小黑楊HD-Zip轉(zhuǎn)錄因子家族生物信息學及應答鹽脅迫分析

張雪梅 姚文靜 趙 凱 姜廷波 周博如

(東北林業(yè)大學林木遺傳育種國家重點實驗室，哈爾濱 150040)

小黑楊HD-Zip轉(zhuǎn)錄因子家族生物信息學及應答鹽脅迫分析

張雪梅 姚文靜 趙 凱 姜廷波 周博如*

(東北林業(yè)大學林木遺傳育種國家重點實驗室，哈爾濱 150040)

HD-Zip轉(zhuǎn)錄因子基因是植物中特有的一類蛋白家族，在植物生長發(fā)育和逆境應答脅迫過程中發(fā)揮重要作用。HD-Zip轉(zhuǎn)錄因子基因是由高度保守的同源異型結構域(HD)和亮氨酸拉鏈域(LZ)結構域構成的特殊結構模型。楊樹HD-Zip轉(zhuǎn)錄因子家族共有63個基因，可被分為HD-ZipⅠ、HD-ZipⅡ、HD-ZipⅢ和HD-ZipⅣ四個亞家族。本文利用RNA-Seq分析了鹽脅迫條件下HD-Zip基因家族在小黑楊根、莖、葉等不同組織的基因表達差異，從轉(zhuǎn)錄組水平揭示其應答脅迫環(huán)境的分子機制，結果表明，鹽脅迫下在葉中有25個HD-Zip基因下調(diào)表達，21個基因上調(diào)表達；莖中有42個基因下調(diào)表達，11個基因上調(diào)表達；根中有26個基因下調(diào)表達，24個基因上調(diào)表達。另外，本文根據(jù)擬南芥HD-Zip轉(zhuǎn)錄因子家族基因的已知功能，預測了楊樹HD-Zip轉(zhuǎn)錄因子同源基因的功能，并利用生物信息學方法分析了楊樹HD-Zip轉(zhuǎn)錄因子蛋白序列的保守結構域、氨基酸組成和理化性質(zhì)等，為進一步研究楊樹HD-Zip轉(zhuǎn)錄因子基因功能提供參考。

HD-Zip轉(zhuǎn)錄因子；非生物脅迫；生長發(fā)育；小黑楊；生物信息學

楊樹生長速度快、適應性強、分布范圍廣、材質(zhì)優(yōu)良，是重要的綠化、造林和用材樹種，主要應用于四旁綠化、農(nóng)林防護、民用建筑、板料和紙漿制造方面。隨著楊樹全基因組測序的完成，楊樹成為研究植物分子生物學和遺傳學上的木本模式植物，在木本植物生長發(fā)育和植物抗旱、耐鹽、抗低溫等非生物脅迫的研究和應用中非常廣泛。

轉(zhuǎn)錄因子(Transcription factor)也稱反式作用因子，是能與真核生物啟動子特定DNA序列結合的蛋白質(zhì)分子，或者是具有已知DNA結合域結構特征的蛋白質(zhì)分子[1]。轉(zhuǎn)錄因子能與基因5′端上游特定序列進行專一性結合，保證目的基因在特定的時間與空間表達。植物中的轉(zhuǎn)錄調(diào)控能嚴格控制生物表達過程，從而應答環(huán)境脅迫，調(diào)節(jié)對環(huán)境變化的反應。

同源異型域—亮氨酸拉鏈蛋白(Homeodomain-leucine Zipper,HD-Zip)是植物特有的一類轉(zhuǎn)錄因子，屬于Homeobox蛋白家族，具有高度保守的HD(Homeodomain,HD)結構域，由61個氨基酸組成[2]，可折疊成典型的螺旋—環(huán)—螺旋—轉(zhuǎn)角—螺旋的結構，能與DNA特異結合[3]，其末端與亮氨酸拉鏈域(LZ)緊密相連，亮氨酸拉鏈結構域主要是介導蛋白二聚體的形成[4]。根據(jù)氨基酸序列同源性的不同，植物HD-Zip轉(zhuǎn)錄因子基因可分為HD-ZipⅠ、HD-ZipⅡ、HD-ZipⅢ和HD-ZipⅣ 4類[5]，并且四大亞類均有一定的結構特征和相應的功能特點，HD-ZipⅠ主要包括HD和LZ兩個保守結構域，在應答非生物脅迫方面發(fā)揮重要作用[6]；HD-ZipⅡ亞家族基因除了含有高度保守的HD和LZ序列外，在LZ下游緊挨著LZ結構域還有一個以五個保守氨基酸半胱氨酸(Cys)、脯氨酸(Pro)、絲氨酸(Ser)、半胱氨酸(Cys)和谷氨酸(Glu)命名的N端共有序列，主要負責細胞氧化還原傳感[7]，該亞家族的基因負責感應光信號并能對植物激素產(chǎn)生應答效應[8]；HD-ZipⅢ亞家族成員大多含有START(steroidogenic acute regulatory protein-related lipid transfer)結構域和與START相鄰的SAD(START-adjacent domain),除此以外，幾乎所有成員在C端均有一個可以結合信號分子來改變HD-ZipⅢ蛋白構象的MEKHLA結構域，該亞家族主要在胚胎形態(tài)發(fā)生、分生組織調(diào)控、側(cè)生器官形成、葉片的極性運輸以及生長素的運輸?shù)确矫姘l(fā)揮重要作用[9～10]；HD-ZipⅣ亞家族成員相較于HD-ZipⅢ亞家族缺少了MEKHLA結構域，該亞家族成員主要參與表皮細胞的分化、花青素的積累、根的發(fā)育和毛狀體的形成[11～12]等。當前已對擬南芥、水稻[13]、蘋果、紫花苜蓿等植物的HD-Zip轉(zhuǎn)錄因子基因家族有過相關研究，但對楊樹的HD-Zip轉(zhuǎn)錄因子基因家族介紹較少。

楊樹共有63個HD-Zip轉(zhuǎn)錄因子基因[14]，本文利用轉(zhuǎn)錄組測序(RNA-Seq)法比較了楊樹在高鹽脅迫下分別在根、莖、葉中的相對表達量，從而分析了HD-Zip轉(zhuǎn)錄因子基因在不同組織中的差異性表達；并利用生物信息學的方法對楊樹的HD-Zip轉(zhuǎn)錄因子基因家族成員進行分析，為深度研究楊樹轉(zhuǎn)錄因子的功能提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 非生物脅迫處理楊樹幼苗

從同一株楊樹上采集嫩枝，截成15 cm，25℃室溫14 h·d-1光照水培兩個月，新長出根、莖(頂尖嫩莖處)、葉的楊樹苗即為本實驗材料。然后分別用水(對照)和0.15 mol·L-1NaCl溶液處理24 h，收集根、莖、葉樣品(每個處理有3個生物學重復)，液氮速凍、-70℃保存，然后送生物公司提取RNA并利用IlluminaHiSeq 2000基因分析系統(tǒng)進行轉(zhuǎn)錄組高通量測序，最后進行RNA測序數(shù)據(jù)處理[15]。

1.2 楊樹HD-Zip轉(zhuǎn)錄因子基因的生物信息學分析

從楊樹基因組數(shù)據(jù)庫(http://planttfdb.cbi.pku.edu.cn/)中獲得了63條轉(zhuǎn)錄因子氨基酸序列，從擬南芥基因組數(shù)據(jù)庫(http://www.arabidopsis.org/)中得到48條HD-Zip轉(zhuǎn)錄因子氨基酸序列。利用BioEdit對楊樹HD-Zip轉(zhuǎn)錄因子蛋白序列進行比對分析，利用ClustalX2.1和MEME(Version 4.10.0)對楊樹HD-Zip轉(zhuǎn)錄因子蛋白序列進行基因保守元件(conserved motifs)的多元比較分析[16]。

將獲得的楊樹HD-Zip轉(zhuǎn)錄因子蛋白氨基酸序列放入ExPaSy在線Protparam軟件(http://web/expasy/org/protparam/)進行分析，獲得HD-Zip基因的蛋白分子量和等電點等理化屬性。用PBIL在線網(wǎng)站(https://npsa-prabi.ibcp.fr/)對63條楊樹HD-Zip轉(zhuǎn)錄因子蛋白序列的二級結構進行預測分析，并用Swiss-Model程序從四個亞家族中隨機抽取3條蛋白序列進行三級結構同源建模。

2 結果與分析

2.1 鹽脅迫對楊樹HD-Zip轉(zhuǎn)錄因子基因表達影響

根據(jù)本實驗室之前的鹽脅迫處理實驗，用0.15 mol·L-1鹽溶液處理楊樹苗24 h后葉片出現(xiàn)干枯現(xiàn)象，故以0.15 mol·L-1NaCl溶液作為脅迫處理楊樹的最大濃度。將楊樹苗浸泡在水和0.15 mol·L-1NaCl溶液中24 h，分別收集根、莖、葉樣品，經(jīng)轉(zhuǎn)錄組測序分析發(fā)現(xiàn)，在葉中除了17個基因在鹽脅迫條件下沒有表達量變化以外，有25個HD-Zip基因下調(diào)表達，21個基因上調(diào)表達(表1)；莖中有10個基因沒有表達量變化，42個基因下調(diào)表達，11個基因上調(diào)表達；根中有13個基因沒有表達量變化，26個基因下調(diào)表達，24個基因上調(diào)表達(圖1A),其中，在葉中上調(diào)表達2倍以上的有5個，莖中上調(diào)表達2倍以上的有5個，最高為5.14倍，根中上調(diào)表達2倍以上的有7個，最高為8.25倍。除此以外，Potri.014G103000.1、Potri.001G083700.1和Potri.007G008200.1等5個基因在鹽脅迫條件下均在根、莖、葉中顯著上調(diào)表達,Potri.017G081700.1、Potri.001G372300.1和Potri.008G148200.1等14個基因在根、莖、葉中均顯著下調(diào)表達(圖1B)，而在葉中上調(diào)4.55倍的Potri.007G029500.1基因在莖和根中表現(xiàn)下調(diào)趨勢，還有的基因如Potri.009G023600.1、Potri.012G139300.1和Potri.001G229700.1在葉和根中表達量均顯著增加，在莖中卻呈現(xiàn)下調(diào)趨勢。結果表明了，楊樹HD-Zip轉(zhuǎn)錄因子家族各成員在不同的組織中參與植物的抗逆過程，從而實現(xiàn)高鹽應答脅迫。

2.2 楊樹HD-Zip轉(zhuǎn)錄因子家族生物信息學分析

利用BioEdit對63條楊樹HD-Zip轉(zhuǎn)錄因子蛋白結構域和48條擬南芥HD-Zip轉(zhuǎn)錄因子蛋白結構域進行序列比對,根據(jù)擬南芥HD-Zip基因家族的分類[17]， 將楊樹的63個HD-Zip基因同樣分成四個亞家族HD-ZipⅠ、HD-ZipⅡ、HD-ZipⅢ和HD-ZipⅣ(表2)，從表中可以看出，楊樹有22個HD-Zip基因?qū)儆贖D-ZipⅠ亞家族，17個基因?qū)儆贖D-ZipⅡ亞家族，8個基因?qū)儆贖D-ZipⅢ亞家族，16個基因?qū)儆贖D-ZipⅣ亞家族。

表1HD-Zip家族基因應答鹽脅迫的相對表達量

Table1RelativeexpressionofHD-Zipfamilygenesundersaltstress

基因IDGeneID葉中相對表達量Relativeexpressioninleaves莖中相對表達量Relativeexpressioninstems根中相對表達量RelativeexpressioninrootsPotri．006G071600．10．022±0．001-1．383±0．0048．246±0．686Potri．004G020400．10．048±0．007-0．438±0．0170．048±0．003Potri．008G129500．10．108±0．022-0．403±0．0110．912±0．037Potri．018G045100．10．228±0．0010-1．826±0．144Potri．003G052400．10．250±0．0201．045±0．017-0．282±0．025Potri．002G113400．10．336±0．040-1．502±0．069-1．185±0．064Potri．010G112600．10．403±0．0142．912±0．2060．699±0．101Potri．014G045100．10．445±0．016-0．716±0．0321．212±0．026Potri．015G065400．10．477±0．0960．350±0．013-2．969±0．098Potri．007G135100．10．481±0．021-2．785±0．036-1．293±0．132Potri．001G229700．10．606±0．129-0．103±0．0331．791±0．709Potri．007G008200．10．733±0．0480．365±0．0380．357±0．025Potri．012G139300．10．794±0．014-0．355±0．0244．411±0．315Potri．012G070900．11．078±0．0380．845±0．107-1．408±0．521Potri．009G023600．11．420±0．269-0．022±0．0012．389±0．510Potri．002G136400．11．488±0．0330．993±0．0211．488±0．016Potri．012G023700．12．199±0．1892．547±0．0113．805±0．102Potri．002G176300．12．870±0．1052．089±0．195-1．191±0．976Potri．007G029500．14．555±0．138-0．020±0．004-0．144±0．061Potri．001G083700．14．642±0．1313．847±0．5321．209±0．121Potri．014G103000．14．843±0．0595．143±0．3821．116±0．143

圖1 鹽脅迫條件下楊樹HD-Zip家族基因表達 A.HD-Zip家族基因在不同組織中的表達；B.上調(diào)表達基因和下調(diào)表達基因Fig.1 Expression of HD-Zip family genes in poplar by salt stress A.Expression of HD-Zip family genes in different tissues; B.Up-regulated and down-regulated genes

Phytozome登錄號PhytozomeID類型Type染色體Chromosome大小Size(aa)分子量Molecularweight等電點TheoreticalPI脂肪系數(shù)Aliphaticindex疏水性平均系數(shù)Grandaverageofhydropathicityα?螺旋Alphahelix(%)二級結構預測Secondarystructureprediction延伸鏈Extendedstrand(%)無規(guī)則鏈Randomcoil(%)Potri．007G097100．1Ⅰ732836845．64．8665．46-0．76742．389．4548．17Potri．010G093400．1Ⅰ1031135250．56．2269．07-0．78136．0111．5852．41Potri．005G071900．1Ⅰ532936971．74．8266．41-0．78536．4713．9849．54Potri．008G148200．1Ⅰ828932985．85．9464．19-0．86233．918．3057．79Potri．001G155100．1Ⅱ130233642．98．7464．3-0．78227．4811．5960．93Potri．017G081700．1Ⅰ1730634748．86．2764．12-0．84338．246．5455．23Potri．015G065400．1Ⅰ15314354934．6766．82-0．81840．4510．8348．73Potri．012G070900．1Ⅰ12317354944．762．81-0．79840．387．5752．05Potri．016G059000．1Ⅱ1634438311．98．9861．89-0．79722．3814．8362．79Potri．009G023600．1Ⅱ938342234．56．0356．37-0．8423．5024．8051．70Potri．001G229700．1Ⅱ137441439．77．6551．23-0．90122．1920．3257．49Potri．006G193700．1Ⅱ632636355．99．2863．19-0．7924．8515．6459．51Potri．007G008200．1Ⅱ727330530．58．6865．19-0．70934．8015．3849．82Potri．014G045100．1Ⅱ14298331458．463．89-0．82830．5410．4059．06Potri．002G136400．1Ⅱ232035667．18．8865．59-0．83530．639．3860．00Potri．005G147100．1Ⅱ529032480．77．5370．31-0．6828．9713．4557．59Potri．002G100600．1Ⅰ226530733．16．2368．45-0．95549．817．1743．02Potri．008G194400．1Ⅰ830235004．25．0463．61-0．828．4814．9056．62Potri．012G023700．1Ⅰ12275313985．6163．16-0．79153．8210．9135．27Potri．018G133100．1Ⅱ18207239258．7959．37-1．10532．8511．1156．04Potri．014G103000．1Ⅰ1423827160．24．9759．87-0．91637．399．6652．94Potri．016G058600．1Ⅱ1620323012．19．7762．07-0．88735．4714．7849．75Potri．002G176300．1Ⅰ223827282．45．0459．87-0．93836．978．4054．62Potri．006G071600．1Ⅱ621424587．58．3254．72-1．18632．2411．2156．54Potri．002G113400．1Ⅱ2269300706．1675．39-0．64228．2517．1054．65Potri．005G161500．1Ⅰ526530781．15．6769．58-0．91148．3010．1941．51Potri．005G126100．1Ⅰ520423701．99．0270．74-0．87533．8214．2251．96Potri．003G079800．1Ⅱ335439484．56．6868．08-0．66723．7313．5662．71Potri．006G117700．1Ⅰ623227132．48．4563．92-0．9547．846．9045．26Potri．007G029500．1Ⅰ720423834．16．0469．8-0．89850．988．3340．69Potri．008G129500．1Ⅱ8232255738．4867．28-0．62128．4517．6753．88Potri．010G112600．1Ⅱ1022525185．49．1665．91-0．7332．8916．0051．11Potri．001G083700．1Ⅰ119623014．48．9458．21-1．24552．553．0644．39Potri．011G114500．1Ⅰ1121324526．36．4569．15-0．86846．484．6948．83Potri．001G395100．1Ⅰ120523745．78．7776．59-0．64947．809．7642．44Potri．007G135100．1Ⅰ717920311．78．5576．87-0．74549．169．5041．34Potri．017G016900．1Ⅰ1717920296．97．8376．87-0．70453．073．9143．02Potri．016G058400．1Ⅱ1614416280．69．9262．36-0．75131．9420．8347．22Potri．003G147200．1Ⅰ39511456．29．3492．42-0．39466．3214．7418．95Potri．003G052400．1Ⅳ375984384．36．1174．91-0．50837．0217．9245．06Potri．001G184100．1Ⅳ176485053．26．0374．54-0．47938．0916．1045．81Potri．002G230200．1Ⅳ276583840．85．677．88-0．31830．4617．6551．90Potri．014G152000．1Ⅳ1476283224．45．5679．23-0．29237．2714．9647．77Potri．004G020400．1Ⅳ472579870．55．5479．89-0．31834．7617．1048．14Potri．011G025000．1Ⅳ1172078975．55．5680．29-0．29732．6418．4748．89Potri．014G075200．1Ⅳ1482389393．45．8981．41-0．27434．5116．7748．72Potri．002G154700．1Ⅳ282089297．25．9381．35-0．26935．8518．0546．10Potri．015G034100．1Ⅳ1572579739．56．3381．46-0．25730．0719．1750．76Potri．012G038500．1Ⅳ1271178026．46．0883．5-0．2935．5815．6148．80Potri．006G237500．1Ⅲ684492883．35．9783．58-0．13142．5416．1141．35Potri．015G141800．1Ⅳ1575383020．35．7183．84-0．2935．8618．0646．08Potri．018G045100．1Ⅲ1884392805．26．0785．41-0．14240．3317．9141．76Potri．011G098300．1Ⅲ1184392739．85．9585．99-0．1442．7017．0840．21Potri．012G139300．1Ⅳ1274882431．45．5684．81-0．32433．4218．8547．73Potri．001G188800．1Ⅲ185293855．36．0687．14-0．13740．4917．0242．49Potri．001G372300．1Ⅲ184492675．75．9684．62-0．15242．7716．1141．11Potri．003G050100．1Ⅲ383792230．46．0386．71-0．16142．1715．4142．41Potri．003G096000．1Ⅳ380889791．85．4380．82-0．31128．7119．9351．36Potri．001G137800．1Ⅳ180489190．15．3580．63-0．31528．1119．1552．74Potri．009G014500．1Ⅲ985593554．55．990．51-0．07343．9816．3739．65Potri．004G211300．1Ⅲ4846928415．8691．82-0．04648．2314．8936．88Potri．017G144600．1Ⅳ1764875924．36．3882．54-0．28130．2619．0150．73Potri．T120700．1ⅣScaffold?20164170604．86．4681．86-0．39935．1016．85 48．05

分析楊樹HD-Zip轉(zhuǎn)錄因子基因家族的理化性質(zhì)可知，楊樹HD-Zip轉(zhuǎn)錄因子基因家族的氨基酸個數(shù)在95～855，分布在HD-ZipⅠ和HD-ZipⅡ亞家族的基因氨基酸個數(shù)較少，一般在100～400個，而HD-ZipⅠ亞家族中的Potri.003G147200.1僅有95個氨基酸。分布在HD-ZipⅢ和HD-ZipⅣ亞家族中的基因氨基酸個數(shù)在641～855，氨基酸個數(shù)最多的是HD-ZipⅢ中的Potri.009G014500.1，多達855個。楊樹HD-Zip轉(zhuǎn)錄因子基因家族蛋白的等電點大多在酸性范圍內(nèi)，脂肪系數(shù)均在51.23以上，最高達到92.42，這表明了HD-Zip轉(zhuǎn)錄因子家族的蛋白熱穩(wěn)定性較高。其疏水性平均系數(shù)均為負數(shù)，說明HD-Zip蛋白均表現(xiàn)為親水性。63個楊樹HD-Zip蛋白序列中主要有α-螺旋、延伸鏈和無規(guī)則卷曲結構且三種結構交錯排列。利用planttfdb數(shù)據(jù)庫找到63個楊樹HD-Zip轉(zhuǎn)錄因子氨基酸序列，根據(jù)popgenie在線網(wǎng)站上Chromosome Diagram功能，進行染色體定位發(fā)現(xiàn)，HD-Zip基因在楊樹染色體上呈不均勻分布，在第1、2、3號染色體上分布較多，分別有8、6、5條基因，在其它染色體上分布較少，第4、9、10、16和18號染色體上均只存在2條HD-Zip基因，并且在第13和第19號染色體上不存在HD-Zip基因。HD-Zip基因在染色體上的這種不均衡分布可能跟楊樹進化過程中基因的功能特性相關。

利用MEME在線軟件確定了20個保守序列(表3)，根據(jù)20個氨基酸保守序列可將63個楊樹HD-Zip基因分成四類，與系統(tǒng)發(fā)育樹的分類一致。對63條HD-Zip基因分析得到，基序1和基序2編碼高度保守的HD結構域，基序17編碼亮氨酸拉鏈結構域(LZ)，而基序3、7、8、9、11、12、13、14、16、18可能與HD-ZipⅢ和HD-ZipⅣ中的START結構域的形成有關，基序4、5、6、10、13、15、19、20則可能與僅存在與HD-ZipⅢ中的MEKHLA結構域的編碼有關。不同的亞家族包含有不同的保守結構域，這可能與HD-Zip基因蛋白特殊的生物學功能相關。

利用Swiss-Model分別HD-Zip 4個亞家族中的各個成員進行三級結構的同源建模，結果表明，HD-ZipⅠ、HD-ZipⅡ和HD-ZipⅣ亞家族中蛋白的三級結構大體相同，而HD-ZipⅢ亞家族中的蛋白三級結構的構象之間略有不同，這可能與HD-ZipⅢ中基因的特殊保守域MEKHLA相關，從而使HD-ZipⅢ中不同的成員具有不同的功能[18]，而且四個亞家族之間的蛋白構型也存在一定的差異。分析其二級結構發(fā)現(xiàn)，HD-ZipⅠ亞家族中蛋白的α-螺旋所占比例偏大，HD-ZipⅡ亞家族中蛋白的無規(guī)則卷曲結構所占比例偏大，而HD-ZipⅢ和HD-ZipⅣ亞家族中蛋白的延伸鏈的含量較HD-ZipⅠ和HD-ZipⅡ偏大，因此不同亞家族之間蛋白三級結構的差異可能與蛋白中的α-螺旋、延伸鏈和無規(guī)則卷曲結構的含量有關。

表3HD-Zip基序的長度和保守氨基酸序列

Table3ThelengthandconservedaminoacidsequenceofHD-Zipmotifs

基序Motif長度Length保守氨基酸序列ConservedaminoacidsequenceMotif150LGLRPRQVEVWFQNRRARTKLKQTEVDCEFLKRCCENLTAENRRLQKEVQMotif229RYHRHTARQIQEMEAMFKECPHPDDKQRMMotif329GVAGNYNGALQVMTAEFQVPSPLVPTRENYFVRYCKQMotif450IEPKQIKVWFQNRRCREKQRKEASRLQTVNRKLTAMNKLLMEENDRLQKQMotif541KATGTAVEWVQMPGMKPGPDSIGIVAISHGCTGVAARACGLMotif650PVFTFANQAGLDMLETTLVALQDITLEKIFDDHGRKTLCSEFPQIMQQGFMotif724THQLYRPLISSGMGFGAQRWIATLMotif841TSFWLPVPPKRVFDFLRDENTRNEWDILSNGGVVQEMAHIAMotif941QESCTDSTGSYVIYAPVDISAMNIVLSGGDPDYVALLPSGFMotif1050DVFLLQLCCGMDENAVGTCAELIFAPIDATFADDAPLLPSGFRIIPLDSGMotif1115LPSGCLIQDMPNGYSMotif1229RMVISFCAGVSASTAHTWTTLSGTGADDVMotif1332SLLTVAFQILVNSLPTAKLTVESVETVNNLISMotif1441RSEASRESAVVIMNHVNLVEILMDANQWSTIFCGIVSRAMTMotif1550VLCAKASMLLQNVPPAILLRFLREHRSEWADSGIDAYAAAAVKAGPCSLPMotif1630DKPMIIELAVAAMEELVRMAQMDEPLWMGSMotif1721PATTLTMCPSCERVATTTTSSMotif1841FDEQKLRIENAQLKEELDRVSSIAAKYIGRPISQLPPVQPVMotif1929CLPGGICLSSMGRPVSYERAVAWKVLNEEMotif2029VGLEPTRVAEILKDRPSWFRDCRAVDVLN

3 討論

HD-Zip轉(zhuǎn)錄因子在植物的生長發(fā)育過程中發(fā)揮重要功能，不同的亞家族轉(zhuǎn)錄因子發(fā)揮不同的功能，如HD-ZipⅠ蛋白在番茄的生長發(fā)育過程中參與果實成熟的調(diào)控[19]，HD-ZipⅡ亞家族中基因的過表達誘導擬南芥的早花表型[20]，HD-ZipⅢ中的成員調(diào)控木質(zhì)部維管束形成[21]、頂端分生組織的發(fā)生[22],HD-ZipⅣ亞家族中的基因成員在玉米中過表達后抑制表皮毛的形成[23]等。本文通過轉(zhuǎn)錄組測序比較了鹽脅迫條件下楊樹HD-Zip轉(zhuǎn)錄因子基因在根、莖、葉中的差異性表達，找到了鹽脅迫下在葉中高表達的21個HD-Zip基因，莖中11個高表達的HD-Zip基因以及根中24個高表達的HD-Zip基因，分析發(fā)現(xiàn)Potri.014G103000.1等5個基因經(jīng)過高鹽處理后均顯著上調(diào)表達，Potri.017G081700.1等14個基因在根、莖、葉中均下調(diào)表達，而有的基因則選擇性地在不同的組織中高表達，表明了楊樹HD-Zip轉(zhuǎn)錄因子家族各成員在不同的組織中參與植物的抗逆過程，從而發(fā)揮鹽脅迫應答作用。

本文利用生物信息學的方法分析了63個楊樹HD-Zip轉(zhuǎn)錄因子基因的結構及其相關信息，通過與擬南芥HD-Zip轉(zhuǎn)錄因子家族中的48個基因進行比較以及對其包含的保守結構域進行分析將其分為四個亞家族，并分析了整個家族中63個基因的理化性質(zhì)和染色體定位，得到分布在17條染色體上的63個HD-Zip轉(zhuǎn)錄因子蛋白大多處于酸性范圍內(nèi)，而等電點值較大的基因蛋白大多含有較多的亮氨酸等堿性氨基酸，有助于形成亮氨酸拉鏈保守結構域，從而介導蛋白二聚體的形成；通過蛋白二級結構和三級結構的預測分析發(fā)現(xiàn)HD-ZipⅠ、HD-ZipⅡ和HD-ZipⅣ亞家族中各成員蛋白結構相似，而HD-ZipⅢ中各成員蛋白結構略有不同，可能與其特殊的結構域有關。統(tǒng)計得到，鹽脅迫條件下表現(xiàn)出上調(diào)表達趨勢的21個HD-Zip轉(zhuǎn)錄因子基因除Potri.018G045100.1屬于HD-ZipⅢ亞家族外，有3個基因?qū)儆贖D-ZipⅣ亞家族，而屬于HD-ZipⅠ和HD-ZipⅡ亞家族的分別有8個和9個；在根、莖、葉中應答鹽脅迫均呈上調(diào)表達趨勢的基因除Potri.007G008200.1屬于HD-ZipⅡ亞家族外，其余都屬于HD-ZipⅠ亞家族。這些基因在染色體上呈不均勻分布，其氨基酸個數(shù)與其分子量不大，除了Potri.001G083700.1基因的等電點處于堿性范圍外，其它基因均處于酸性范圍內(nèi)，其脂肪系數(shù)均在58.21以上，蛋白質(zhì)的熱穩(wěn)定性較高，疏水性平均值在-0.791～-1.245，是親水性極強的蛋白，這些基因所表現(xiàn)出的較強的脅迫應答能力可能與其特殊的理化性質(zhì)以及HD-ZipⅠ亞家族中轉(zhuǎn)錄因子的HD和LZ結構域有關，而HD-ZipⅢ和HD-ZipⅣ中的START和MEKHLA結構域在脅迫處理環(huán)境中可能抑制基因的表達?？傊?，通過RNA-Seq和生物信息學方法的分析，將進一步為研究楊樹HD-Zip轉(zhuǎn)錄因子家族蛋白在應答逆境脅迫方面提供有效依據(jù)。

1.Yanagisawas.Dof domain proteins：plant-specific transcription factors associated with diverse phenomena unique to plants[J].Plant and Cell Physiology,2004,45(4):386-391.

2.Schena M,Davis R W.HD-Zip proteins:members of anArabidopsishomeodomain protein superfamily[J].Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America,1992,89(9):3894-3898.

3.Bharathan G,Janssen B J,Kellogg E A,et al.Did homeodomain proteins duplicate before the origin of angiosperms,fungi,andmetazoa?[J].Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America,1997,94(25):13749-13753.

4.Jain M,Tyagi A K,Khurana J P.Genome-wide identification,classification,evolutionary expansion and expression analyses of homeobox genes in rice[J].The FEBS Journal,2008,275(11):2845-2861.

5.Sessa G,Steindler C,Morelli G,et al.TheArabidopsisAthb-8,-9 and -14 genes are members of a small gene family coding for highly related HD-ZIP proteins[J].Plant Molecular Biology,1998,38(4):609-622.

6.Olsson A S,Engstr?m P,S?derman E.The homeobox genesATHB12 andATHB7 encode potential regulators of growth in response to water deficit inArabidopsis[J].Plant Molecular Biology,2004,55(5):663-677.

7.Tron A E,Bertoncini C W,Chan R L,et al.Redox regulation of plant homeodomain transcription factors[J].Journal of Biological Chemistry,2002,277(38):34800-34807.

8.Sawa S,Ohgishi M,Goda H,et al.TheHAT2 gene,a member of the HD-Zip gene family,isolated as an auxin inducible gene by DNA microarray screening,affects auxin response inArabidopsis[J].The Plant Journal,2002,32(6):1011-1022.

9.Prigge M J,Otsuga D,Alonso J M,et al.ClassⅢ homeodomain-leucine zipper gene family members have overlapping,antagonistic,and distinct roles inArabidopsisdevelopment[J].The Plant Cell,2005,17(1):61-76.

10.Otsuga D,Deguzman B,Prigge M J,et al.REVOLUTAregulates meristem initiation at lateral positions[J].The Plant Journal,2001,25(2):223-236.

11.Nakamura M,Katsumata H,Abe M,et al.Characterization of the class Ⅳ homeodomain-leucine zipper gene family inArabidopsis[J].Plant Physiology,2006,141(4):1363-1375.

12.Luo D L,Oppenheimer D G.Genetic control of trichome branch number inArabidopsis:the roles of theFURCAloci[J].Development,1999,126(24):5547-5557.

13.Agalou A,Purwantomo S,?vern?se,et al.A genome-wide survey of HD-Zip genes in rice and analysis of drought-responsive family members[J].Plant Molecular Biology,2008,66(1-2):87-103.

14.Hu R B,Chi X Y,Chai GH,et al.Genome-wide identification,evolutionary expansion,and expression profile of homeodomain-leucine zipper gene family in poplar(Populustrichocarpa)[J].PLoS One,2012,7(2):e31149.

15.Yao W J,Wang S J,Zhou B R,et al.Transgenic poplar overexpressing the endogenous transcription factor ERF76 gene improves salinity tolerance[J].Tree Physiology,2016,36(7):896-908.

16.Bailey T L,Elkan C.Fitting a mixture model by expectation maximization to discover motifs in biopolymers[J].Proceeding International Conference on Intelligent Systems for Molecular Biology,1994,2:28-36.

17.Aso K,Kato M,Banks JA,et al.Characterization of homeodomain-leucine zipper genes in the fernCeratopterisrichardiiand the evolution of the homeodomain-leucine zipper gene family in vascular plants[J].Molecular Biology and Evolution,1999,16(4):544-552.

19.Lin Z F,Hong Y G,Yin M G,et al.A tomato HD-Zip homeobox protein,LeHB-1,plays an important role in floral organogenesis and ripening[J].The Plant Journal,2008,55(2):301-310.

20.Dezar C A,Giacomelli J I,Manavella P A,et al.HAHB10,a sunflower HD-ZipⅡ transcription factor,participates in the induction of flowering and in the control of phytohormone-mediated responses to biotic stress[J].Journal of Experimental Botany,2011,62(3):1061-1076.

21.Itoh J I,Hibara K I,Sato Y,et al.Developmental role and auxin responsiveness of classⅢ homeodomain leucine zipper gene family members in rice[J].Plant Physiology,2008,147(4):1960-1975.

22.Kim J,Jung J H,Reyes J L,et al.microRNA-directed cleavage ofATHB15mRNA regulates vascular development inArabidopsisinflorescence stems[J].The Plant Journal,2005,42(1):84-94.

23.Vernoud V,Laigle G,Rozier F,et al.The HD-ZIPⅣ transcription factor OCL4 is necessary for trichome patterning and anther development in maize[J].The Plant Journal,2009,59(6):883-894.

National 863 project(2013AA102701)

introduction：ZHANG Xue-Mei(1991—),female,master,mainly engaged in the forestry research of stress resistance.

date:2017-07-14

BioinformaticsandResponsetoSaltStressAnalysisoftheHD-ZipTranscriptionFactorFamilyinPopulussimonii×P.nigra

ZHANG Xue-Mei YAO Wen-Jing ZHAO Kai JIANG Ting-Bo ZHOU Bo-Ru*

(State Key Laboratory of Tree Genetics and Breeding,Northeast Forestry University,Harbin 150040)

The HD-Zip transcription factor family is a kind of special protein in plant, playing crucial roles in plant development processes and abiotic stresses response. The protein family includes a highly conserved homeodomain(HD) and a leucine zipper domain(LZ), forming a special structural model. The HD-Zip transcription factor family, including 63 members, can be classified into 4 subfamilies HD-Zip Ⅰ, HD-Zip Ⅱ, HD-Zip Ⅲ and HD-Zip Ⅳ. RNA-Seq analysis of poplar roots, stems and leaves under salt stress was conducted for the differentially expressed genes in different tissues, and reveal the molecular mechanism of the response to stress environment. Therewere 25 HD-Zip genes down-regulated and 21 HD-Zip genes up-regulated in leaves under salt treatment, 42 genes down-regulated and 11 genes up-regulated in stems, and 26 genes down-regulated and 24 genes up-regulated in roots. According to gene annotations in Arabidopsis thaliana, the functions of HD-Zip transcription factor in poplarwere predicted.The conserved domains, structural characteristics and chemical properties of HD-Zip family members were also studied by bioinformatics, providing reference for gene functions of HD-Zip family in poplar.

HD-Zip transcription factor;abiotic stresses;growth and development;Populussimonii×P.nigra;bioinformatics

國家863課題資助(2013AA102701)

張雪梅(1991—)，女，碩士研究生，主要從事林木抗逆機理方面研究。

* 通信作者：E-mail:boruzhou@yahoo.com

2017-07-14

* Corresponding author：E-mail:boruzhou@yahoo.com

S722.3+6

A

10.7525/j.issn.1673-5102.2017.05.011