LoxP-Cre重組技術(shù)在構(gòu)建馬鈴薯光呼吸代謝支路中的應(yīng)用

姚振

(長江大學(xué)園藝園林學(xué)院，湖北荊州434025 華南農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院分子植物生理實驗室，廣東廣州510640)

沈博然，彭新湘

(華南農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院分子植物生理實驗室，廣東 廣州 510640)

LoxP-Cre重組技術(shù)在構(gòu)建馬鈴薯光呼吸代謝支路中的應(yīng)用

姚振

(長江大學(xué)園藝園林學(xué)院，湖北荊州434025 華南農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院分子植物生理實驗室，廣東廣州510640)

沈博然，彭新湘

(華南農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院分子植物生理實驗室，廣東 廣州 510640)

利用LoxP-Cre同源重組原理，以表達盒堆積的方式組合光呼吸代謝支路改造基因AtGDH、EcGCL和EcTSR，成功構(gòu)建了多基因轉(zhuǎn)化載體pYL-GCL-GDH-TSR，通過根癌農(nóng)桿菌侵染以及潮霉素篩選，獲得了馬鈴薯轉(zhuǎn)化植株。分子檢測表明，轉(zhuǎn)基因植株中3個目的基因在mRNA水平均能得到表達，但在蛋白水平無表達。轉(zhuǎn)基因植株在表型和微型薯的發(fā)育上與野生型植株無明顯區(qū)別，可能原因是由于多基因一次性轉(zhuǎn)化與葉綠體定位的雙重要求，增加了馬鈴薯遺傳轉(zhuǎn)化及蛋白有效表達的難度。

馬鈴薯；多基因轉(zhuǎn)化；光呼吸

在C3植物中，通過構(gòu)建光呼吸代謝支路以增加碳同化效率，從而提高生物量，這些支路包括Kebeish支路[1]、Maier支路[2]和Carvalho支路[3]。Nolke等[4]采用融合蛋白技術(shù)在馬鈴薯中表達的大腸桿菌GDH的3個亞基實質(zhì)上仍是屬于Kebeish支路。光呼吸代謝改造通常需要將2～4個基因引入葉綠體并協(xié)調(diào)表達。多基因轉(zhuǎn)化可以采用組合轉(zhuǎn)化、雜交、逐步轉(zhuǎn)化、質(zhì)體轉(zhuǎn)化等技術(shù)，這些技術(shù)的使用受限于植物的遺傳轉(zhuǎn)化體系、繁殖方式、工作量以及植物生長周期等條件。

馬鈴薯(SolanumtuberosumL.)是茄科茄屬一年生草本，其塊莖可供食用，是重要的糧食、蔬菜和新興的能源作物。馬鈴薯的人類可食用部分高達85%，相比之下谷類作物大約為50%，馬鈴薯富含碳水化合物，使其成為良好的熱能來源。2011年，完成了馬鈴薯全基因組測序和分析[5]。破譯馬鈴薯基因組序列，對于科學(xué)家們從分子水平上了解馬鈴薯的生長、發(fā)育及繁殖過程具有重要的意義。該項研究同時表明栽培種經(jīng)歷了多次淘汰選擇，造成基因庫狹窄。馬鈴薯的遺傳轉(zhuǎn)化一直是研究熱點，多基因轉(zhuǎn)化載體特別是光呼吸改造的多基因轉(zhuǎn)化載體對馬鈴薯的遺傳轉(zhuǎn)化體系的影響具有很大的未知性。

在光呼吸代謝支路構(gòu)建過程中，引入代謝乙醇酸的酶是關(guān)鍵步驟。細菌的乙醇酸脫氫酶含有D、E、F 3個亞基，由3個基因編碼，在Kebeish等[1]和Nolke等[4]的研究中分別以二次轉(zhuǎn)化和融合蛋白的方式表達了細菌的乙醇酸脫氫酶。Maier等[2]的研究中，在采用植物的乙醇酸氧化酶的同時，引入了細菌的過氧化氫酶以分解過氧化氫。有報道[6]指出，AtGDH(GI：30681516)編碼擬南芥的D-乳糖脫氫酶，該酶同時具有乙醛酸脫氫酶的活性。

本研究利用華南農(nóng)業(yè)大學(xué)劉耀光研究員提供的LoxP-Cre多基因組裝系統(tǒng)構(gòu)建多基因表達載體[7]，一次性將光呼吸改造需要的3個基因乳糖脫氫酶基因AtGDH、乙醛酸聚醛酶基因EcGCL(GI：49175990)和羥基丙二酸半醛還原酶基因EcTSR(GI：49175990)，以表達盒堆積(Cassette stacking)的方式導(dǎo)入馬鈴薯基因組，并對轉(zhuǎn)基因植株的基因表達及表型進行分析。

1 材料與方法

1.1多基因轉(zhuǎn)化載體的構(gòu)建

多基因轉(zhuǎn)化載體由2個供體載體pDonor1、pDonor2和1個受體載體pYL1305組成。供體質(zhì)粒和受體質(zhì)粒共轉(zhuǎn)攜帶重組酶基因的NS3529菌株，挑選發(fā)生重組的受體質(zhì)粒，基于LoxP-Cre重組的原理將目標(biāo)基因的表達盒逐步添加到受體載體。大腸桿菌乙醛酸聚醛酶基因(EcGCL)和水稻rbcS葉綠體定位信號肽基因序列RTPC(141bp，編碼47個氨基酸)連接直接連入pYL1305替換載體骨架的GUS基因；擬南芥乙醇酸脫氫酶基因(AtGDH)和RTPC連接到二元載體pOX(華南農(nóng)業(yè)大學(xué)劉耀光研究員贈送、提供ubi啟動子和終止子)，然后表達盒連入pDonor1；羥基丙二酸半醛還原酶基因(EcTSR)和RTPC連入載體pCactF(提供Actin啟動子和終止子)，然后表達盒連入pDonor2。供受體質(zhì)粒通過進行2輪重組構(gòu)建目標(biāo)載體pYL-GCL-GDH-TSR(圖1)。

注：35S-HPT——35S啟動子驅(qū)動的潮霉素抗性基因； 35S-GUS——35S啟動子驅(qū)動的綠色熒光蛋白GUS；LoxP、1L、2L、1R、2R——重組位點；I-Sce I、PI-Sce I——歸位內(nèi)切酶識別位點；TSR——大腸桿菌羥基丙二酸半醛還原酶EcTSR；AtGDH——擬南芥乙醇酸脫氫酶AtGDH；GCL——大腸桿菌乙醛酸聚醛酶EcGCL。圖1 多基因表達載體及目標(biāo)載體質(zhì)粒圖譜

1.2馬鈴薯的試管薯誘導(dǎo)

轉(zhuǎn)化品種為‘鄂馬鈴薯三號’，采用種薯建立無菌體系。試管苗莖段培養(yǎng)20d后，苗高3～6cm時，將試管苗再切段轉(zhuǎn)至試管薯誘導(dǎo)培養(yǎng)基(MS培養(yǎng)基添加80g/L的蔗糖，添加2g/L活性碳)，在光周期(光照8h、黑暗16h)，溫度周期(光照20℃、黑暗18℃)的條件下誘導(dǎo)試管薯。誘導(dǎo)約8～10周后，采收試管薯進行遺傳轉(zhuǎn)化。

1.3馬鈴薯的遺傳轉(zhuǎn)化

將準備好的質(zhì)粒轉(zhuǎn)入根癌農(nóng)桿菌菌株LBA4404，準備浸染菌液。試管薯切片厚度約1～2mm，侵染10min，將切片吸干浸染液轉(zhuǎn)入P1培養(yǎng)基(MS培養(yǎng)基，添加6-BA 0.5mg/L+ZT 2.0mg/L+GA30.2mg/L+IAA 1.0mg/L)。將浸染后的材料暗培養(yǎng)48h，轉(zhuǎn)入P1培養(yǎng)基(添加400mg/L頭孢霉素、潮霉素)上進行分化篩選培養(yǎng)。轉(zhuǎn)化30d以后，待薯片表面分化出幼芽，將生長1～2cm的幼芽剪下，轉(zhuǎn)移到MS培養(yǎng)基(添加200mg/L頭孢霉素、篩選劑潮霉素)進行生根篩選。通過試管薯切片作為外植體轉(zhuǎn)化，采用了2、4、6、8、10、12mg/L潮霉素篩選濃度進行預(yù)實驗，并最終采用2mg/L的潮霉素進行篩選。通過篩選獲得的再生植株轉(zhuǎn)入含有10mg/L潮霉素的MS培養(yǎng)基進行生根篩選，最后轉(zhuǎn)入泥炭土定植，觀察生長發(fā)育情況并采收微型薯。

1.4馬鈴薯陽性植株分子水平的檢測

檢測引物見表1。提取馬鈴薯植株總RNA的提取并反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA。cDNA純度的檢測采用馬鈴薯RbcS基因，有基因組DNA污染的樣品可以擴增到約500bp的片段，馬鈴薯的cDNA只能擴增到約140bp的片段。轉(zhuǎn)錄水平檢測以馬鈴薯的細胞延長因子(Ef-1)作為內(nèi)參。轉(zhuǎn)基因株系和野生型株系取葉片提取蛋白。定量后的樣品等蛋白量上樣電泳，采用EcTSR、EcGCL、AtGDH蛋白相應(yīng)的抗體進行Western blot分析。

表1 馬鈴薯轉(zhuǎn)基因植株分子檢測的引物

2 結(jié)果與分析

2.13個目標(biāo)基因的表達盒成功構(gòu)建到多基因表達載體

圖2 pYL-GCL-GDH-TSR構(gòu)建過程的酶切鑒定

通過兩輪的重組以及一次酶切連接，3個基因的表達盒成功連接到受體載體。兩個供體載體pDonor1、pDonor2在多克隆位點的兩端設(shè)計有限制性內(nèi)切酶NotI的識別位點，通過重組接入受體載體的表達盒可以通過NotI酶切檢測。從圖2可以看出，第1輪接入AtLDH表達盒和第2輪接入的TSR表達盒均在相應(yīng)大小的位置出現(xiàn)了條帶，表明二者均順利接入了受體載體。通過測序分析，認為目標(biāo)載體沒有出現(xiàn)錯配和序列丟失，3個目標(biāo)基因的表達盒成功構(gòu)建到多基因表達載體。

2.2馬鈴薯試管薯外植體潮霉素篩選體系的建立與轉(zhuǎn)基因植株的獲得

潮霉素通過抑制植物蛋白質(zhì)的合成，進而影響植物的生理代謝。在誘導(dǎo)再生的培養(yǎng)基中添加1mg/L的潮霉素，經(jīng)過農(nóng)桿菌浸染的試管薯切片接觸培養(yǎng)基的一面邊緣出現(xiàn)發(fā)黑，隨著篩選時間的延長，切片大量死亡。在2mg/L潮霉素濃度以上的篩選壓力下，試管薯切片可以在不接觸培養(yǎng)基的另一側(cè)產(chǎn)生少量愈傷組織，但是這些愈傷組織不會分化，繼續(xù)篩選后，這些試管薯切片逐漸褐化死亡，但這個階段持續(xù)的時間很長。馬鈴薯試管薯切片在篩選培養(yǎng)基再生的芽有4種情況(圖3)，從試管薯切片不接觸培養(yǎng)基的一側(cè)直接分化的再生芽占很小比例。此外，相對于生根階段，馬鈴薯在愈傷組織的分化階段對潮霉素敏感程度較高。

2.3轉(zhuǎn)基因馬鈴薯材料的分子檢測

在獲得馬鈴薯的轉(zhuǎn)化陽性株系中，選擇株系PGLT進行分子檢測。在DNA水平，篩選基因HPT和目標(biāo)基因EcGCL、EcTSR、AtGDH均能在PGLT株系中檢測到，而野生型無法擴增到相應(yīng)的條帶。擴增條帶的大小符合預(yù)計長度，并和陽性CK擴增長度相同(圖4 A、B、C、D)。在RNA水平，PGLT和野生型植株的cDNA中，采用35個循環(huán)擴增，沒有擴增到含有內(nèi)含子的條帶(圖4 E)，表明cDNA中沒有基因組DNA的污染。通過半定量RT-PCR檢測，可以檢測到篩選基因HPT和3個目標(biāo)基因EcGCL、EcTSR、AtGDH的正常轉(zhuǎn)錄(圖4 F、G、H、I)。

2.4轉(zhuǎn)基因馬鈴薯株系的表型

轉(zhuǎn)基因植株P(guān)GLT表現(xiàn)為潮霉素抗性(圖5A)，說明潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶可以正常表達蛋白并表現(xiàn)潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶活性。試管苗經(jīng)過快速繁殖，移栽到蛭石后，存活并生長發(fā)育良好，將幼苗移栽到泥炭土基質(zhì)后，轉(zhuǎn)基因植株和野生型均能正常的生長，在約90d后，采收到微型薯(圖5B)。整個移栽體系可以滿足馬鈴薯遺傳轉(zhuǎn)化的需要。經(jīng)過兩代的種植，轉(zhuǎn)基因植株相對于野生型沒有明顯差異。轉(zhuǎn)基因株系的微型薯偏小，但差異不顯著(圖5C)。

3 討論

3.1潮霉素可以用作馬鈴薯遺傳轉(zhuǎn)化的篩選劑，但效率較低

在馬鈴薯的遺傳轉(zhuǎn)化中，既可用葉片、葉柄、莖段為外植體，通過愈傷組織途徑建立再生體系，也可以試管薯、微型薯、薯塊為外植體，建立直接分化再生轉(zhuǎn)化系統(tǒng)[8～11]。本研究在預(yù)實驗階段發(fā)現(xiàn)莖段的再生體系極不穩(wěn)定，葉片浸染的操作難度較大，最終放棄了采用莖段和葉片作為外植體進行遺傳轉(zhuǎn)化，改為采用試管薯作為外植體進行遺傳轉(zhuǎn)化。

在多基因轉(zhuǎn)化的方法中，可以采用進行逐步轉(zhuǎn)化，但是需要2個以上的篩選標(biāo)記。潮霉素和卡那霉素是植物遺傳轉(zhuǎn)化中兩種常用的篩選劑，但是一般認為單子葉植物如水稻一般使用潮霉素作為篩選劑。采用試管薯切片作為外植體，卡那霉素作為篩選劑可以取得較好的效果[12～14]。本研究采用潮霉素作為篩選劑，發(fā)現(xiàn)馬鈴薯試管薯切片再生階段對其極為敏感，采用2mg/L的篩選壓力仍然較高，這與馬鈴薯生根階段10mg/L的篩選壓力以及塊莖作為外植體再生的篩選壓力相比有很大的差別[15]。如果降低篩選壓力，就會造成大量的芽再生，一方面增加篩選的難度，另一方面由于轉(zhuǎn)化苗具有代謝上的負擔(dān)，從而競爭不過非轉(zhuǎn)化苗，最終造成篩選失敗。

圖4 馬鈴薯轉(zhuǎn)基因株系PGLT的PCR檢測

圖5 馬鈴薯野生型和轉(zhuǎn)基因株系試管苗移栽與微型薯

潮霉素可以用作馬鈴薯遺傳轉(zhuǎn)化的篩選劑，但效率沒有卡那霉素作為篩選劑的高。馬鈴薯的多基因轉(zhuǎn)化中，潮霉素篩選體系的低效率使逐步轉(zhuǎn)化法難以實現(xiàn)。另一方面，由于馬鈴薯使用無性繁殖，并且馬鈴薯是四倍體，不能采用雜交的方法進行多基因轉(zhuǎn)化。因此，在馬鈴薯的多基因遺傳轉(zhuǎn)化中，如果將多基因轉(zhuǎn)化載體改造為卡那霉素抗性，然后進行多基因的組裝，可能會具有更高的轉(zhuǎn)化效率。

3.2多基因一次性轉(zhuǎn)化與葉綠體定位的雙重要求增加了蛋白有效表達的難度

在本研究中，通過多基因表達載體成功地在RNA水平表達了抗性篩選標(biāo)記基因和3個目標(biāo)基因。但是在馬鈴薯轉(zhuǎn)基因株系的蛋白檢測中，3個目標(biāo)基因均沒有檢測到蛋白水平的表達。經(jīng)過2代的種植，轉(zhuǎn)基因植株表型與野生型植株也沒有出現(xiàn)明顯表型差異。出現(xiàn)上述情況，可能有以下2方面的原因。

第一，在植物的葉綠體中構(gòu)建一個新的代謝步驟，基因表達量的不協(xié)調(diào)，會造成中間產(chǎn)物的積累，以致對葉綠體造成毒害。采用表達盒堆積法在植物中進行多基因表達，表達的不協(xié)調(diào)將更加明顯，這與啟動子的使用、表達盒的位置、表達盒的方向均有關(guān)系[16～18]。在Kebeish等[1]的研究中，通過逐步轉(zhuǎn)化以及利用雜交的方法轉(zhuǎn)入了5個基因。在本研究中，采用擬南芥的AtGDH將乙醇酸轉(zhuǎn)化為乙醛酸，而細菌的乙醇酸代謝途徑中的乙醇酸脫氫酶含有3個亞基，這樣做減少了需要轉(zhuǎn)入基因的數(shù)目，減輕了遺傳轉(zhuǎn)化的壓力。然而，如果AtGDH的表達量過高，而GCL和TSR基因表達量較低，可能會導(dǎo)致乙醛酸在葉綠體中積累。要解決上述問題，必須在啟動子的使用、表達盒的位置方向安排上進行調(diào)整，同時，也需要大量的轉(zhuǎn)化株系進行篩選。

第二，目的基因的葉綠體定位異常。細胞核編碼的蛋白質(zhì)需要運輸?shù)饺~綠體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、液泡等細胞器發(fā)揮作用，在蛋白質(zhì)的各級結(jié)構(gòu)中，有部分氨基酸用來編碼蛋白質(zhì)定位信號。質(zhì)體定位的蛋白質(zhì)出現(xiàn)定位信號肽是質(zhì)體進化上的關(guān)鍵步驟[19]。定位信號肽的出現(xiàn)是一個漫長的進化過程，物種之間、蛋白之間的定位信號肽會存在極大差異。傳統(tǒng)觀點認為，由核編碼的質(zhì)體蛋白其N端的信號肽包含有其定位及切割的全部信息[20]。定位外源蛋白在研究中應(yīng)用的比較多的是馬鈴薯rbcs的小亞基葉綠體定位信號肽。此外，番茄、水稻，擬南芥的葉綠體定位信號肽也是比較常用的信號肽[21～23]。Lee等[20]對擬南芥的208種葉綠體定位信號肽序列進行了聚類分析發(fā)現(xiàn)，這些定位序列可以分為多個序列亞群，對其中的7個序列亞群進行實驗發(fā)現(xiàn)，定位序列具有高度的特異性；蛋白的定位實驗表明，每種蛋白包含了嚴格的葉綠體定位序列區(qū)。該研究認為，信號肽是由多個包含了特異序列的序列亞群組成的。本研究中，使用水稻rbcS的葉綠體定位信號肽在馬鈴薯中定位3個目標(biāo)蛋白，目標(biāo)蛋白在RNA表達量極高的情況下沒有在蛋白水平檢測到表達，這可能是由于不同物種的不同蛋白對葉綠體定位信號肽具有特異性而造成的。

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2017-04-17

國家自然科學(xué)基金項目(31470343)；長江大學(xué)青年基金項目(2015cqn83)。

姚振(1980-)，男，博士，講師，研究方向為植物學(xué)和植物生理學(xué)。通信作者: 彭新湘，xpeng@scau.edu.cn。

[引著格式]姚振,沈博然，彭新湘.LoxP-Cre重組技術(shù)在構(gòu)建馬鈴薯光呼吸代謝支路中的應(yīng)用[J].長江大學(xué)學(xué)報(自科版)，2017,14(18)：37～43.

Q945.19

A

1673-1409(2017)18-0037-07

[編輯] 李啟棟