Wnt10a/Wnt10b及其Wnt/β—catenin通路在子宮內(nèi)膜癌患者中的作用機(jī)制研究

盧宇青

【摘要】 目的：觀察Wnt10a/Wnt10b及其Wnt/β-catenin通路在子宮內(nèi)膜癌患者中的表達(dá)及作用機(jī)制。方法：選取2015年1月-2016年7月醫(yī)院收治子宮內(nèi)膜癌患者102例，均經(jīng)過(guò)病理確診，設(shè)為觀察組，其中95例雌激素依賴(lài)型子宮內(nèi)膜癌，7例非雌激素依賴(lài)型子宮內(nèi)膜癌。選取同期入院子宮內(nèi)膜增生疾病診斷患者48例，設(shè)為對(duì)照組。入院后采集相關(guān)標(biāo)本，制作組織芯片，采用免疫組化SP法檢測(cè)兩組Wnt10a/Wnt10b表達(dá)水平，采用Western-blot法檢測(cè)不同組織標(biāo)本關(guān)鍵蛋白的表達(dá)含量。結(jié)果：觀察組中Wnt10a及Wnt10b陽(yáng)性表達(dá)率，高于對(duì)照組（P<0.05）；觀察組中雌激素依賴(lài)型子宮內(nèi)膜癌Wnt10a陽(yáng)性率，高于非雌激素依賴(lài)型子宮內(nèi)膜癌（P<0.05）；觀察組中雌激素依賴(lài)型子宮內(nèi)膜癌Wnt10b陽(yáng)性率，低于非雌激素依賴(lài)型子宮內(nèi)膜癌（P<0.05）；Wnt10a在觀察組中呈陽(yáng)性表達(dá)，組織排列無(wú)規(guī)律性，在對(duì)照組中呈陰性表達(dá)，組織排列相對(duì)整齊。Wnt10b在觀察組中多呈陽(yáng)性表達(dá)，組織排列缺乏規(guī)律性，對(duì)照組中呈陰性表達(dá)，組織排列相對(duì)整齊。Western-blot法結(jié)果顯示，子宮內(nèi)膜癌患者中，Wnt10b表達(dá)水平增加，并且β-catenin及c-myc表達(dá)均得到增加，APC表達(dá)下降。結(jié)論：Wnt10a/Wnt10b在子宮內(nèi)膜癌發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮了重要作用，其機(jī)理與經(jīng)典Wnt/β-catenin信號(hào)傳導(dǎo)通路激活有關(guān)。

【關(guān)鍵詞】 Wnt10a/Wnt10b； Wnt/β-catenin通路； 子宮內(nèi)膜癌； 表達(dá)； 作用機(jī)制

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2017.19.007

子宮內(nèi)膜癌（EC）是原發(fā)于子宮內(nèi)膜的上皮性惡性腫瘤，是女性生殖器三大惡性腫瘤之一，好發(fā)于58～61歲人群中，隨著人口老齡化的日益加劇，導(dǎo)致EC發(fā)生率呈現(xiàn)上升及年輕化趨勢(shì)[1]。有關(guān)報(bào)道顯示，EC發(fā)生率占女性癌癥總數(shù)的20.0%～30.0%，其發(fā)生率已經(jīng)超過(guò)宮頸癌發(fā)生率[2-3]。臨床上，根據(jù)發(fā)病原因?qū)C分為雌激素依賴(lài)型（Ⅰ型，占85.0%）和非雌激素依賴(lài)型（Ⅱ型）。目前，臨床上對(duì)于EC發(fā)病機(jī)制尚不完全知曉，多與肥胖、持續(xù)性雌激素刺激、高血壓及糖尿病有關(guān)。文獻(xiàn)[4-5]報(bào)道顯示，Wnt基因及經(jīng)典傳導(dǎo)通路在結(jié)直腸癌、胃癌、乳腺癌、宮頸癌中發(fā)揮了重要的作用，該通路中關(guān)鍵蛋白β-catenin的失活突變?cè)贓C中約占10.0%～45.0%，但是其作用機(jī)制尚存在較大的爭(zhēng)議。為了探討Wnt10a/Wnt10b及其Wnt/β-catenin通路在子宮內(nèi)膜癌患者中的表達(dá)及作用機(jī)制，選取2015年1月-2016年7月本院收治子宮內(nèi)膜癌患者102例，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2015年1月-2016年7月本院收治子宮內(nèi)膜癌患者102例，其中95例雌激素依賴(lài)型子宮內(nèi)膜癌，7例非雌激素依賴(lài)型子宮內(nèi)膜癌；年齡35～78歲，平均（58.5±4.1）歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）符合子宮內(nèi)膜癌臨床診斷標(biāo)準(zhǔn)[6-7]；（2）均經(jīng)過(guò)生化指標(biāo)、影像學(xué)檢查及組織形態(tài)學(xué)檢查得到確診；（3）均伴有不同程度的陰道不規(guī)則出血、下腹痛、月經(jīng)紊亂等；（4）本課題均經(jīng)過(guò)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)同意，自愿簽署知情同意書(shū)。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）不符合子宮內(nèi)膜癌臨床診斷標(biāo)準(zhǔn)者；（2）資料不全或難以配合治療者；（3）合并心、肝、腎功能異常者。選取同期入院子宮內(nèi)膜增生疾病診斷患者48例，設(shè)為對(duì)照組，年齡34～79歲，平均（59.1±4.4）歲。兩組患者的年齡比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。

1.2 方法 入院后采集相關(guān)標(biāo)本，制作組織芯片，采用免疫組化SP法檢測(cè)兩組Wnt10a/Wnt10b表達(dá)水平；采用Western-blot法檢測(cè)不同組織標(biāo)本W(wǎng)nt/β-catenin信號(hào)通路關(guān)鍵蛋白的表達(dá)含量。（1）組織芯片制備：取兩組手術(shù)病理切除組織，對(duì)蠟塊的HE切片做鏡下形態(tài)學(xué)觀察，圈出EC組織及非EC組織的形態(tài)學(xué)特點(diǎn)的位置，在蠟塊上確定取樣的部位，利用組織芯片打孔儀對(duì)蠟塊穿取組織芯[8]。（2）Wnt10a/Wnt10b表達(dá)水平：將組織芯片蠟塊以3 μm連續(xù)切片，將獲得的標(biāo)本完整切片進(jìn)行常規(guī)HE染色，然后采用免疫組化SP法檢測(cè)兩組Wnt10a/Wnt10b表達(dá)水平，將芯片內(nèi)不同類(lèi)型組織作為內(nèi)對(duì)照，以磷酸鹽緩沖液代替一抗作為陰性對(duì)照，相關(guān)操作步驟必須嚴(yán)格遵循儀器、試劑盒操作說(shuō)明進(jìn)行[9-10]。（3）Wnt/β-catenin信號(hào)通路關(guān)鍵蛋白表達(dá)：采用Western-blot法檢測(cè)不同組織標(biāo)本關(guān)鍵蛋白的表達(dá)含量，取上述采集的標(biāo)本組織，根據(jù)50體積BCA試劑A試劑B配制BCA工作液，充分混勻。完全溶解BSA蛋白標(biāo)準(zhǔn)品，取10 μL稀釋到100 μL，控制最終濃度為0.5 mg/mL。將標(biāo)準(zhǔn)品根據(jù)0、1、2、4、8、12、16 μL加入到96孔板中，向每孔中加入200 μL BCA工作液，37℃下進(jìn)行30 min放置，采用酶標(biāo)儀測(cè)定波長(zhǎng)在592 nm下的吸光度值。將上述標(biāo)本采用SDS-聚丙烯酰胺蛋白經(jīng)過(guò)制膠、上樣、電泳，制備半干式電轉(zhuǎn)膜，將其放入封閉液中，采用TBST進(jìn)行3次沖洗，5 min/次，采用封閉液稀釋一抗，放入4 ℃下孵育過(guò)夜，搖床上輕微振動(dòng)。利用封閉液稀釋辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記二抗IgG，混合在1 mL雙蒸餾水中，使之完全覆蓋PVDF膜，在暗室內(nèi)曝光、顯影、定影[11-12]。

1.3 結(jié)果判定 采用PBS液置換一抗作為陰性對(duì)照，采用Wnt10a染色已知結(jié)腸癌組織切片作為陽(yáng)性對(duì)照，Wnt10b采用已知陽(yáng)性乳腺癌組織作為陽(yáng)性對(duì)照[13]。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 使用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行處理，計(jì)量資料采用（x±s）表示，比較行t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料采用率（%）表示，比較采用檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果endprint

2.1 兩組Wnt10a及Wnt10b表達(dá)情況比較 觀察組中Wnt10a及Wnt10b陽(yáng)性表達(dá)率，高于對(duì)照組（P<0.05）；觀察組中雌激素依賴(lài)型子宮內(nèi)膜癌Wnt10a陽(yáng)性率，高于非雌激素依賴(lài)型子宮內(nèi)膜癌（P<0.05）；觀察組中雌激素依賴(lài)型子宮內(nèi)膜癌Wnt10b陽(yáng)性率，低于非雌激素依賴(lài)型子宮內(nèi)膜癌（P<0.05），見(jiàn)表1。

2.2 Wnt10a及Wnt10b在兩組中的表達(dá)情況 采用免疫組織化學(xué)SP法測(cè)定Wnt10a及Wnt10b在兩組中的表達(dá)，Wnt10a在觀察組中呈陽(yáng)性表達(dá)，組織排列無(wú)規(guī)律性，在對(duì)照組中呈陰性表達(dá)，組織排列相對(duì)整齊。Wnt10b在觀察組中多呈陽(yáng)性表達(dá)，組織排列缺乏規(guī)律性，對(duì)照組中呈陰性表達(dá)，組織排列相對(duì)整齊，見(jiàn)圖1。

2.3 Wnt/β-catenin通路在子宮內(nèi)膜癌患者中的表達(dá) 通過(guò)采用Western-blot法檢測(cè)不同組織標(biāo)本關(guān)鍵蛋白的表達(dá)含量，結(jié)果顯示：子宮內(nèi)膜癌患者中，Wnt10b表達(dá)水平增加，并且β-catenin及c-myc表達(dá)均得到增加，APC表達(dá)下降，見(jiàn)圖2。

3 討論

子宮內(nèi)膜癌（EC）是臨床上常見(jiàn)的惡性腫瘤，患者發(fā)病早期臨床癥狀缺乏特異性，多數(shù)患者一旦確診已經(jīng)是中、晚期，從而錯(cuò)過(guò)了最佳治療時(shí)機(jī)[14]。文獻(xiàn)[15-16]報(bào)道顯示：Wnt10a/Wnt10b及Wnt/β-catenin信號(hào)傳導(dǎo)在EC的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)，能促進(jìn)腫瘤的發(fā)生，但是其具體機(jī)制尚存在較大的爭(zhēng)議。Wnt基因最早由國(guó)外學(xué)者在1982年發(fā)現(xiàn)并報(bào)道，是小鼠乳腺癌中克隆出的一種原癌基因，能在細(xì)胞間傳遞增殖分化信號(hào)的蛋白質(zhì)，成為Int基因。Wnt10a/Wnt10b均為Wnt基因家族中比較重要的成員，其傳代信號(hào)能引起細(xì)胞內(nèi)β-catenin水平升高并進(jìn)入核內(nèi)，通過(guò)與TCF結(jié)合，調(diào)節(jié)相關(guān)靶基因控制其轉(zhuǎn)錄和表達(dá)，從而影響細(xì)胞的增殖和凋亡，通過(guò)這種途徑能激活細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通路。文獻(xiàn)[16]報(bào)道顯示，Wnt信號(hào)蛋白在多種惡性腫瘤中表達(dá)增高。Wnt10a在胃癌和結(jié)直腸癌的研究相對(duì)較多，而在子宮內(nèi)膜癌的表達(dá)研究較少，多與腫瘤的直徑、浸潤(rùn)深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、分化程度及5年生存率有關(guān)。從本課題研究結(jié)果看出：Wnt10a在子宮內(nèi)膜癌發(fā)生中能發(fā)揮一定的作用，并且Wnt10b在正常子宮內(nèi)膜到異常增生子宮內(nèi)膜直到癌變子宮內(nèi)膜均具有較高的陽(yáng)性表達(dá)率，提示W(wǎng)nt10b能促進(jìn)子宮內(nèi)膜的發(fā)生及發(fā)展[17]。本研究中，觀察組Wnt10a及Wnt10b陽(yáng)性表達(dá)率，高于對(duì)照組（P<0.05）；觀察組中雌激素依賴(lài)型EC Wnt10a陽(yáng)性率，高于非雌激素依賴(lài)型EC（P<0.05）；觀察組中雌激素依賴(lài)型EC Wnt10b陽(yáng)性率，低于非雌激素依賴(lài)型子宮內(nèi)膜癌（P<0.05）。

EC被認(rèn)為是一種雌激素依賴(lài)性腫瘤，其發(fā)生于發(fā)展和Wnt信號(hào)傳統(tǒng)通路之間可能屬于是一種無(wú)抵抗雌激素導(dǎo)致Ⅰ型EC的機(jī)制之一。Wnt10a/Wnt10b及其Wnt/β-catenin通路通過(guò)促進(jìn)Wnt基因及蛋白的表達(dá)，能進(jìn)一步提高Wnt信號(hào)傳導(dǎo)通路的活化，有助于靶基因關(guān)鍵蛋白水平的提高，從而能促進(jìn)子宮內(nèi)膜組織的惡性轉(zhuǎn)化[18]。β-catenin通路最初是作為細(xì)胞黏附分子被人們認(rèn)識(shí)的，因近年發(fā)現(xiàn)其在Wnt/β-catenin信號(hào)傳導(dǎo)通路及某些腫瘤的發(fā)生中具有重要的作用而廣泛受到關(guān)注。從大的角度來(lái)說(shuō)，β-catenin是由CTNNB1基因編碼，主要定位于染色體3P21、3P22中，該因子具有16個(gè)外顯子，全長(zhǎng)2312Kb，分子量為92-95KD，含有781個(gè)氨基酸。β-catenin蛋白主要是通過(guò)結(jié)合型與游離型的方式存在于細(xì)胞漿中，能與Ecadherin相互作用，并且能直接將細(xì)胞外粘附因子與胞質(zhì)內(nèi)的細(xì)胞骨架相互結(jié)合，從而在細(xì)胞膜表面形成復(fù)合體，有助于維持上皮細(xì)胞極性和完整性。同時(shí)，游離的β-catenin能與GSK3β，APC和Axin形成復(fù)合物，復(fù)合物中的β-catenin可以被磷酸化，從而被蛋白酶體降解。有關(guān)研究顯示，β-catenin是經(jīng)典Wnt/β-catenin信號(hào)通路的下游中相對(duì)重要的蛋白之一，在Wnt信號(hào)通路中發(fā)揮了重要的作用，通過(guò)β-catenin核內(nèi)水平的增加能引起一系列轉(zhuǎn)錄基因活性的增強(qiáng)，誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生惡性病變。有關(guān)研究顯示，Wnt/β-catenin在肝癌、食管癌、結(jié)直腸癌、胰腺癌及EC中均具有異常表現(xiàn)，并且其異常表達(dá)與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展關(guān)系密切。本研究中，通過(guò)采用Western-blot法檢測(cè)不同組織標(biāo)本關(guān)鍵蛋白的表達(dá)含量，結(jié)果顯示EC患者中，Wnt10b表達(dá)水平增加，并且β-catenin及c-myc表達(dá)均得到增加，APC表達(dá)下降。由此看出：Wnt10a/Wnt10b及其Wnt/β-catenin通路在EC患者中參與雌激素水平的調(diào)節(jié)，促進(jìn)腫瘤的發(fā)生及發(fā)展。

綜上所述，Wnt10a/Wnt10b在EC發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮了重要作用，其機(jī)理與經(jīng)典Wnt/β-catenin信號(hào)傳導(dǎo)通路激活有關(guān)，能促進(jìn)β-catenin表達(dá)水平，促進(jìn)子宮內(nèi)膜癌發(fā)生及發(fā)展。

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（收稿日期：2017-02-14） （本文編輯：周亞杰）endprint