桑芽的組織快繁技術(shù)研究

劉松青，馮 鴻，祁偉亮，張 碩，阮 梅，龔壁燃，任迎虹

(成都師范學(xué)院 化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，四川 成都 611130)

桑芽的組織快繁技術(shù)研究

劉松青，馮 鴻，祁偉亮，張 碩，阮 梅，龔壁燃，任迎虹*

(成都師范學(xué)院 化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，四川 成都 611130)

不同物候期的莖段誘芽率不同，以夏季湖桑32的桑芽作為起始外植體。分別以MS和1/2MS培養(yǎng)基添加不同濃度的IBA、6-BA、2,4-D進(jìn)行桑芽分化和生根誘導(dǎo)，以探究最適桑芽增殖、生根的激素濃度組合以及活性炭對(duì)桑組培苗的褐化抑制作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：最佳叢芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基組合為6-BA 1.7 mg·L-1+ 2,4-D 0.03 mg·L-1+ IBA 0.05 mg·L-1，最佳誘導(dǎo)生根的IBA濃度為0.05 mg·L-1，活性炭添加的最佳濃度為1.5～2.0 mg·L-1，能有效控制褐化負(fù)面影響。煉苗過(guò)程中，長(zhǎng)勢(shì)良好的桑苗先進(jìn)行水培煉苗5～7 d后再移栽到土中，能提高組培苗的成活率。

桑芽；組織培養(yǎng)；活性炭；褐化現(xiàn)象

桑樹(shù)(MorusalbaL.)，桑科桑屬多年生雙子葉落葉喬木，具食用、藥用、材用及觀賞等多種利用價(jià)值，是一種重要的經(jīng)濟(jì)作物[1-3]。我國(guó)桑樹(shù)種質(zhì)資源豐富，但各種病蟲(chóng)害對(duì)其正常生長(zhǎng)發(fā)育、產(chǎn)量和質(zhì)量造成一定影響，成為制約蠶桑產(chǎn)業(yè)和桑樹(shù)生態(tài)產(chǎn)業(yè)發(fā)展的瓶頸問(wèn)題。脫毒培養(yǎng)是解決這一瓶頸的重要措施之一，而植物的脫毒技術(shù)與植物組織快繁技術(shù)是緊密結(jié)合在一起應(yīng)用的。1968年押金健吾等首次以?；ㄆ骱蜕８鶠橥庵搀w進(jìn)行組織培養(yǎng)，隨后又有以桑莖尖、桑(葉)冬芽、頂芽、側(cè)芽或腋芽、胚珠、花藥、愈傷組織相繼作外植體在無(wú)菌條件下進(jìn)行組織培養(yǎng)，經(jīng)初代培養(yǎng)、繼代增殖、采用1/2MS培養(yǎng)基添加0.25 mg·L-1吲哚丁酸(IBA)生根，大約一個(gè)月后誘導(dǎo)出莖段生根，幼芽培養(yǎng)11 d后觀察到生根，兩周后生根率基本接近100%，最后移栽而成功再生完整植株的報(bào)道[4-12]。在桑樹(shù)組培過(guò)程中，組培苗極易出現(xiàn)褐化現(xiàn)象，主要原因是褐變過(guò)程中，產(chǎn)生棕褐色醌類物質(zhì),當(dāng)擴(kuò)散到培養(yǎng)基后，就會(huì)抑制其酶的活性，以及外植體的生長(zhǎng)[13]?；钚蕴渴且环N吸附性較強(qiáng)的無(wú)機(jī)吸附劑，能夠抑制組培苗生長(zhǎng)和增殖組培中出現(xiàn)的褐化現(xiàn)象，使用濃度不宜過(guò)高，濃度越高，會(huì)抑制組培苗生長(zhǎng)[14-15]。此外，在過(guò)去對(duì)桑樹(shù)組織培養(yǎng)的研究中，可以發(fā)現(xiàn)，桑樹(shù)的組織培養(yǎng)中，關(guān)于激素種類及濃度的研究眾多，且相差不是很明顯，但總的來(lái)說(shuō)木本植物經(jīng)組織培養(yǎng)移栽成活的幾率相比草本植物而言普遍較低，另外，目前針對(duì)桑樹(shù)組培苗褐化研究的報(bào)道也相對(duì)較少，所以對(duì)其激素組合及褐化處理需要繼續(xù)研究[16-17]。

桑樹(shù)頂芽數(shù)量不多，但是可誘導(dǎo)出大量的不定叢芽，且誘導(dǎo)出的不定叢芽幾乎保留母本所有的優(yōu)良品質(zhì)，這十分利于植物組培苗的批量育種。本試驗(yàn)主要是剪取湖桑32的桑芽為外植體建立無(wú)菌體系，分別以MS和1/2MS培養(yǎng)基添加不同濃度的IBA、6-BA、2,4-D進(jìn)行桑芽分化和生根誘導(dǎo)，以探究最適桑芽增殖、生根的激素濃度組合以及活性炭對(duì)桑組培苗褐化程度的抑制作用。通過(guò)誘導(dǎo)、細(xì)胞分裂、生長(zhǎng)、增殖和分化，生根培養(yǎng)成完整植株，能夠加速桑樹(shù)良種的大面積快繁，減少病蟲(chóng)害對(duì)桑樹(shù)的生長(zhǎng)質(zhì)量及應(yīng)用的影響，為以后蠶桑經(jīng)濟(jì)和生態(tài)業(yè)的發(fā)展打下堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料與方法

1.1.1 實(shí)驗(yàn)材料

供試材料選擇成都師范學(xué)院實(shí)驗(yàn)基地中種植、長(zhǎng)勢(shì)良好、無(wú)病蟲(chóng)害優(yōu)良桑樹(shù)品種湖桑32的桑芽。

1.1.2 培養(yǎng)基

桑芽的叢芽誘導(dǎo)參照普通木本植物組織培養(yǎng)的方法[18]，以MS培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，附加不同濃度的細(xì)胞分裂素(6-Benzylaminopurine,6-BA)、2,4-二氯苯氧乙酸(2,4 -Dichlorophenoxyacetic acid，2,4-D)、吲哚丁酸(Indole butyric acid，IBA)等。桑樹(shù)組培苗生根，以1/2MS為基本培養(yǎng)基，附加不同濃度的生長(zhǎng)素(IBA)誘導(dǎo)。同時(shí)培養(yǎng)基中附加蔗糖30 g·L-1，瓊脂7 g·L-1，pH值調(diào)為5.8～5.9。

1.2 方法

1.2.1 無(wú)菌體系的建立

1)外植體剪取：選擇中午溫度相對(duì)較高時(shí)，剪切桑芽，此時(shí)外植體生長(zhǎng)旺盛，攜帶的病毒也相對(duì)更少。

2)消毒步驟：a.用洗衣粉進(jìn)行第一次外植體清洗；b.流水沖洗1 h將外植體表面洗凈；c.于超凈工作臺(tái)上75 %酒精處理1 min，并用無(wú)菌水洗凈三次；d.用5 %次氯酸鈉溶液處理10 min，再用無(wú)菌水清洗三次。

3)接種：將消毒后的桑芽接種到相應(yīng)的培養(yǎng)基中，并定期觀察記錄桑芽增值生長(zhǎng)情況。

1.2.2 分化培養(yǎng)基的篩選

采用MS基本培養(yǎng)基，利用正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)4因素3水平的正交表L9(34)，各因素、水平如表1。綜合確定不同濃度的6-BA (6-芐氨基嘌呤)、IBA (吲哚丁酸)、2,4-D (2,4-二氯苯氧乙酸)對(duì)桑芽誘導(dǎo)叢芽的影響，篩選出最佳培養(yǎng)激素組合。

表1桑芽分化正交試驗(yàn)

水平A6-BA濃度(mg·L-1)B2，4-D濃度(mg·L-1)CIBA濃度(mg·L-1)D空白11．20．010．05—21．50．020．10—31．70．030．15—

1.2.3 生根培養(yǎng)的最優(yōu)IBA濃度篩選

生根培養(yǎng)采用1/2MS培養(yǎng)基，參照YADAV的生根培養(yǎng)方法[19]，本實(shí)驗(yàn)當(dāng)中添加吲哚丁酸(IBA)濃度梯度為0.1 mg·L-1、0.5 mg·L-1、1.0 mg·L-1、1.5 mg·L-1、2.0 mg·L-1將培養(yǎng)。分化的桑芽(2 cm左右)，接種到不同的生根培養(yǎng)基中，每瓶接種5株，誘導(dǎo)不定根的產(chǎn)生，并觀察記錄生根時(shí)間，生根率，測(cè)量平均根數(shù)及平均根長(zhǎng)。

1.2.4 活性炭對(duì)桑芽褐化的影響

為確定不同濃度活性炭對(duì)桑組培苗褐化抑制作用，以叢芽誘導(dǎo)增值中褐化較嚴(yán)重的9號(hào)作為對(duì)照培養(yǎng)基，處理組中活性炭的濃度梯度設(shè)為1 g·L-1、1.5 g·L-1、2 g·L-1、2.5 g·L-1、3 g·L-1，并統(tǒng)計(jì)褐化率及褐化程度(褐化發(fā)生級(jí)別根據(jù)褐色的深淺。劃分為無(wú)或很淺、淺、中、較深、深5級(jí),分別用+、++等表示)，以期篩選出能有效抑制組培苗褐化的最佳活性炭濃度。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同激素配比及濃度組合對(duì)叢芽誘導(dǎo)增殖的影響

以MS培養(yǎng)基添加不同濃度的IBA、6-BA、2,4-D進(jìn)行桑芽分化研究，結(jié)果表明不同濃度激素組合對(duì)組織培養(yǎng)桑芽的生長(zhǎng)高度和增殖倍數(shù)影響較大(表2)。綜合來(lái)看，9號(hào)培養(yǎng)基的長(zhǎng)勢(shì)最好。芽高為3.4 cm，但褐化現(xiàn)象也最嚴(yán)重，2號(hào)3號(hào)，8號(hào)組合次之(圖1)。而2號(hào)組合培養(yǎng)基增殖倍數(shù)最高，3號(hào)、8號(hào)較好，其它的次之。

表2 不同激素配比及濃度組合對(duì)桑芽誘導(dǎo)的影響

圖1 8號(hào)和9號(hào)培養(yǎng)基的桑芽生長(zhǎng)情況

對(duì)表2中平均芽高進(jìn)行SPSS分析，結(jié)果表明，激素A、B、C三因素之間存在顯著差異(表3)。激素6-BA的三個(gè)水平中，A3的作用水平顯著(A3>A1>A2)；激素2,4-D的三個(gè)水平中，B3的作用水平顯著(B3>B2>B1)；激素IBA的三個(gè)水平中，C1的作用水平顯著(C1>C3>C2)。綜上所述，激素A、B、C三因素的最佳激素水平組合為A3B3C1，即最佳桑芽生長(zhǎng)的培養(yǎng)基組合為6-BA 1.7 mg·L-1+ 2,4-D 0.03 mg·L-1+ IBA 0.05 mg·L-1。

表3桑芽生長(zhǎng)高度的方差分析

激素種類水平1236-BA2．51b1．43c2．73a2，4-D1．83c2．28b2．57aIBA2．37a2．11c2．20b

對(duì)表2增值系數(shù)進(jìn)行SPSS分析，結(jié)果表明，激素A、B、C三因素之間存在顯著差異(表4)。在激素6-BA的三個(gè)水平中，A1的作用水平顯著，(A1>A3>A2)；在激素2,4-D的三個(gè)水平中，B2的作用水平顯著(B2>B3>B1)；在激素IBA的三個(gè)水平中，C3的作用水平顯著(C3>C2>C1)。綜上所述，激素A、B、C三因素的最佳激素水平組合為A1B2C3，即最佳桑芽增值的培養(yǎng)基組合為6-BA 1.2 mg·L-1+ 2,4-D 0.02 mg·L-1+ IBA 0.15 mg·L-1。

表4桑芽增值生長(zhǎng)的方差分析

激素種類水平1236-BA2．56a1．64c1．94b2，4-D1．88c2．27a1．98bIBA1．80c2．11b2．23a

2.2 不同IBA濃度對(duì)誘導(dǎo)生根的影響

3號(hào)培養(yǎng)基IBA濃度為1.0 mg·L-1時(shí)的生根率最高達(dá)到67%，誘導(dǎo)平均根數(shù)為7，平均根長(zhǎng)為6.8 cm(表5)，而其他培養(yǎng)基的生根率、平均根數(shù)、平均根長(zhǎng)均低于3號(hào)培養(yǎng)基(圖2)。綜上所述，生根培養(yǎng)基應(yīng)選用 3號(hào)培養(yǎng)基 1/2 MS + IBA 1.0 mg·L-1。

表5 生長(zhǎng)素濃度對(duì)桑芽生根影響

IBA濃度(mg/L)：a.1.0; b.1.5; c.2: d.2.5; e.3.0

2.3 活性炭對(duì)桑芽褐化的影響

活性炭對(duì)桑組培苗褐化有一定抑制作用，但是不同濃度活性炭的抑制作用差異不是很明顯，抑制作用從大到小依次是5>3>4>2>1。從褐化的程度來(lái)看，3號(hào)和5號(hào)褐化程度最輕，依次減輕的是2號(hào)和4號(hào)，1號(hào)褐化程度比較嚴(yán)重。研究發(fā)現(xiàn)，在一定范圍內(nèi)，隨著活性炭濃度的增加，褐化作用得到一定的抑制，但從生長(zhǎng)情況來(lái)看，活性炭濃度過(guò)高時(shí)，對(duì)組培苗的生長(zhǎng)產(chǎn)生一定的負(fù)效應(yīng)。綜合來(lái)看活性炭濃度在1.5～2.0 mg·L-1范圍內(nèi)的效果相對(duì)較好。

表6 活性炭對(duì)桑芽褐化影響統(tǒng)計(jì)表

活性碳濃度(mg/L)：a.1.0; b.1.5; c.2: d.2.5; e.3.0

3 小結(jié)與討論

3.1 外植體選擇和消毒

選擇4—9月的桑芽，可使增殖率提高。同時(shí)中午溫度相對(duì)更高，桑芽生長(zhǎng)旺盛，可以保證攜帶的病毒更少。而外植體的消毒滅菌方式在植物組培中至關(guān)重要，因此無(wú)菌體系的建立是植物組培的關(guān)鍵。曹偉等人通過(guò)實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)自來(lái)水沖洗15 min，酒精消毒0.5 min，5 %次氯酸鈉消毒7 min利于“龍桑一號(hào)”幼嫩的莖段的試管內(nèi)增殖[20]。李瑞雪等人用75 %的酒精消毒15 s后用0.1%氯化汞(HgCl2)溶液消毒10 min最佳，研究中也發(fā)現(xiàn)酒精和升汞具有較好的消毒效果[21]。但是，重金屬鹽殺菌劑氯化汞(HgCl2)是劇毒藥品，對(duì)人體和環(huán)境都有危害。相比之下，次氯酸鈉(NaClO)作用更溫和，但對(duì)材料的消毒不如氯化汞徹底。綜合考慮，本實(shí)驗(yàn)采用酒精與次氯酸鈉組合的消毒方式。

3.2 叢芽誘導(dǎo)增值

在桑芽誘導(dǎo)不定叢芽的階段，不同激素種類及濃度配比對(duì)桑芽增值生長(zhǎng)有不同影響，細(xì)胞分裂素能促進(jìn)細(xì)胞分裂增長(zhǎng)，誘導(dǎo)桑芽的分化，生長(zhǎng)素促進(jìn)細(xì)胞伸長(zhǎng)生長(zhǎng)，當(dāng)細(xì)胞分裂素與生長(zhǎng)素比值高時(shí)，能促進(jìn)桑芽生長(zhǎng)[22]。仝愛(ài)群、李瑞雪等人試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)6-BA、2,4-D 的濃度對(duì)組織培養(yǎng)桑芽分化均存在顯著差異；劉佳試驗(yàn)得出經(jīng)6-BA處理的增殖系數(shù)始終高于TDZ；本實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析得出6-BA、2,4-D、IBA對(duì)桑芽叢芽誘導(dǎo)增殖生長(zhǎng)都有顯著影響，選用6-BA 1.7 mg·L-1+ 2,4-D 0.03 mg·L-1+ IBA 0.05 mg·L-1激素的組合，桑芽的叢芽誘導(dǎo)增值倍數(shù)效果最好，而6-BA 1.2 mg·L-1+ 2,4-D 0.02 mg·L-1+ IBA 0.15 mg·L-1激素組合的培養(yǎng)基對(duì)桑芽誘導(dǎo)的生長(zhǎng)最有利。桑芽接種一個(gè)周左右，可以觀察到兩片幼葉開(kāi)始展開(kāi)，實(shí)驗(yàn)中2號(hào)、3號(hào)、8號(hào)、9號(hào)培養(yǎng)基中葉片生長(zhǎng)較健壯，1號(hào)、4號(hào)培養(yǎng)基次之，而實(shí)驗(yàn)5號(hào)、6號(hào)、7號(hào)培養(yǎng)基中的葉片普遍較小，但總體來(lái)看，基本上都沒(méi)有出現(xiàn)葉片蜷縮的不良現(xiàn)象。另在試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，3號(hào)、8號(hào)以及9號(hào)培養(yǎng)基中的組培苗出現(xiàn)了生根現(xiàn)象且褐化相對(duì)嚴(yán)重，這說(shuō)明，當(dāng)細(xì)胞分裂素與生長(zhǎng)素增加到一定濃度時(shí)，可以同時(shí)實(shí)驗(yàn)分化和生根的誘導(dǎo)，細(xì)胞分裂素過(guò)高時(shí)，更易出現(xiàn)褐變，這與劉佳等人的研究發(fā)現(xiàn)相似。

3.3 生根培養(yǎng)

桑芽組織培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)中，生根較難，王琳等探究了桑芽在各種不同生根培養(yǎng)基中的生根情況，選擇出1/2 MS + 0.10 mg·L-1NAA作為桑芽組培苗的最佳生根培養(yǎng)基[23]；楊金福等人以1/2 MS+1 mg·L-1IBA 或 1/4 MS + 1 mg·L-1IBA 為基本培養(yǎng)基進(jìn)行生根培養(yǎng)，生根率可達(dá)到98%[24]；仝愛(ài)群用不同濃度NAA對(duì)桑組培苗進(jìn)行生根誘導(dǎo)，最少生根數(shù)為3，其余普遍根數(shù)在3.6～3.8；劉佳通過(guò)實(shí)驗(yàn)IBA濃度為0.6 mg·L-1時(shí)，生根率接近90%，生根效果好[25]。而本實(shí)驗(yàn)選擇生長(zhǎng)培養(yǎng)基中生長(zhǎng)狀況良好的桑芽用于生根培養(yǎng)，1/2MS 添加不同濃度IBA，最早11 d左右就可以觀察到生根發(fā)生，其中，對(duì)誘導(dǎo)生根的最佳培養(yǎng)基是3號(hào)IBA濃度為1.0 mg·L-1，生根率達(dá)到67%，平均根數(shù)為7，平均根長(zhǎng)6.8 cm,根系粗壯且長(zhǎng)，葉片生長(zhǎng)正常。從結(jié)果可看出，使用IBA的誘導(dǎo)生根率不如前人，但從誘導(dǎo)根數(shù)、根長(zhǎng)以及根的生長(zhǎng)情況來(lái)看，本實(shí)驗(yàn)效果更佳。5號(hào)培養(yǎng)基中IBA濃度為2.0 mg·L-1，誘導(dǎo)桑芽生根較差，而在前人研究中也發(fā)現(xiàn)NAA與IBA在濃度大于0.8 mg·L-1時(shí)，生根誘導(dǎo)能力會(huì)出現(xiàn)一定的下降，所以推測(cè)IBA濃度過(guò)高時(shí)，對(duì)桑芽生根的誘導(dǎo)能力會(huì)相對(duì)減弱。

3.4 活性炭對(duì)褐化的抑制作用

木本植物的組織培養(yǎng)中很容易出現(xiàn)褐化現(xiàn)象?；钚蕴繉?duì)褐化有抑制作用，但長(zhǎng)時(shí)間高濃度處理也會(huì)抑制生長(zhǎng)和增殖；李萍等研究發(fā)現(xiàn)木本植物牡丹在進(jìn)行活性炭2.0 g·L-1的4 d短期處理，不僅能抑制褐化，還能促進(jìn)增殖生長(zhǎng)；不同濃度的活性炭對(duì)桑組培苗的褐化抑制作用不同，從本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果來(lái)看，其中最好的是3號(hào)和5號(hào)，即2 g·L-1和3 g·L-1的活性炭作用相對(duì)較好。同時(shí)，活性炭在抑制桑芽褐化時(shí)也會(huì)對(duì)其增殖分化產(chǎn)生一定負(fù)效應(yīng)，可以看到5號(hào)3 g·L-1濃度的負(fù)效應(yīng)最明顯。綜合比較褐化情況和生長(zhǎng)情況，培養(yǎng)基中活性炭濃度在1.5-2.0 g·L-1為最佳選擇。另外，褐化程度與培養(yǎng)基的軟硬程度，消毒方式、光照時(shí)間、轉(zhuǎn)接時(shí)間，外植體材料的選擇等都有一定關(guān)系，但在選擇時(shí)，應(yīng)考慮經(jīng)濟(jì)與簡(jiǎn)便性，同時(shí)不同褐化劑對(duì)褐化的具體抑制機(jī)理等研究還較少見(jiàn)報(bào)道，有待在后續(xù)的試驗(yàn)中進(jìn)一步加以探究。

3.5 煉苗移栽

邱璐研究報(bào)道提出，煉苗時(shí)用1/2珍珠巖加1/2腐殖土，解決了營(yíng)養(yǎng)、透氣、保水問(wèn)題，煉苗效果最好[26]。相關(guān)研究中也提到，不同基質(zhì)中純沙和泥沙、珍珠巖體積比為1∶1∶1時(shí)最利于桑苗植株的生長(zhǎng),純沙與泥、沙、珍珠巖體積比為1∶1∶1時(shí)，兩種基質(zhì)可顯著促進(jìn)根重增長(zhǎng)[27]；本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)通過(guò)水培法，將組培桑苗先在水中培養(yǎng)5～7 d后，再移栽到土中，成活率100%，通過(guò)該方法可以大大節(jié)省組培的成本。

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ResearchonTissueCultureofMulberryBuds

Liu Songqing,Feng Hong,Qi Weiliang,Zhang Shuo,Ruan Mei,Gong Biran,Ren Yinghong*

( College of Chemistry and Life Science，Chengdu Normal University，Chengdu 611130，China)

The stem germination numbers varied with seasons,and the stems in summer were suitable as explants.With young stem segment of mulberry bud of Husang32 as explants,mulberry buds and root induction were studied on MS and 1/2MS basal medium supplemented with different hormone combinations including BA and 6-BA,2,4-D ,respectively.The results suggested that optimum combination of 6-BA 1.7 mg·L-1+ 2,4-D 0.03 mg·L-1+ IBA 0.05 mg·L-1could markedly enhance the formation of mulberry buds induction rate.The optimal concentration of IBA 0.05 mg·L-1is beneficial to shoot induction.Activated carbon dosage could markedly affect the phenomenon of material browning.In the process of acclimatization,culturing for five to six days in water before transplanting in soil could improve the survival rate.

mulberry buds；issue culture；activated carbon；browning

10.3969/j.issn.1006-9690.2017.05.010

2017-02-16

四川省科技廳應(yīng)用基礎(chǔ)項(xiàng)目(2015JY0144)； 四川省教育廳創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)項(xiàng)目(15TD0036 )；成都師范學(xué)院科研項(xiàng)目(CS14CX03)。

劉松青(1969—)，男，博士，副教授，研究方向：微生物資源與生物技術(shù)。E-mail:biosq@126.com

*通訊作者：任迎虹(1964—)，女，教授，研究方向：植物遺傳育種。E-mail: renyinghong@163.com

S888.3

A

1006-9690(2017)05-0040-05