樹蝴蝶多糖的理化性質(zhì)和抗氧化活性研究

耿佳歡，申超群，董 芳，陳 健

（華南理工大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，廣東 廣州 510640）

樹蝴蝶多糖的理化性質(zhì)和抗氧化活性研究

耿佳歡，申超群，董 芳，陳 健*

（華南理工大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，廣東 廣州 510640）

以樹蝴蝶為原料，通過響應(yīng)面分析獲得超聲輔助提取的最佳工藝。粗多糖通過脫色，除蛋白和DEAE-52柱層析得到LKY-I、LKY-II、LKY-III 3種純化多糖；通過GPC結(jié)合SephadexG-100鑒定其分子質(zhì)量及純度，利用I2-KI、苯酚-硫酸、考馬斯亮藍(lán)G-250、硫酸-咔唑法測(cè)定其理化性質(zhì)；通過測(cè)定DPPH、ABTS+自由基清除率及還原力評(píng)價(jià)LKY-I、LKY-II、LKY-III的抗氧化能力。根據(jù)響應(yīng)面分析，得到多糖提取最佳工藝為：功率80 W、時(shí)間15 min、液料比25∶1，此時(shí)得率為 4.39%。 LKY-I、LKY-II、LKY-III分子質(zhì)量分別為 61 598、122 495、697 243u； 總糖含量分別為88.91%、74.05%、59.18%；糖醛酸含量分別為：13.21%、15.12%、16.02%；蛋白含量分別為0.13%、0.46%、0.91%；3種多糖不含可溶性淀粉和核酸。研究表明，多糖樣品在0.25～10 mg/mL范圍內(nèi)均具有較強(qiáng)的抗氧化活性，說明樹蝴蝶純化多糖具有一定的抗氧化活性。

樹蝴蝶；多糖；理化性質(zhì)；抗氧化活性

0 引言

地衣是由藻類和真菌共同形成的共生復(fù)合體，是一種獨(dú)特的植物資源，廣泛存在于大自然中，豐富的地衣型真菌以及其復(fù)雜多樣的活性成分是天然產(chǎn)物目前的研究熱點(diǎn)[1-2]。地衣多糖及異地衣多糖是地衣特有的主要出生代謝產(chǎn)物，研究表明，地衣多糖具有較強(qiáng)的抗氧化活性及抗腫瘤活性，并且能增強(qiáng)機(jī)體的免疫能力。樹蝴蝶作為地衣資源，廣泛分布在陜西省內(nèi)，藥食兩用，在民間已有多年的歷史，但至今對(duì)于樹蝴蝶多糖的研究較少，且不夠系統(tǒng)。

本課題組擬通過對(duì)樹蝴蝶多糖進(jìn)行提取、分離純化，并且對(duì)純化多糖的理化性質(zhì)和抗氧化活性進(jìn)行全面研究，為樹蝴蝶多糖的開發(fā)利用做好前期的基礎(chǔ)研究工作。樹蝴蝶又稱為老龍皮、老龍七、肺衣、癩肚皮、石花等[3]，是一種典型的地衣型真菌。靳菊情等[4]對(duì)老龍皮多糖的初級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行研究，結(jié)果表明老龍皮多糖主要是通過α（l-4）、α（1-6）糖苷鍵連接的雜多糖。王曉梅等[5]研究發(fā)現(xiàn)，老龍皮粗多糖和總皂苷具有較強(qiáng)的還原能力和OH·清除能力。張紅等[6]通過對(duì)老龍皮多糖提純分離，獲得5個(gè)組分，并進(jìn)一步對(duì)含量較高的兩個(gè)組分進(jìn)行分離，確定其單糖組成。地衣多糖的抗氧化活性具有開發(fā)為藥物的潛力，但是對(duì)于樹蝴蝶多糖的理化性質(zhì)和抗氧化活性的相關(guān)研究較少，為深入開發(fā)這一藥用資源，作者對(duì)樹蝴蝶多糖進(jìn)行優(yōu)化提取、分離純化，得到 LKY-I、LKY-Ⅱ及LKY-Ⅲ3種純化多糖。

本文主要研究了以超聲提取和熱水浸提結(jié)合的方式優(yōu)化提取樹蝴蝶多糖。在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用響應(yīng)面分析優(yōu)化了多糖的最佳提取工藝，并通過GPC結(jié)合葡聚糖凝膠SephadexG-100鑒定其分子質(zhì)量及純度，同時(shí)測(cè)定了3種純化多糖LKY-I、LKY-Ⅱ及LKY-Ⅲ的總糖、蛋白質(zhì)、糖醛酸和淀粉含量，通過體外清除DPPH、ABTS+自由基以及還原力測(cè)定評(píng)價(jià)了其抗氧化活性，為開發(fā)利用這一藥用資源提供了有用的信息和數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

樹蝴蝶購(gòu)買于廣州市清平藥材市場(chǎng)，由廣東藥科大學(xué)藥科學(xué)院王定勇教授鑒定。

DPPH、牛血清白蛋白、考馬斯亮藍(lán)、半乳糖醛酸、 葡聚糖標(biāo)品（5 200、 11 600、 23 800、 48 600、148 000、273 000、410 000、668 000 u）： 美國(guó) Sigma公司；D354FD樹脂：廣州廣聯(lián)津化化工有限公司；剛果紅、正丁醇、氯仿、苯酚、硫酸、水楊酸、FeSO4·7H2O、鐵氰化鉀、無水乙醇均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

722-P型可見分光光度計(jì)：上海天翔儀器有限公司；KQ5200DE超聲波清洗機(jī)：昆山市超聲儀器有限公司；1525型高效液相色譜儀：美國(guó)Waters公司；UV1800紫外可見分光光度計(jì)：上海元析儀器有限公司；掃描電子顯微鏡（Carl Zeiss Jena GmbH-EVO 18）：德國(guó)卡爾·蔡司有限公司。

1.3 方法

1.3.1 樹蝴蝶粗多糖的超聲輔助熱水浸提工藝優(yōu)化

準(zhǔn)確稱取5.000 g樹蝴蝶粉末，放入100 mL錐形瓶中，加入一定比例蒸餾水，按照設(shè)定的各種條件（超聲功率、超聲時(shí)間、液料比）進(jìn)行超聲處理，然后80℃恒溫水浴3 h，過濾，取上清液，采用苯酚-硫酸法測(cè)定多糖含量，單因素試驗(yàn)條件見表1。在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，結(jié)合Box-Benhnken中心組合設(shè)計(jì)原理，選取最優(yōu)水平為試驗(yàn)的零水平，設(shè)計(jì)三因素三水平的回歸試驗(yàn)，因素編碼見表2，以超聲功率、超聲時(shí)間和液料比為主要參考因子，確定超聲輔助提取樹蝴蝶多糖的最佳工藝參數(shù)。

表1 單因素試驗(yàn)水平Table 1 Factors and levels of single factor experiment

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)因素編碼值Table 2 Factors and levels of the response surface design

1.3.2 樹蝴蝶多糖的制備與純化

樹蝴蝶→粉碎過60目篩→最佳工藝條件下提取→抽濾、減壓濃縮→D354FD樹脂脫色→醇沉→離心（4 000 r/min，10 min）→烘干→蒸餾水復(fù)溶→Sevage法脫蛋白→醇沉、離心→50℃烘干(得樹蝴蝶粗多糖)→樣品溶解→DEAE-52離子交換柱層析→蒸餾水、0.1 mol/L NaCl、0.3 mol/L NaCl洗脫液洗脫→收集組分→減壓濃縮、透析、冷凍干燥→得到LKY-I、LKY-Ⅱ及 LKY-Ⅲ 3種組分。

1.3.3 樹蝴蝶純化多糖的分子質(zhì)量測(cè)定及純度鑒定[7]

采用凝膠滲透色譜（Gel Permeation Chromatography，GPC） 法測(cè)定樹蝴蝶純化多糖LKY-I、LKY-Ⅱ及 LKY-Ⅲ的分子質(zhì)量分布，色譜條件為TSK G-5000 PWXL column （7.8×300 mm） 和 TSK G-3000 PWXL column（7.8×300 mm）串聯(lián)，流動(dòng)相為0.02 mol/L的KH2PO4緩沖溶液，流速為0.6 mL/min，Waters 2414示差檢測(cè)器，柱溫35℃，運(yùn)行時(shí)間為45 min。同時(shí)采用GPC與SephadexG-100柱層析結(jié)合的方法判定樹蝴蝶精制多糖的純度。

1.3.4 樹蝴蝶純化多糖的理化性質(zhì)測(cè)定

紫外掃描：稱取樹蝴蝶純化多糖LKY-I、LKY-Ⅱ及 LKY-Ⅲ各5 mg，將其配制成1 mg/mL的多糖溶液，以蒸餾水為對(duì)照，于190～500 nm處掃描。

總糖含量測(cè)定：采用苯酚-酸法。淀粉的測(cè)定：采用碘-碘化鉀法[9]。糖醛酸的測(cè)定：采用硫酸-咔唑法[10]。蛋白質(zhì)含量的測(cè)定：采用考馬斯亮藍(lán)G-250 法[11]。

1.3.5 樹蝴蝶純化多糖的掃描電鏡分析

取樹蝴蝶純化多糖LLKY-I、LKY-Ⅱ及 LKY-Ⅲ樣品少許黏著于樣品臺(tái)上，置于真空噴鍍儀內(nèi)鍍上導(dǎo)電層，采用掃描電子顯微鏡觀察其表面形貌，加速電壓為10 kV。

1.3.6 樹蝴蝶純化多糖的抗氧化活性測(cè)定

1.3.6.1 DPPH自由基清除能力測(cè)定[12]

依次加 20 μL 不同質(zhì)量濃度（0.25、0.50、1、2、4、6、8、10 mg/mL） 的 樹 蝴 蝶 純 化 多 糖 LKY-I、LKY-Ⅱ及 LKY-Ⅲ溶液和 180 μL 的 150 μmol/L DPPH溶液于96孔板中，517 nm處測(cè)吸光度值，空白對(duì)照組及陽(yáng)性對(duì)照組分別用蒸餾水及Vc代替。DPPH·清除率（C）的計(jì)算公式如下：

式中：A0為空白對(duì)照孔的吸光度；A1為樣品孔的吸光度。

1.3.6.2 ABTS法測(cè)總抗氧化能力[13]

將7 mmol/L的 ABTS水溶液及4.9 mmol/L的過硫酸鉀水溶液按1∶1體積混合，得到ABTS母液，并將其用無水乙醇稀釋至0.262 6 mmol/L。向96孔板中加入不同質(zhì)量濃度的樹蝴蝶純化多糖LKY-I、LKY-Ⅱ及 LKY-Ⅲ 20 μL， 然后加入 180 μL的ABTS工作液，37℃避光振蕩，反應(yīng)6 min后在734 nm處測(cè)定吸光度值?？瞻讓?duì)照組及陽(yáng)性對(duì)照組分別用蒸餾水及Vc代替。ABTS自由基清除率（S）的計(jì)算公式如下：

式中：A0為空白對(duì)照孔的吸光度；A1為樣品孔的吸光度。

1.3.6.3 還原能力的測(cè)定[14]

FeSO4標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制：于96孔板中依次加入不同濃度的 FeSO4標(biāo)準(zhǔn)溶液（0、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mmol/L）20 μL， 再加入 180 μL 的 0.83 mmol/L的TPTZ工作液，37℃避光振蕩反應(yīng) 10 min后，在最大吸收波長(zhǎng)595 nm處測(cè)定吸光度值，以FeSO4的物質(zhì)的量為橫坐標(biāo)，吸光度值為縱坐標(biāo)，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。于96孔板中加不同質(zhì)量濃度的樹蝴蝶純化多糖樣品溶液20 μL，再依次加入180 μL TPTZ工作液，37℃避光振蕩反應(yīng)10 min后在595 nm處測(cè)定吸光度值。設(shè)置空白對(duì)照組及Vc陽(yáng)性對(duì)照組。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)及響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果與分析

單因素試驗(yàn)和響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果見圖1。如圖1（A）所示，超聲功率80 W，超聲時(shí)間5 min，液料比25∶1時(shí)，多糖得率為最優(yōu)水平。

圖1 單因素和響應(yīng)面圖Fig.1 Results of single factor and response surface experiments

如圖1（B）所示，對(duì)多糖得率的影響因素的大小依次為：超聲功率＞液料比＞超聲時(shí)間。利用響應(yīng)面預(yù)測(cè)模型和驗(yàn)證試驗(yàn)，得出最適提取工藝為：超聲功率86.77 W，超聲時(shí)間15.86 min，料液比26.61∶1，多糖得率為 4.48%。考慮到實(shí)際操作，將優(yōu)化參數(shù)進(jìn)行修正，即超聲功率80 W、超聲時(shí)間15 min、料液比為25∶1，得到樹蝴蝶粗多糖的實(shí)際得率為4.39%。驗(yàn)證結(jié)果和理論預(yù)測(cè)結(jié)果吻合，表明試驗(yàn)擬合較好，因此利用響應(yīng)面分析法得到的樹蝴蝶多糖的提取工藝參數(shù)真實(shí)可靠，具有參考價(jià)值。

2.2 樹蝴蝶多糖的離子交換層析

將粗多糖過DEAE-52陰離子交換柱，依次用蒸餾水，以及不同濃度的鹽溶液洗脫，用苯酚-H2SO4法跟蹤檢測(cè)得到洗脫曲線，結(jié)果見圖2。

如圖2所示，可得到水洗多糖LKY-I、0.1 mol/L NaCl鹽洗多糖LKY-Ⅱ及0.3 mol/L NaCl鹽洗多糖LKY-Ⅲ，共3種多糖組分。

圖2 離子交換柱層析洗脫曲線Fig.2 Elution curve of DEAE-52 column chromatography

2.3 樹蝴蝶純化多糖的分子質(zhì)量測(cè)定及純度鑒定

多糖的分子質(zhì)量只代表相似鏈長(zhǎng)的平均分布。采用凝膠滲透色譜法（GPC法）測(cè)定 LKY-I、LKY-Ⅱ及 LKY-Ⅲ的分子質(zhì)量。

采用Breeze GPC軟件得出葡聚糖相對(duì)分子質(zhì)量分布標(biāo)準(zhǔn)曲線。葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)品相對(duì)分子質(zhì)量的對(duì)數(shù)（LogMw）對(duì)洗脫體積（V）回歸處理的標(biāo)準(zhǔn)曲線為：LogMw=6.35e-1.22eV+9.51e-1V2-3.25e-2V3+3.91e-4V4。

圖3 GPC圖譜（A）和Sephadex-G100柱層析洗脫曲線（B）Fig.3 The GPC diagram（A） and elution curve on Sephadex G-100 chromatography（B）

圖 3（A） 為 LKY-I、LKY-Ⅱ及 LKY-Ⅲ的GPC圖譜，圖 3（B）為其對(duì)應(yīng)的 Sephadex-G100柱層析圖。由圖 3（A）和圖 3（B）可知，LKY-I、 LKY-Ⅱ及 LKY-Ⅲ平均分子質(zhì)量Mw分別為61 598、122 495、697 243 u；黏度平均分子質(zhì)量Mn分別為：49 125、76 562、205 069 u； 峰位分子質(zhì)量 Mp分別為：46 397、79 327、443 296 u，結(jié)果見表 3。由圖3（A）可知多糖LKY-I、LKY-Ⅱ的GPC圖譜分布均一，峰形相對(duì)對(duì)稱，結(jié)合圖3（B）所對(duì)應(yīng)的Sephadex-G100柱層析圖判定樹蝴蝶純化多糖LKY-I及LKY-Ⅱ?yàn)榧兌容^高的單一組分的雜多糖，而LKY-Ⅲ是一種分子質(zhì)量相對(duì)較大且分布范圍較廣的雜多糖。

表3 樹蝴蝶多糖的GPC結(jié)果Table 3 The GPC results of LKY-I,LKY-II and LKY-III

2.4 樹蝴蝶純化多糖的紫外光譜掃描

圖4為L(zhǎng)KY-I、LKY-Ⅱ及LKY-Ⅲ多糖的紫外掃描光譜圖。由圖4可知，LKY-I、LKY-Ⅱ及LKY-Ⅲ在260、280 nm處均沒有明顯特征吸收峰，說明LKY-I、LKY-Ⅱ及LKY-Ⅲ中不含蛋白質(zhì)及核酸，或者兩種組分含量很少。

圖4 樹蝴蝶多糖的紫外掃描光譜圖Fig.4 UV spectrum of LKY-I，LKY-II and LKY-III

2.5 樹蝴蝶純化多糖的理化性質(zhì)

由表4可知，LKY-I、LKY-Ⅱ及 LKY-Ⅲ分別為白色、淡黃色、黃色棉絮狀，不發(fā)生碘-碘化鉀反應(yīng)，屬于非淀粉多糖；苯酚-硫酸法葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線為 y=8.207 3x-0.016 1，R2=0.999 3， 測(cè)得 3種純化多糖的總糖含量分別為88.91%、74.05%、59.18%；考馬斯亮藍(lán)G-250標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=8.837 1x+0.009 6，R2=0.996 3， 測(cè)得 LKY-I中蛋白質(zhì)含量為0.13%，LKY-Ⅱ及 LKY-Ⅲ中的蛋白質(zhì)含量分別為0.46%、0.91%；硫酸-咔唑法測(cè)定糖醛酸含量的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=4.449 4x-0.015 7，R2=0.997 3，LKY-I、LKY-Ⅱ及 LKY-Ⅲ反應(yīng)均呈陽(yáng)性，且測(cè)得糖醛酸含量分別為13.21%、15.12%、16.02%。

表4 樹蝴蝶多糖的理化性質(zhì)Table 4 Physiochemical properties of LKY-I,LKYII and LKY-III

2.6 樹蝴蝶多糖的SEM分析

不同來源的多糖，盡管結(jié)構(gòu)不同，但綜合顆粒的各種外貌特征，可以分辨開來。因此，掃描電子顯微鏡技術(shù)也可以作為區(qū)別和鑒定不同類型多糖物質(zhì)的一種快速而有效的手段。樹蝴蝶多糖LKYI、LKY-Ⅱ及 LKY-Ⅲ的SEM圖像如圖5所示，從外觀形貌上看，在掃描電鏡圖片下，樹蝴蝶多糖呈不規(guī)則的片狀、棒狀、團(tuán)狀等不同形狀，從表面的平整光潔程度來看，LKY-Ⅲ>LKY-I>LKY-Ⅱ,LKY-Ⅱ碎片較多。LKY-I、LKY-Ⅱ及 LKY-Ⅲ的表面形態(tài)具有較大的差異，可以作為區(qū)分和鑒別3種多糖的依據(jù)。

2.7 抗氧化活性

活性多糖是指具有某種特殊生理活性的多糖化合物，是一類廣泛存在于植物、動(dòng)物和微生物中的天然活性物質(zhì)，大部分具有調(diào)節(jié)機(jī)體免疫力[15]、抗腫瘤[13]、抗氧化[7]等功效?？寡趸嵌嗵茄芯康闹匾I(lǐng)域之一，抗氧化多糖與其他外源性抗氧化劑相比，具有低毒、安全和來源廣等優(yōu)點(diǎn)。

通過測(cè)定DPPH·吸收強(qiáng)弱的程度，可間接評(píng)價(jià)該自由基清除劑的活性[16]。在樹蝴蝶多糖清除DPPH·能力的測(cè)定中，Vc作為陽(yáng)性對(duì)照。如圖6所示，當(dāng) Vc質(zhì)量濃度為 400 μg/mL時(shí)，對(duì) DPPH·自由基的清除率達(dá)到86.71%，隨著樹蝴蝶多糖質(zhì)量濃度的增大，清除自由基的能力就越強(qiáng)，10 mg/mL的LKY-I、LKY-Ⅱ及 LKY-Ⅲ對(duì)DPPH·自由基的清除率分別為44.12%、49.64%、52.39%，稍高于100 μg/mL 的 Vc（清除率為 43.89%），可以看出樹蝴蝶純化多糖均可以提供清除DPPH·自由基的氫供體且具有一定清除效果，且高濃度LKY-Ⅲ多糖對(duì)DPPH自由基的清除能力優(yōu)于其他多糖組分。

ABTS+自由基和DPPH自由基類似，均為穩(wěn)定的有機(jī)自由基，樣品抗氧化能力越強(qiáng)，其提供電子的能力也就越強(qiáng)，因此可以通過測(cè)定反應(yīng)液吸光度的變化，直接反映出樣品還原能力的大小[17]。從圖7可知，在0.25～10 mg/mL質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，樹蝴蝶多糖對(duì)ABTS自由基的清除能力均隨多糖的質(zhì)量濃度增大而增加，當(dāng)樣品質(zhì)量濃度為10 mg/mL時(shí)，ABTS自由基的清除力達(dá)到最大值，分別為24.74% 、19.95% 、17.2% ， 與 100 μg/mL 的 Vc（24.56%）相當(dāng)，說明樹蝴蝶多糖有清除ABTS+自由基的能力，且對(duì)ABTS+自由基的清除能力的大小順序?yàn)?LKY-I＞LKY-Ⅱ＞LKY-Ⅲ。

圖5 樹蝴蝶多糖的SEM圖像Fig.5 SEM of LKY-I（A），LKY-II（B） and LKY-III（C）

圖6 不同多糖對(duì)DPPH·的清除活性Fig.6 DPPH free radical scavenging capability of LKY-I，LKY-II and LKY-III

圖7 不同多糖對(duì)ABTS+·的清除活性Fig.7 ABTS free radical scavenging capability of LKY-I，LKY-II and LKY-III

采用鐵還原（FRAP）分析法評(píng)估樹蝴蝶純化多糖的抗氧化能力大小[18]，結(jié)果見圖8。由圖8可以看出，LKY-I、LKY-Ⅱ及 LKY-Ⅲ多糖參照 Vc來看，都具有一定的抗氧化能力。FeSO4標(biāo)準(zhǔn)曲線為：Y=0.966X+0.023（R2=0.996 0），其中 X 是 FeSO4的濃度（mmol/L），Y 是對(duì)應(yīng)的吸光值。其中，LKY-Ⅲ多糖抗氧化能力最強(qiáng)，顯著高于LKY-Ⅱ及LKY-I多糖。在0.25～10 mg/mL范圍內(nèi)，樹蝴蝶多糖還原能力隨著質(zhì)量濃度的增大而增大，當(dāng)樣品質(zhì)量濃度為10 mg/mL時(shí)，LKY-I、LKY-Ⅱ及 LKY-Ⅲ多糖的FRAP值達(dá)到 0.071 17 mmol/L、0.113 591mmol/L、0.211 54mmol/L， 稍高于 100 μg/mL Vc （0.072 31 mmol/L），說明樹蝴蝶純化多糖具有還原三價(jià)鐵離子的能力。由于Vc是高純度陽(yáng)性對(duì)照物，所以同質(zhì)量濃度下樹蝴蝶的抗氧化活性雖不及Vc，但10 mg/mL樹蝴蝶多糖的抗氧化能力與微克級(jí)別的Vc相比，仍可作為抗氧化劑應(yīng)用于食藥工業(yè)。

圖8 不同多糖樣品的還原能力Fig.8 Reducing power of LKY-I,LKY-II and LKY-III

3 結(jié)論

通過單因素試驗(yàn)，運(yùn)用響應(yīng)面分析法確定了樹蝴蝶多糖超聲輔助提取工藝的影響因素。對(duì)多糖得率的影響大小依次為：超聲功率＞液料比＞超聲時(shí)間。利用響應(yīng)面預(yù)測(cè)模型和驗(yàn)證試驗(yàn)，得出最適提取工藝為超聲功率86.77 W、超聲時(shí)間15.86 min、料液比為 26.61∶1，多糖得率為 4.48%?？紤]到實(shí)際因素的局限性，將優(yōu)化參數(shù)進(jìn)行修正，即超聲功率 80 W、超聲時(shí)間 15 min、料液比為 25∶1，得到樹蝴蝶粗多糖的實(shí)際得率為4.39%。采用最佳工藝制備樹蝴蝶粗多糖，通過大孔樹脂脫色，Sevage法除蛋白和DEAE-52柱層析分離純化得到LKY-I、LKY-Ⅱ及LKY-Ⅲ；其平均分子質(zhì)量Mw分別為61 598、122 495、697 243 u；3 種純化多糖 LKY-I、LKY-Ⅱ及LKY-Ⅲ的多糖含量分別為88.91%、74.05%、59.18%；糖醛酸含量分別為 13.21%、15.12%、16.02%；蛋白質(zhì)含量分別為 0.13%、0.46%、0.91%；3種多糖均不含可溶性淀粉和核酸。掃描電鏡分析可得，樹蝴蝶多糖呈不規(guī)則的片狀、棒狀、團(tuán)狀等不同形狀，且表面結(jié)合較為緊密，但集聚體整體性不強(qiáng)，說明 LKY-I、LKY-Ⅱ及LKY-Ⅲ多糖為無定型結(jié)構(gòu)。樹蝴蝶多糖的抗氧化活性研究表明，各多糖樣品在0.25～10 mg/mL的范圍內(nèi)均具有抗氧化活性，且與多糖質(zhì)量濃度呈正相關(guān)。高質(zhì)量濃度LKY-Ⅲ多糖對(duì)DPPH自由基的清除能力優(yōu)于其他多糖組分；對(duì)ABTS+自由基的清除能力LKY-I優(yōu)于其他多糖組分；對(duì)Fe3+的還原能力則是LKY-Ⅲ最強(qiáng)，高質(zhì)量濃度LKY-Ⅲ的FRAP值可達(dá)到0.211 54 mmol/L，試驗(yàn)表明樹蝴蝶純化多糖具有一定的抗氧化活性。

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PHYSICO-CHEMICAL PROPERITIES AND ANTIOXIDANT ACTIVITY OF POLYSACCHARIDES FROM LOBARIA KUROKAUAE YOSHIM

GENG Jiahuan，SHEN Chaoqun，DONG Fang，CHEN Jian
（School of Food Science and Engineering，South China University of Technology，Guangzhou510640，China）

The response surface method （RSM） was used to optimize the ultrosonic extraction process of polysaccharides fromLobaria kurokauaeYoshim. Crude polysaccarides were further processed by decoloration，deproteinization with sevage method and DEAE-52 ion-exchange column choromatography to obtain three components LKY-I，LKY-II and LKY-III. The molecular mass and purifity of the three components were identified by gel permeation chromatography and Sephadex G-100 gel column chromatography; the physico-chemical properties were also determined by iodine-potassiumiodide，phenol-sulphuric acid，coomassie brilliant blue G-250，and sulfuric acid-carbazole method; and the antioxidant activity of LKY-I，LKY- II and LKY- III were evaluated by determining the DPPH and ABTS+ free radicals scavenging rate as well as the reducing power. Results showed that the optimum polysaccharide extraction conditions were as follows: power 800 W，extraction time 15 minutes，and liquid-to-material ratio 25:1，and the polysaccharide yield reached 4.39%.The molecular masses of LKY-I，LKY- II and LKY- III were 61 598 Da，122 495 Da and 697 243 Da; the total sugar content were 88.91%，74.05% and 59.18%; the uronic acid content were 13.21%，15.12% and 16.02%，and the protein content were 0.13% ，0.46% and 0.91% ，respectivley; and the three kinds of polysaccarides LKY-I，LKY- II and LKY- III did not contain soluble starch and nucleic acid. Antioxidant activity tests showed that the polysaccaride samples had high antioxidant activity in 0.25 to 10 mg/mL.

Lobaria kurokauaeYoshim；polysaccharides；physico-chemical property；antioxidant activity

TS 201.2 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：B

1673-2383(2017)05-0068-08

http://kns.cnki.net/kcms/detail/41.1378.N.20171030.0936.026.html

網(wǎng)絡(luò)出版時(shí)間：2017-10-30 9:36:38

2017-02-12

廣東省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(2014A030313242)

耿佳歡(1993—)，女，河北邢臺(tái)人，碩士研究生，研究方向?yàn)樘烊划a(chǎn)物化學(xué)。

*通信作者