按“2.2.1”項下色譜條件進(jìn)樣檢測，每份均進(jìn)樣2次。結(jié)果，只在含有熟地黃的組中測出毛蕊花糖苷，只在含有山茱萸的組中測出沒食子酸。對煎出量數(shù)據(jù)采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件處理并采用成組t檢驗進(jìn)行分析比較。不同煎液中毛蕊花糖苷、沒食子酸煎出量測定結(jié)果見表1、表2。

結(jié)果表明，各組煎液中的煎出量比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。各組合煎液與熟地黃單煎液比較：山茱萸與熟地黃合煎后，其毛蕊花糖苷煎出量的增加率為23.2%；茯苓與熟地黃合煎后，毛蕊花糖苷煎出量的減少率為2.0%；山茱萸、茯苓與與熟地黃合煎后，毛蕊花糖苷煎出量的增加率為8.9%。各組合煎液與山茱萸單煎液比較：熟地黃與山茱萸合煎后，沒食子酸煎出量的減少率為8.3%；茯苓與山茱萸合煎后，沒食子酸煎出量的減少率為3.5%；熟地黃、茯苓與山茱萸合煎后，沒食子酸煎出量的減少率為9.0%?？梢?，山茱萸對熟地黃中毛蕊花糖苷的煎出具有促進(jìn)作用，而茯苓對熟地黃中毛蕊花糖苷的煎出有一定的抑制作用；熟地黃與茯苓以及山茱萸合煎后均對山茱萸中沒食子酸的煎出有抑制作用。

表1 含熟地黃的各組供試品溶液中毛蕊花糖苷的煎出量測定結(jié)果（±s，n＝6）Tab1 Results of verbascoside decoction amount in test sample solutions containing rehmanniae radix preparata in each group（±s，n＝6）

表1 含熟地黃的各組供試品溶液中毛蕊花糖苷的煎出量測定結(jié)果（±s，n＝6）Tab1 Results of verbascoside decoction amount in test sample solutions containing rehmanniae radix preparata in each group（±s，n＝6）

注：與單煎液-2組比較，＊＊P＜0.01；“+”表示增加，“-”表示減少Note：vs.single decoction-2 group，＊＊P＜0.01；“+”means increase，“-”means decrease

與單煎液-2組比較煎出量增加/減少率，%+（8.9±3.8）+（23.2±4.2）-（2.0±1.9）組別單煎液-2組合煎液-1組合煎液-2組合煎液-4組煎出量，mg/g 0.039 2±0.000 5 0.042 7±0.000 9＊＊0.048 3±0.001 0＊＊0.038 4±0.000 2＊＊

表2 含山茱萸的各組供試品溶液中沒食子酸的煎出量測定結(jié)果（±s，n＝6）Tab2 Results of gallic acid decoction amount in test sample solutions containing corni fructus in each group（±s，n＝6）

表2 含山茱萸的各組供試品溶液中沒食子酸的煎出量測定結(jié)果（±s，n＝6）Tab2 Results of gallic acid decoction amount in test sample solutions containing corni fructus in each group（±s，n＝6）

注：與單煎液-1組比較，＊＊P＜0.01；“-”表示減少Note：vs.single decoction-1 group，＊＊P＜0.01；“-”means decrease

組別單煎液-1組合煎液-1組合煎液-2組合煎液-3組與單煎液-1組比較煎出量增加/減少率，%-（9.0±0.2）-（8.3±0.3）-（3.5±0.3）煎出量，mg/g 0.775 5±0.001 3 0.705 6±0.000 7＊＊0.711 5±0.000 9＊＊0.748 2±0.001 1＊＊

3 討論

本文探討了山茱萸、熟地黃、茯苓合煎液中毛蕊花糖苷和沒食子酸煎出量的變化。結(jié)果表明，山茱萸對熟地黃中毛蕊花糖苷的煎出具有一定的促進(jìn)作用，茯苓對熟地黃中毛蕊花糖苷的煎出具有一定的抑制作用；熟地黃和茯苓對山茱萸中沒食子酸的煎出均有一定的抑制作用。毛蕊花糖苷在三藥合煎液中的煎出量與熟地黃單煎液比較，煎出量增加；沒食子酸在三藥合煎液中的煎出量與山茱萸單煎液比較，煎出量降低。結(jié)合前期藥理實驗結(jié)果，筆者推測合煎液中毛蕊花糖苷煎出量的增加可能是合煎液藥效優(yōu)于熟地黃單煎液的原因之一；也可能是在合煎過程中，產(chǎn)生了某些新的藥效成分，或者可能是毛蕊花糖苷、沒食子酸與合煎液中的其他藥效成分含量達(dá)到一個合適的水平，從而顯示出更好的藥效[12]。從圖1、圖2中還可以發(fā)現(xiàn)，各供試品溶液中部分峰的高度也存在一定差異，提示合煎使不同組分的煎出量發(fā)生了變化，這很可能也是合煎液與單煎液藥效差異的原因之一。

不同藥材中的成分差異很大，故各煎液的出膏率差異也可能較大。本試驗中，茯苓單煎液的出膏率只有5.5%，與其他組差異過大。經(jīng)過查閱文獻(xiàn)[13]可知，因為茯苓中含有93%以上的茯苓多糖，而茯苓多糖難溶于水，當(dāng)茯苓用水煎煮后，不溶于水的茯苓多糖會被當(dāng)作藥渣除去，故茯苓單煎液的出膏率很低。

有文獻(xiàn)報道茯苓中含有茯苓酸，并對其含量進(jìn)行了高效液相色譜分析[14]。故本課題組在前期試驗中除了對毛蕊花糖苷及沒食子酸的煎出量進(jìn)行檢測外，還對茯苓酸的煎出量也進(jìn)行了檢測。在茯苓單煎液中檢測到茯苓酸，煎出量為20.83 μg/g，但在合煎液中卻未檢測到茯苓酸。可能的原因有兩個：一是在合煎液中茯苓酸煎出量較低，無法測出；二是可能在合煎過程中茯苓酸發(fā)生了化學(xué)反應(yīng)，轉(zhuǎn)化生成了其他物質(zhì)。

考慮到合煎液中各待測成分的干燥溫度與損失率的關(guān)系，如合煎液中已知成分梓醇在干燥溫度50～60℃時的損失率最低[10]，故在出膏率測定部分本課題組將《中國藥典》中浸出物測定法的方法“水浴上蒸干后，于105℃干燥3 h[11]”，調(diào)整為“直接在鼓風(fēng)干燥箱中60℃干燥72 h”。在測定沒食子酸含量時，本課題組最初選擇80%甲醇作為對照品及供試品的溶劑，但進(jìn)樣后色譜峰峰形異常（出現(xiàn)前沿及重疊峰），難以進(jìn)行煎出量測定。于是將溶解溶劑改為流動相[乙腈-0.3%磷酸水溶液（7∶93）]后再進(jìn)樣檢測，色譜峰前沿及重疊峰消失，峰形正常，可以進(jìn)行正常檢測。筆者分析，這可能與沒食子酸的溶解性及特殊結(jié)構(gòu)有關(guān)。

綜上，本文的相關(guān)研究成果為后續(xù)熟地黃、山茱萸、茯苓合煎液藥效成分的分離純化及活性評價奠定了基礎(chǔ)，也為深入闡明三藥合煎液的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)提供了科學(xué)依據(jù)。

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Decoction Amount Changes of Verbascoside and Gallic Acid in Single Decoction and Combined Decoction of Rehmanniae Radix Preparata，Corni Fructus and Poria

YANG Mingming1，WANG Huina1，MIAO Hong1，2，ZHANG Wanhong3，ZHAO Guiqin1，2（1.Institute of Chinese Mateia Medica，Chengde Medical College，Hebei Chengde 067000，China；2.Hebei Key Laboratory of Research and Development for TCM，Hebei Chengde 067000，China；3.Chengde Hospital of TCM Outpatient Department of Chinese Medicine，Hebei Chengde 067000，China）

OBJECTIVE：To investigate the decoction amount changes of verbascoside，gallic acid in single decoction and combined decoction of rehmanniae radix preparata，corni fructus and poria，and provide scientific basis for further study of effective substance basis.METHODS：The single decoction，combined decoction with each 2 medicine and combined decoction with the 3 medicines of rehmanniae radix preparata，corni fructus and poria，were respectively prepared.HPLC was adopted to detect and compare the decoction amount of active component verbascoside in rehmanniae radix preparata and active component gallic acid in corni fructus in each group.RESULTS：Compared with single decoction of rehmanniae radix preparata，the decoction amount of verbascoside was decreased in combined decoction of poria+rehmanniae radix preparata（P＜0.01），decoction amount of verbascoside was increased in combined decoction of corni fructus+rehmanniae radix preparata or combined decoction with the 3 medicines（P＜0.01）.Compared with single decoction of corni fructus，the decoction amount of gallic acid in each combined decoction was decreased（P＜0.01）.CON

CLUSIONS：The combined decoction of rehmanniae radix preparata，corni fructus and poria has certain promotion and inhibition effects on the decoction of verbascoside in rehmanniae radix preparata and inhibition effect on the decoction of gallic acid in corni fructus.It is speculated verbascoside may be one of the main components in combined decoction playing the role of effectiveness.

Rehmanniae radix preparata；Poria；Corni fructus；Combined decoction；Single decoction；Verbascoside；Gallic acid；Decoction amount

R283

A

1001-0408（2017）31-4350-05

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2017.31.08

國家科技支撐計劃項目（No.2011BAI07B04）；河北省教育廳項目（No.ZD2016061）；河北省中醫(yī)藥管理局項目（No.2015034）；河北省高校重點學(xué)科建設(shè)項目（No.冀教高〔2013〕4號）

＊碩士研究生。研究方向：中草藥活性成分的分離純化及含量測定。E-mail：yangminming92@sina.com

#通信作者：教授，博士。研究方向：天然活性產(chǎn)物。E-mail：zhaoguiqin1971@sina.com

2017-03-13

2017-05-06）

（編輯：劉萍）