肝細胞癌組織中Claudin-3、MMP-2表達觀察

李娟，胡曉松，周方方，李帥

(1成都醫(yī)學院基礎醫(yī)學院，成都610083；2川北醫(yī)學院基礎醫(yī)學院)

肝細胞癌組織中Claudin-3、MMP-2表達觀察

李娟1，胡曉松1，周方方2，李帥1

(1成都醫(yī)學院基礎醫(yī)學院，成都610083；2川北醫(yī)學院基礎醫(yī)學院)

目的觀察肝細胞癌(HCC)組織中緊密連接蛋白3(Claudin-3)、MMP-2的表達變化，并探討其臨床意義。方法采用免疫組化法檢測46例HCC組織及相應癌旁正常肝組織中的Claudin-3、MMP-2。分析Claudin-3、MMP-2表達與HCC臨床病理參數(shù)的關系。通過GeneMANIA數(shù)據(jù)庫分析Claudin-3、MMP-2基因之間的相互作用。結果與癌旁正常肝組織相比，HCC組織中Claudin-3陽性表達率降低，MMP-2陽性表達率升高(P均<0.05)。Ⅲ+Ⅳ期HCC組織中Claudin-3陽性表達率低于Ⅰ+Ⅱ期組織，MMP-2陽性表達率高于Ⅰ+Ⅱ期組織(P均<0.05)。HCC組織中Claudin-3、MMP-2表達呈負相關關系(r=-0.874，P<0.01)。GeneMANIA數(shù)據(jù)庫分析結果顯示，Claudin-3、MMP-2基因之間有較多的物理相互作用，有一定程度的共表達、共定位現(xiàn)象。結論HCC組織中Claudin-3陽性表達減少，MMP-2陽性表達增高，Claudin-3低表達、MMP-2過表達可能與HCC的發(fā)生、發(fā)展有關，且Claudin-3、MMP-2基因之間存在相互作用。

肝細胞癌；緊密連接蛋白3；基質(zhì)金屬蛋白酶2

原發(fā)性肝癌約占所有惡性腫瘤的7%，發(fā)病率和病死率均較高[1]。肝細胞癌(HCC)為起源于肝細胞的惡性腫瘤，為原發(fā)性肝癌中最常見的類型，占70%～90%[2]。HCC起病隱匿，多數(shù)患者確診時已達中晚期，失去了手術根治機會，預后極差。目前肝癌患者術后5年生存率僅為30%左右，這主要與HCC的高侵襲性和高轉(zhuǎn)移率密切相關[3]。因此，對肝癌患者病情及預后進行評估十分重要。通常，腫瘤細胞合成和分泌蛋白酶降解基膜和細胞外基質(zhì)是浸潤轉(zhuǎn)移發(fā)生的首要前提?；|(zhì)金屬蛋白酶2(MMP-2)可降解細胞外基質(zhì)和基底膜，促進腫瘤細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移[4]。緊密連接蛋白3(Claudin-3)是上皮細胞及內(nèi)皮細胞緊密連接的重要組分，其表達變化與腫瘤的生物學行為密切相關[5]。本研究觀察了HCC組織中Claudin-3、MMP-2的表達變化，探討二者在HCC發(fā)生、發(fā)展中的作用，現(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 組織標本 選取2013年9月～2014年7月成都醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院及成都軍區(qū)總醫(yī)院普外科手術切除的標本，并經(jīng)病理診斷證實的HCC組織及其相應的癌旁肝組織存檔蠟塊46例份。標本來源患者中，男32例、女14例，年齡39～71歲，肝癌低分化(Ⅲ/Ⅳ級)24例、中分化(Ⅱ級)15例、高分化(Ⅰ級)7例，所有患者術前均未行放療、化療或免疫治療等。Claudin-3兔抗人多克隆抗體、MMP-2鼠抗人單克隆抗體購自武漢三鷹生物科技有限公司，二步法免疫組化試劑盒購于北京中杉金橋生物技術公司。

1.2 Claudin-3、MMP-2檢測 將HCC組織和癌旁正常肝組織標本常規(guī)脫蠟水化，組織抗原微波修復，10%山羊血清封閉。Claudin-3抗體工作濃度為1∶100，MMP-2抗體的工作濃度為1∶50。免疫組化染色Envision二步法按說明書進行，DAB-H2O2顯微鏡下顯色，蘇木精復染，常規(guī)脫水中性樹膠封固。使用PBS代替一抗處理的切片作為陰性對照，已知陽性組織切片作為陽性對照。結果判定標準：在鏡下(200×)隨機觀察切片中的5個組織視野，無陽性細胞計0分、陽性細胞比例<1/3計1分、1/3～2/3計2分、>2/3計3分；根據(jù)陽性細胞的著色強度，無著色、黃色、棕黃色和棕褐色分別計0、1、2、3 分；上述兩項得分相加，≥3分判定為Claudin-3、MMP-2陽性。

1.3 Claudin-3、MMP-2基因相互作用分析 進入GeneMANIA數(shù)據(jù)庫，選擇“人”(Homo sapiens)，輸入檢測基因Claudin-3和MMP-2，點擊“GO”按鈕顯示分析結果并打印分析報告。

1.4 統(tǒng)計學方法 采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析。計數(shù)資料采用χ2檢驗。相關性分析采用Spearman相關分析法。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 Claudin-3、MMP-2表達變化及其與HCC臨床病理參數(shù)的關系 免疫組化染色Claudin-3陽性表達主要位于細胞膜與細胞質(zhì)內(nèi)，MMP-2陽性表達位于細胞質(zhì)。肝癌結節(jié)及癌旁組織均可見兩種蛋白表達。HCC組織與癌旁正常肝組織中Claudin-3陽性表達例數(shù)分別為11例(23.9%)、36例(78.3%)，MMP-2陽性表達例數(shù)分別為32例(69.6%)、20例(43.5%)。與癌旁正常肝組織相比，HCC組織中Claudin-3陽性表達率降低，MMP-2陽性表達率升高(P均<0.05)。Ⅲ+Ⅳ期HCC組織中Claudin-3陽性表達率低于Ⅰ+Ⅱ期組織，MMP-2陽性表達率高于Ⅰ+Ⅱ期組織(P均<0.05)。Claudin-3、MMP-2表達與年齡、性別、腫瘤分化程度無關(P均>0.05)。詳見表1。

表1 Claudin-3、MMP-2表達與HCC臨床病理參數(shù)的關系

2.2 HCC組織中Claudin-3與MMP-2表達的關系 Spearman相關分析結果顯示，HCC組織中Claudin-3、MMP-2表達呈負相關關系(r=-0.874，P<0.01)。

2.3 Claudin-3、MMP-2基因的相互作用 Claudin-3、MMP-2基因之間有較多的物理相互作用(67.64%)，有一定程度的共表達(13.5%)、共定位(6.17%)現(xiàn)象。Claudin-3、MMP2基因與TJP1、Claudin-5、TIMP4、TJP3、INADL、HBEGF、CCL7、LCN2、TJP2、TJP3、LPAR1、TIMP2、TIMP3、THBS2、Claudin-4、NOX3、IGFALS、IGFBP3、NOX1、MMP14共20個基因存在直接或間接的相互作用，包括信號通路、遺傳性/基因相互作用、共享蛋白結構域等途徑形成復雜的分子調(diào)控網(wǎng)絡。

3 討論

在我國，由于受乙型肝炎、丙型肝炎高發(fā)等因素影響，肝癌已成為第二常見的惡性腫瘤[6]。由于HCC發(fā)病年齡較小、腫瘤低分化比例高，HCC侵襲能力強，復發(fā)率和病死率均較高[7]。HCC患者的5年生存率只有7%，有癥狀的患者生存時間則很少超過1年[8]。腫瘤的復發(fā)和侵襲、轉(zhuǎn)移被認為是導致HCC患者長期生存率較低的根本原因[9]。

腫瘤細胞間的黏附力下降或喪失可致細胞連接破壞，與腫瘤細胞的浸潤和轉(zhuǎn)移過程密切相關。Claudin-3屬于Claudins蛋白家族，是影響緊密連接功能的關鍵蛋白之一，具有維持上皮細胞極性、保護上皮細胞及內(nèi)皮細胞屏障功能、調(diào)節(jié)細胞間物質(zhì)流動、調(diào)節(jié)細胞旁物質(zhì)選擇滲透性和細胞極化等作用[10]。近來研究發(fā)現(xiàn)，鋅指轉(zhuǎn)錄因子(SNAIL)、表皮生長因子(EGF)等信號分子參與調(diào)節(jié)Claudin-3的基因表達，而Claudin-3蛋白的異常表達與多種惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展有著密切關系[11]。大量研究表明，Claudin-3在乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌、胃癌等腫瘤中表達增多，而在非小細胞肺癌(NSCLC)、食管癌、結直腸癌等腫瘤中表達減少[12]。本研究結果顯示，HCC組織中Claudin-3的陽性表達率較癌旁正常肝組織明顯下降，并與腫瘤的臨床分期有關，該結果與Bodnar等[13]的報道一致，表明Claudin-3影響了HCC的細胞穩(wěn)定性及腫瘤的演進過程。

研究[14]表明，上皮-間充質(zhì)細胞轉(zhuǎn)化(EMT)是上皮細胞來源的惡性腫瘤細胞獲得遷移和侵襲能力的重要生物學環(huán)節(jié)，其核心過程是腫瘤細胞喪失上皮表型(如細胞黏附分子表達減少、極性消失)，而逐漸獲得間充質(zhì)細胞表型及生物學特性(如細胞骨架由角蛋白轉(zhuǎn)化為波形蛋白，遷移及促血管形成能力增強)。MMPs是一類具有降解細胞外基質(zhì)的依賴Ca2+、Zn2+的內(nèi)源性蛋白酶家族，其活性受TIMP調(diào)節(jié)[15]。MMP-2是MMPs家族中的重要一員，可通過降解腫瘤細胞周圍的細胞外基質(zhì)促進腫瘤細胞向深層間質(zhì)局部浸潤[16]，即EMT過程。此外，MMP-2也可通過降解淋巴管和血管的基底膜，為腫瘤細胞的淋巴結轉(zhuǎn)移及血行轉(zhuǎn)移創(chuàng)造條件[14]。本研究發(fā)現(xiàn)HCC組織中MMP-2的陽性表達率明顯高于癌旁正常肝組織，與Wang等[17]的報道相符。另外，我們還發(fā)現(xiàn)MMP-2在HCC中晚期表達明顯升高，提示MMP-2的高表達促進了肝癌細胞的EMT過程及浸潤，但MMP-2的高表達與HCC的分化程度無關。新近研究發(fā)現(xiàn)，MMP-2在HCC中表達增加可能與PI3K/Akt[18]、EGFR/ERK[19]等信號通路的激活有關。

GeneMANIA數(shù)據(jù)庫可利用功能相關數(shù)據(jù)如共定位數(shù)據(jù)、信號通路、共表達信息、蛋白和基因的相互作用及蛋白結構區(qū)域的相似性等對一系列基因進行相關性分析和預測，顯示基因之間的相互關系[20]。本研究結果顯示，Claudin-3、MMP-2基因存在較為密切的相互關系，并通過與TJP1、Claudin-5、TIMP4等20個基因形成復雜的分子調(diào)控網(wǎng)絡，影響著腫瘤細胞的生物學行為。相關性分析結果也顯示，HCC組織中Claudin-3、MMP-2表達呈負相關關系，由此我們推測肝癌組織中MMP-2表達上調(diào)可能導致Claudin-3表達下調(diào)，腫瘤細胞上皮表型逐漸丟失，促進腫瘤的EMT過程及肝癌細胞的浸潤。由于Claudin-3在許多腫瘤組織中存在差異表達，而對其與細胞內(nèi)外其他物質(zhì)之間的相互作用等目前仍未明了，深入研究Claudin-3的功能及其機制，明確Claudin-3與疾病之間的關系，具有重要意義。

[1] Ouyang JJ, He WJ, Zheng KX, et al. Impact of an information leaflet on knowledge of hepatocellular carcinoma and hepatitis b among Chinese youth[J]. Asian Pac J Cancer Prev, 2016,17(1):439-443.

[2] Torre LA, Bray F, Siegel RL, et al. Global cancer statistics, 2012[J]. CA Cancer J Clin, 2015,65(2):87-108.

[3] Bosetti C, Turati F, La Vecchia C. Hepatocellular carcinoma epidemiology[J]. Best Pract Res Clin Gastroenterol, 2014,28(5):753-770.

[4] Yan W, Chen J, Chen Z, et al. Deregulated miR-296/S100A4 axis promotes tumor invasion by inducing epithelial-mesenchymal transition in human ovarian cancer[J]. Am J Cancer Res, 2016,6(2): 260-269.

[5] Ionescu Popescu C, Liliac L, Ceausu RA, et al. CLDN3 expression and significance-breast carcinoma versus ovarian carcinoma[J]. Rom J Morphol Embryol, 2013,54(1): 99-106.

[6] Tanaka M, Katayama F, Kato H, et al. Hepatitis B and C virus infection and hepatocellular carcinoma in China: a review of epidemiology and control measures[J]. J Epidemiol, 2011,21(6):401-416.

[7] Omata M, Cheng AL, Kokudo N, et al. Asia-Pacific clinical practice guidelines on the management of hepatocellular carcinoma: a 2017 update [J]. Hepatol Int, 2017,11(4):317-370.

[8] Pascual P, Herrera I, Irurzun J. New advances in hepatocellular carcinoma[J]. World J Hepatol, 2016,8(9): 421-438.

[9] She WH, Chok KSH. Strategies to increase the resectability of hepatocellular carcinoma[J]. World J Hepatol, 2015,7(18):2147-2154.

[10] Liu F, Koval M, Ranganathan S, et al. Systems proteomics view of the endogenous human claudin protein family[J]. J Proteome Res, 2016,15(2):339-359.

[11] Jiang L, Yang YD, Fu L, et al. CLDN3 inhibits cancer aggressiveness via Wnt-EMT signaling and is a potential prognostic biomarker for hepatocellular carcinoma[J]. Oncotarget, 2014,5(17):7663-7676.

[12] 馮璐,胡曉松,李娟.緊密連接蛋白-3與腫瘤[J].華西醫(yī)學,2015,30(12):2360-2363.

[13] Bodnar M, Szylberg L, Kazmierczak W, et al. Tumor progression driven by pathways activating matrix metalloproteinases and their inhibitors[J]. Oncotarget, 2014,5(20):10170-10179.

[14] Tania M, Khan MA, Fu J. Epithelial to mesenchymal transition inducing transcription factors and metastatic cancer[J]. Tumour Biol, 2014,35(8):7335-7342.

[15] Sani IK, Marashi SH, Kalalinia F. Solamargine inhibits migration and invasion of human hepatocellular carcinoma cells through down-regulation of matrix metalloproteinases 2 and 9 expression and activity[J]. Toxicol In Vitro, 2015,29(5):893-900.

[16] Ren T, Zhu L, Cheng M. CXCL10 accelerates EMT and metastasis by MMP-2 in hepatocellular carcinoma[J]. Am J Transl Res, 2017,9(6):2824-2837.

[17] Wang B, Ding YM, Fan P, et al. Expression and significance of MMP2 and HIF-1α in hepatocellular carcinoma[J]. Oncol Lett, 2014,8(2):539-546.

[18] Ding P, Zhang X, Jin S, et al. CD147 functions as the signaling receptor for extracellular divalent copper in hepatocellular carcinoma cells[J]. Oncotarget, 2017,8(31):51151-51163.

[19] Wu D, Li M, Tian W, et al. Hydrogen sulfide acts as a double-edged sword in human hepatocellular carcinoma cells through EGFR/ERK/MMP-2 and PTEN/AKT signaling pathways[J]. Sci Rep, 2017,7(1):5134.

[20] 蔣沂峰,楊希,陳龍.小鼠上下頜骨發(fā)育差異性表達基因的生物信息學分析[J].口腔頜面外科雜志,2014,24(6):418-424.

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.39.013

R363.2；R735.7

B

1002-266X(2017)39-0045-03

成都醫(yī)學院自然科學研究項目(CYZ12-018)。

2017-06-09)