超聲波處理對微囊藻群體光合活性和沉降過程的影響*

譚 嘯，段志鵬，李聶貴，孫玉童，戴凱文，朱 峰

(1：河海大學淺水湖泊綜合治理與資源開發(fā)教育部重點實驗室，河海大學環(huán)境學院，南京 210098)(2：水利部南京水利水文自動化研究所，南京 210012)

超聲波處理對微囊藻群體光合活性和沉降過程的影響*

譚 嘯1，段志鵬1，李聶貴2，孫玉童1，戴凱文1，朱 峰1

(1：河海大學淺水湖泊綜合治理與資源開發(fā)教育部重點實驗室，河海大學環(huán)境學院，南京 210098)(2：水利部南京水利水文自動化研究所，南京 210012)

關(guān)注微囊藻群體在超聲處理下光合活性變化及超聲解除后的浮力恢復情況，可以為超聲波控藻技術(shù)提供理論依據(jù)和數(shù)據(jù)支撐，具有重要的實踐意義. 本研究采用處理后水柱中葉綠素a濃度的垂向分布比例和葉綠素熒光變化情況分析微囊藻群體在超聲波處理下的光合活性變化和沉降過程. 結(jié)果表明，適量的超聲處理(35 kHz、0.0353 W/cm3)能在避免破裂藻細胞的同時，顯著抑制其光合活性；60 s的處理造成了45.5%的光合活性被抑制. 然而，在適宜生長條件下，所有實驗組藻細胞中受抑制的光合活性均在24 h內(nèi)恢復至對照組的80%左右. 此外，在上述超聲條件下，5 s的超聲處理能使水柱中葉綠素a濃度在短時間內(nèi)(0.5 h)的去除率達79.5%. 然而，當處理時間小于30 s時，大于90%的沉降藻細胞可在超聲解除后的72 h內(nèi)恢復浮力上??；而當處理時間延長至60 s以后，藻細胞基本喪失了上浮能力. 通過分析發(fā)現(xiàn)，超聲處理后微囊藻群體的粒徑分布對藻細胞沉降及上浮過程起決定性作用，并且還發(fā)現(xiàn)微囊藻群體在超聲處理時首先表現(xiàn)為藻細胞失去浮力下沉和光合系統(tǒng)受損，進而發(fā)生大群體振散.

超聲處理；微囊藻群體；葉綠素a；光合活性；沉降；上浮

面對藍藻水華頻繁暴發(fā)的世界性難題，各國均在努力探索治理方法. 目前，控制藍藻水華的方法主要有化學藥劑殺藻、混凝劑沉降、營養(yǎng)鹽控制和生物操縱抑制等[1-3]. 同時，一些新興除藻技術(shù)也應運而生. 近十多年來超聲波控藻技術(shù)受到關(guān)注，并被認為具備良好前景[4-6]. 超聲波在水介質(zhì)產(chǎn)生的“空化效應”、微射流和自由基，可使藻細胞造成機械和聲化學損害[7-8]. 首先，超聲處理能夠直接破壞藻類光合系統(tǒng)，降低其光合活性. 研究表明銅綠微囊藻(Microcystisaeruginosa)在超聲處理下，其光合系統(tǒng)將產(chǎn)生瞬時危害[9]. 這可能是因為藍藻細胞體內(nèi)的光合色素遭到了破壞，從而光合活性降低[10]. 然而，現(xiàn)有研究多基于實驗室培養(yǎng)的單細胞銅綠微囊藻，而微囊藻群體因細胞內(nèi)不同光合色素含量的差異使得其最大光能轉(zhuǎn)化效率比單胞微囊藻高出2.32～2.41倍[11]. 這種差異或許會影響微囊藻群體對超聲波的響應差異. 此外，超聲處理解除后藻類生理變化情況也同樣值得關(guān)注，然而目前對超聲處理后的藻細胞活性恢復過程的研究較少. 因此有必要進一步研究微囊藻群體在超聲波處理下光合活性的變化及超聲解除后的恢復情況. 另外，超聲波能夠通過破壞藍藻細胞內(nèi)的偽空胞來實現(xiàn)沉降控藻. 研究發(fā)現(xiàn)，在28 kHz、120 W的超聲條件下，偽空胞在僅3 s的超聲處理后即發(fā)生破裂，迫使80%的藻細胞發(fā)生沉降[9]. 然而，經(jīng)超聲破碎的偽空胞結(jié)構(gòu)在適宜的條件下能夠重新恢復. Rodriguez-Molares等[12]定量檢測了超聲處理對銅綠微囊藻的沉降作用，分析了偽空胞的再生過程. 此外，微囊藻群體的粒徑要比單細胞微囊藻大很多倍，根據(jù)斯托克斯公式：v=[2(ρ-ρ0)r2/9η]·g(v為顆粒遷移速率，ρ和ρ0分別為顆粒與介質(zhì)的密度，r為顆粒半徑，η為介質(zhì)的粘滯系數(shù)，g為重力加速度)，藻類粒徑的平方與其在靜水中垂向遷移速率呈正相關(guān)[12]. 因此以微囊藻群體為對象，研究其在超聲處理時的沉降過程及超聲解除后的浮力恢復過程具有重要實踐意義，可以提高超聲控藻的徹底性和針對性.

圖1 超聲裝置示意圖Fig.1 Ultrasonic device

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 微囊藻群體 2015年7月3日，采集太湖梅梁灣(31°24′N, 120°13′E)水下0.5 m處的藻樣，過0.15 mm孔徑的篩網(wǎng)，選取留在篩網(wǎng)上的大群體微囊藻，鏡檢發(fā)現(xiàn)大群體微囊藻以銅綠微囊藻為主. 采用篩選后的微囊藻配制藻細胞懸液用于實驗(藻懸液的葉綠素a濃度為1.18 μg/ml).

1.1.2 超聲裝置 采用的小型超聲發(fā)生裝置見圖1，頻率設定為35 kHz, 溫度維持在25℃. 超聲強度采用Mason等[13]使用的熱量法測定. 即200 ml蒸餾水置于400 ml燒杯中，持續(xù)超聲5 min，分別在0、1、2、3、4和5 min時測定水溫. 每個數(shù)值測量3次并計算平均值，超聲強度計算公式為：

(1)

UI=P/V

(2)

式中，P為輸入功率(W)，UI為超聲強度(W/cm3)，V為溶液體積(ml)，T為溫度(℃)，t為超聲處理時間(s)，Cp為常壓下25℃時水的比熱容(4.18 J/(kg·K))，M為水的質(zhì)量(kg). 通過計算，該裝置的超聲強度為0.0353 W/cm3.

1.2 實驗方法

1.2.1 超聲處理及培養(yǎng) 本研究控制超聲處理時間和處理后的培養(yǎng)時間2個變量. 分別取200 ml上述藻懸液置于400 ml燒杯中，超聲處理5、30、60、300 s，另外設置空白對照組. 隨后將藻樣轉(zhuǎn)至玻璃試管中，置于光照培養(yǎng)箱內(nèi)靜置培養(yǎng)96 h. 培養(yǎng)光強為30 μmol (photons)/(m2·s)，溫度為25℃，光暗比為12 h∶12 h. 以上每個處理設置3個平行.

1.2.2 光合活性測定 藻類活體葉綠素熒光通常用來表征藻類光合活性，經(jīng)過暗適應的藻細胞在低強度測量光條件下會發(fā)出初始熒光Fo，經(jīng)過飽和脈沖高光強后發(fā)出最大熒光Fm，隨后計算Fv/Fm = (Fm-Fo)/Fm. 該比值表示光系統(tǒng)Ⅱ原初反應的最大量子產(chǎn)率，即原初反應的最大光化學效率[14]. 本研究采用Fv/Fm表征藻細胞的光合活性. 分別取培養(yǎng)0、1、3、6、24、48、72、96 h后藻懸液2 ml，暗適應20 min，采用AquaPen-C AP-C 100葉綠素熒光儀(飽和脈沖光強為3200 μmol (photons)/(m2·s))測定藻細胞葉綠素a熒光，并計算Fv/Fm.

1.2.3 葉綠素a濃度測定 胞內(nèi)葉綠素a濃度參照《水和廢水監(jiān)測分析方法》[15]進行測定. 分別取培養(yǎng)0、0.5、24、48、72、96 h后的藻懸液測定其葉綠素a濃度. 其中培養(yǎng)0 h的樣品為超聲處理搖勻后即時測定；而其余藻樣采取分層測定，即取上層45 ml藻懸液作為懸浮或漂浮藻細胞葉綠素a濃度，底層5 ml藻液作為沉降藻細胞葉綠素a濃度. 計算葉綠素a濃度垂直分布比例. 此外，采用光學顯微鏡根據(jù)Reynolds 等[16]的方法對超聲處理前后及恢復培養(yǎng)過程中藻細胞濃度進行檢測.

1.3 數(shù)據(jù)分析

文中數(shù)據(jù)均以3次平行實驗的平均值和標準差表示. 采用SPSS 19.0軟件對不同超聲處理時間和培養(yǎng)時間的實驗結(jié)果的差異顯著性進行單因素方差分析(One-way ANOVA)，顯著性水平設為P<0.05.

2 結(jié)果

2.1 超聲處理對微囊藻群體光合活性的瞬時抑制作用

藻細胞光合活性隨處理時間延長而快速降低，其中超聲處理60 s和300 s的藻細胞光合活性分別降低了45.5%和62.8%(圖2). 此外，當超聲處理時間少于60 s時，胞內(nèi)葉綠素a濃度沒有發(fā)生明顯變化. 而處理時間延長至300 s，胞內(nèi)葉綠素a濃度下降了22.1%.

2.2 光合活性恢復過程

對照組的光合活性在培養(yǎng)過程中波動很小(Fv/Fm為0.55左右). 而超聲處理5 s的藻細胞光合活性相對于對照組降低了20%左右，且在培養(yǎng)96 h內(nèi)沒有恢復至對照組水平. 其余實驗組中，藻細胞受抑制的光合活性能在24 h內(nèi)快速恢復至超聲處理5 s的水平(圖3).

圖2 不同超聲處理時間對微囊藻群體光合活性和葉綠素a濃度的影響(*表示在P<0.05水平差異顯著)Fig.2 Instant damages to Microcystis colonies indicated by photosynthetic activities and chlorophyll-a concentration under ultrasound treatment for different time (* indicated the significant level of P<0.05)

圖3 不同超聲處理時間后微囊藻群體光合活性的恢復情況Fig.3 Effect of different exposure time on the recovery process of photosynthetic activities of Microcystis colonies

2.3 超聲處理后微囊藻群體下沉與上浮過程

在實驗過程中，對照組的絕大多數(shù)藻細胞漂浮或懸浮在水柱中(圖4). 對超聲處理組而言，短時間(0.5 h)培養(yǎng)后，水柱中葉綠素a去除率隨處理時間的延長而逐漸降低，且去除率最大的為5 s超聲組(79.5%). 然而，恢復培養(yǎng)至72 h，5 s或30 s超聲處理組的藻細胞又大量(超過90%)恢復浮力處于懸浮或漂浮狀態(tài)，而經(jīng)60 s和300 s超聲處理的藻細胞則徹底喪失了上浮能力.

圖4 不同超聲處理時間對微囊藻群體沉降及浮力恢復過程的影響Fig.4 Effect of different exposure time on the sedimentation character of Microcystis colonies and their recovery processes of floatation

圖5 不同超聲處理時間對微囊藻細胞生長的抑制作用Fig.5 Effect of different exposure time on the growth of Microcystis cells

不同超聲處理時間對微囊藻細胞生長的抑制作用可知，超聲處理60 s時能在不造成藻細胞瞬時破碎的情況下抑制藻細胞生長; 而超聲處理300 s可能造成了藻細胞瞬時破裂，使得整個培養(yǎng)過程中藻細胞濃度持續(xù)降低(圖5).

3 討論

3.1 光合活性的瞬時抑制

高等植物和藻類進行光合作用時，光合系統(tǒng)的捕光色素復合體首先捕獲光量子后被激發(fā). 在PSⅡ處于開放狀態(tài)時，激發(fā)后的能量大部分傳遞到反應中心用于光化學反應和驅(qū)動電子傳遞鏈，小部分以熒光和熱能散失. 當PSⅡ受損時，傳遞到反應中心的能量就會降低，根據(jù)能量守恒定律，此時以熒光和熱散失的能量就會上升. 因此通過測定葉綠素熒光可以監(jiān)測PSⅡ的反應情況，可表征藻細胞光合活性[14]. 通過實驗發(fā)現(xiàn)超聲處理在僅導致少量葉綠素a濃度降低時，微囊藻水華的光合活性就受到明顯抑制(圖2). 在35 kHz，0.0353 W/cm3的超聲條件下，處理60 s和300 s分別導致葉綠素a濃度下降了0.7%和22.1%；而光合活性抑制率分別達到45.5%和62.8%. 這說明在該條件下，60 s的超聲處理在基本不破壞藻細胞的同時顯著抑制其光合活性，而300 s的處理導致超過1/5的藻細胞發(fā)生破裂. Zhang等[10]采用25 kHz，0.32 W/cm3的超聲裝置，對250 ml銅綠微囊藻懸液超聲處理300 s, 結(jié)果發(fā)現(xiàn)葉綠素a濃度、藻藍素濃度和光合放氧率分別降低了21.3%、44.8%和40.5%，與本研究取得相近的藻細胞抑制效果. 但Zhang等[10]采用了大約是本研究9倍的超聲強度，這說明超聲處理對微囊藻群體的抑制作用比室內(nèi)培養(yǎng)的單細胞微囊藻要劇烈得多. 以下兩個原因或許可以解釋這種差異：1)水體中含有多種藻類，不同種屬對超聲波的敏感程度不同. Purcell等[17]發(fā)現(xiàn)同等超聲條件下，絲狀藍藻——水華束絲藻(Aphanizomenonflos-aquae)的去除率為99%，顯著高于單細胞銅綠微囊藻(去除率為16%). Rajasekhar等[18]也有類似發(fā)現(xiàn)，相對銅綠微囊藻而言，卷曲魚腥藻(Anabaenacircinalis)更容易被超聲波破壞. 此外，野外超聲控藻發(fā)現(xiàn)超聲波能夠選擇性地抑制水華藍藻生長[19]. 2)相同藻種在野外和室內(nèi)培養(yǎng)下存在形態(tài)和生理差異. 微囊藻的群體形態(tài)和偽空胞結(jié)構(gòu)對超聲波的“空化效應”極其敏感，即使超聲處理沒有破碎細胞，也會將群體打散或者使偽空胞破裂.

3.2 光合活性恢復

進一步研究發(fā)現(xiàn)，大部分受超聲波抑制的光合活性能夠在較短時間內(nèi)恢復(圖3). 超聲處理30、60、300 s后光合活性分別在培養(yǎng)至1、3、24 h時恢復至對照組的80%左右(圖3). 而處理5 s的藻細胞在培養(yǎng)期間光合活性均維持在對照組的80%左右，沒有表現(xiàn)出明顯的恢復階段. 這說明超聲處理時間在5～300 s期間可能至少發(fā)生了兩種完全不同的光合抑制機制. 為便于分析，將超聲處理5 s對微囊藻群體光合活性的抑制作用稱為“瞬時超聲光合活性抑制(Instant ultrasonic inhibition of photosynthetic activity；IUI-PA)”. 這可以解釋為部分光合系統(tǒng)Ⅱ的結(jié)構(gòu)性受損而導致的抑制作用. 首先，超聲處理破壞了藍藻細胞內(nèi)捕光色素復合體——藻膽體. 藻膽體是附著在類囊體膜上，具有光能量吸收和傳遞的功能單位，其捕獲光量子后傳遞到類囊體膜上的反應中心，驅(qū)動光合系統(tǒng)運行[20]. 而藻膽體主要由藻膽蛋白組成，該蛋白在結(jié)構(gòu)上為“空心棒狀”，與偽空胞具有類似的空心結(jié)構(gòu)[21-22]，因此更容易在“空化效應”中迅速破損，降低光能利用效率[10]. 其次，有研究發(fā)現(xiàn)，超聲處理能夠造成類囊體片層斷裂和部分藻膽體從類囊體膜上脫落，導致電子傳遞鏈受阻，降低光合效率[23]. 從本研究實驗結(jié)果可知，IUI-PA在短時間超聲處理內(nèi)發(fā)生，需要較長時間恢復甚至不可逆轉(zhuǎn). 另外，能夠快速恢復的抑制稱為“可恢復超聲光合活性抑制(Renewable ultrasonic inhibition of photosynthetic activity；RUI-PA)”. RUI-PA或許與細胞膜或內(nèi)囊體膜通透性的改變有關(guān)，Tang等[24]發(fā)現(xiàn)超聲“空化效應”產(chǎn)生的自由基能夠增加膜的通透性.

圖6不同時間超聲處理后微囊藻群體的粒徑分布Fig.6 Effect of different exposure time on size distribution of Microcystis colonies

3.3 超聲處理過程中的群體粒徑變化

微囊藻群體在超聲處理后的下沉和上浮過程顯示，超聲處理后靜置培養(yǎng)0.5 h后，5 s超聲處理組的葉綠素a濃度去除率最大(為79.5%)，隨著超聲處理時間的延長，葉綠素a濃度的去除率(即藻細胞沉降速率)顯著降低(圖4). 為進一步分析產(chǎn)生該結(jié)果的原因，參考Li等[25]的方法分析超聲處理對群體粒徑的影響. 結(jié)果顯示，經(jīng)5 s超聲處理的微囊藻群體粒徑分布與未處理的微囊藻群體相近，分布范圍分別為180～1000 μm(占總生物量的71%)和200～1000 μm(占總生物量的82%). 而隨著超聲處理時間的延長，超聲能量的持續(xù)輸入使得微囊藻大群體逐漸被振散為小群體或單細胞. 超聲處理300 s后，微囊藻群體粒徑主要分布在3～22 μm(占總生物量的94%)(圖6). 有研究表明，在靜水條件下，微囊藻群體的垂向遷移速率與群體粒徑的平方呈顯著正相關(guān)[26]. 因此實驗組中經(jīng)5 s超聲處理后藻樣葉綠素a濃度下降最快，且隨著超聲處理時間延長，葉綠素a濃度的去除速率顯著降低. 此外，微囊藻群體粒徑分布也說明在超聲場中藻細胞的偽空胞破裂發(fā)生在大量群體振散之前. Lee等[9]發(fā)現(xiàn)僅3 s的超聲處理就能造成偽空胞破裂，導致80%的藻細胞沉降.

Rodriguez-Molares等[12]在分析超聲處理對室內(nèi)培養(yǎng)銅綠微囊藻的沉降和偽空胞再生過程時發(fā)現(xiàn)破裂的偽空胞能在24 h內(nèi)重新形成，但在恢復培養(yǎng)的1周內(nèi)藻細胞未能獲得浮力上浮; 偽空胞的重新恢復是破裂的偽空胞被同化以及新偽空胞的形成過程; 短時間內(nèi)新形成的偽空胞在結(jié)構(gòu)上和原有的偽空胞存在較大差異. 因此，即使偽空胞得以形成，藻細胞依然無法獲得足夠的浮力上浮. 而在本研究中，經(jīng)5 s或30 s超聲處理的微囊藻群體在培養(yǎng)72 h后又大量恢復浮力上浮(圖4). 存在這種差異的原因可能主要是微囊藻水華與室內(nèi)培養(yǎng)的微囊藻在形態(tài)結(jié)構(gòu)和偽空胞數(shù)量上有明顯差異. 所以，超聲處理后野外微囊藻水華的浮力恢復過程更快.

此外，在本研究中，經(jīng)60 s或300 s超聲處理后的藻細胞在整個培養(yǎng)過程中未能大量恢復浮力上浮(圖 4). 并且培養(yǎng)至96 h時，各實驗組的微囊藻細胞濃度均顯著下降(圖5)，說明長時間(大于60 s)的超聲處理對藻細胞損傷極大，出現(xiàn)大量衰亡，甚至會導致細胞破裂. Li等[27]將微囊藻群體經(jīng)超聲處理后(20～1100 kHz，30 W，360 s)，在BG11中繼續(xù)培養(yǎng)，120 h內(nèi)未發(fā)現(xiàn)微囊藻群體恢復浮力上浮. 因此，本研究的超聲條件(35 kHz，0.0353 W/cm3)60 s的處理基本上能使微囊藻群體喪失上浮能力，同時保證了細胞完整性，避免了藻細胞破裂使水質(zhì)惡化. 如果使用60 s的間歇式多次超聲處理就可以徹底使水華下沉，就能實現(xiàn)超聲波控藻的安全環(huán)保，節(jié)能高效.

4 結(jié)論

1)本研究的超聲條件下(35 kHz，0.0353 W/cm3)，短時間(小于30 s)的超聲處理能顯著抑制微囊藻群體的光合活性，但超聲解除后光合活性得到恢復.

2)小于60 s的超聲處理后，微囊藻群體的胞內(nèi)葉綠素a濃度沒有明顯變化，不會造成藻細胞破裂. 而較長時間的處理(大于300 s)使胞內(nèi)葉綠素a濃度降低了22.1%，會導致藻細胞明顯破裂. 小于30 s的超聲處理后，下沉的藻細胞能在72 h的恢復培養(yǎng)過程中大量恢復浮力上浮，而經(jīng)過60 s超聲處理后，藻細胞基本喪失上浮能力.

3)使用60 s的間歇式多次超聲處理可以徹底使水華下沉，又避免了藻細胞破裂使水質(zhì)惡化.

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EffectsofultrasoundonphotosyntheticactivityandsinkingprocessofMicrocystiscolonies

TAN Xiao1, DUAN Zhipeng1, LI Niegui2, SUN Yutong1, DAI Kaiwen1& ZHU Feng1

(1:KeyLaboratoryofIntegratedRegulationandResourceDevelopmentonShallowLakeofMinistryofEducation,CollegeofEnvironment,HohaiUniversity,Nanjing210098,P.R.China)(2:NanjingAutomationInstituteofWaterConservancyandHydrology,Nanjing210012,P.R.China)

Studies on damages in photosynthetic activities ofMicrocystiscolonies and effect on their sinking process induced by ultrasound merited are of important practical value, which could provide powerful support for the promotion of ultrasound application in dealing with cyanobaterial blooms. Therefore, these processes have been assessed according to changes of chlorophyll-a (Chl.a) fluorescence and the vertical distribution of the Chl.a content in water column, respectively. Results showed that appropriate ultrasound parameters (35 kHz, 0.0353 W/cm3) did not disrupted algal cells, but significantly inhibited their photosynthetic activities. For example, the photosynthetic activities ofMicrocystiscolonies treated for 60 s had been inhibited by 45.5%. However, the inhibited photosynthetic activities of all treated algae were recovered approximately to 80% of the control within 24 h of culture after treatment. The maximal removal rate of Chl.a from raw water (79.5%) was obtained at 5 s of sonication when cultivation time was up to 0.5 h. More than 90% of algal cells that had been treated for 30 s and then sank to the bottom, resuspended or refloated after 72 h of the culture. However, algal cells treated for 60 s did not refloat during the experiment period (96 h). Changes of colony size played a key role in the sedimentation character during ultrasonication and the recovery process of buoyancy after exposure. Furthermore, whenMicrocystiscolonies were exposed to ultrasound, gas vesicles and photosynthesis pigment were damaged firstly, which followed by the declumping of cyanobacteria markedly.

Ultrasonic treatment;Microcystiscolonies; chlorophyll-a; photosynthetic activity; sedimentation; resuspension

*國家自然科學基金項目(31470507)、中央高?？蒲袠I(yè)務費項目(2013B32414)、江蘇省優(yōu)勢學科平臺(PAPD)和品牌專業(yè)項目(TAPP)聯(lián)合資助. 2016-07-25收稿；2016-10-09收修改稿. 譚嘯(1980～)，男，博士，副教授；E-mail: biotan@163.com.