苦瓜素Ⅰ對亞洲玉米螟幼蟲酚氧化酶活性的抑制作用

方 月，朱春亞，曹 溪，郭子俊，凌 冰

(華南農(nóng)業(yè)大學昆蟲學系，廣東省生物農(nóng)藥創(chuàng)制與應(yīng)用重點實驗室，廣州 510642)

苦瓜素Ⅰ對亞洲玉米螟幼蟲酚氧化酶活性的抑制作用

方 月，朱春亞，曹 溪，郭子俊，凌 冰*

(華南農(nóng)業(yè)大學昆蟲學系，廣東省生物農(nóng)藥創(chuàng)制與應(yīng)用重點實驗室，廣州 510642)

為了探討苦瓜素類化合物抑制昆蟲生長發(fā)育的作用機制，測定了苦瓜葉乙酸乙酯萃取物和苦瓜素Ⅰ對亞洲玉米螟Ostriniafurnacalis幼蟲體內(nèi)酚氧化酶活性的抑制作用以及苦瓜素Ⅰ、苦瓜素Ⅱ和苦瓜皂苷元L對亞洲玉米螟幼蟲離體酚氧化酶活性的抑制作用。結(jié)果表明，苦瓜葉乙酸乙酯萃取物和苦瓜素Ⅰ均能明顯抑制亞洲玉米螟幼蟲酚氧化酶的活性。用含有不同濃度苦瓜葉乙酸乙酯萃取物和苦瓜素I的人工飼料飼喂亞洲玉米螟3齡幼蟲48 h后，苦瓜葉乙酸乙酯萃取物和苦瓜素Ⅰ對亞洲玉米螟幼蟲體內(nèi)酚氧化酶活性的抑制中濃度IC50分別為0.17%和0.34%?？喙纤丌窈涂喙纤丌?qū)喼抻衩酌x體酚氧化酶的活力也表現(xiàn)出明顯的抑制作用，抑制中濃度IC50分別為169.28 μg/mL和1182.08 μg/mL?？喙纤豂的抑制作用明顯強于苦瓜素Ⅱ。苦瓜葉提取物及其活性成分苦瓜素Ⅰ對亞洲玉米螟幼蟲酚氧化酶活性的抑制作用可能是其抑制昆蟲生長發(fā)育的主要機制之一。

亞洲玉米螟；酚氧化酶；苦瓜素Ⅰ；抑制作用

苦瓜Momordicacharantia屬于葫蘆科植物，廣泛分布于熱帶非洲和亞洲(Groveretal., 2004; Subrattyetal., 2005)?？喙显谖覈且环N常見蔬菜，其果實營養(yǎng)豐富且具保健功能，越來越受到人們的喜愛。不僅如此，苦瓜葉片中還含有大量的、對多種農(nóng)業(yè)害蟲有明顯拒食、抑制生長發(fā)育和毒殺作用的次生代謝物質(zhì)(Chandravadanaetal., 1983；Yasuietal., 1998；Abeetal., 2000；李紹勤等，2001；凌冰等，2009)。其中，苦瓜素(momordicines)是從苦瓜葉片提取物中分離到的對昆蟲有多種作用方式的一類葫蘆烷型四環(huán)三萜類化合物(凌冰等，2008；曹溪等，2015)。苦瓜莖葉乙酸乙酯萃取物可抑制斜紋夜蛾Spodopteralitura體重的增長，延長其發(fā)育歷期，苦瓜素Ⅰ和苦瓜素Ⅱ是苦瓜莖葉乙酸乙酯萃取物中的主要活性成分，其含量分別為16.51%和14.37%(駱穎等，2012)?？喙纤丌?、苦瓜素Ⅱ和苦瓜素IV對三葉草斑潛蠅Liriomyzatrifolii成蟲有顯著的忌避產(chǎn)卵作用(Mekuriaetal., 2005；Mekuriaetal., 2006)?？喙纤豂和苦瓜素Ⅱ?qū)π〔硕關(guān)lutellaxylostella和亞洲玉米螟Ostriniafurnacalis(Güenée)幼蟲均有顯著的拒食和抑制生長發(fā)育的作用(凌冰等，2008；曹溪等，2015)?？喙纤丌?qū)δ瞎宵S守瓜Aulacophorafoveicollis成蟲、黏蟲Pseudaletiaseparata和斜紋夜蛾幼蟲均有明顯的拒食作用(Chandravadanaetal., 1983；Yasuietal., 1998)。而苦瓜素類化合物對昆蟲的作用機理和作用靶標方面的研究卻鮮有報道。苦瓜莖葉乙酸乙酯萃取物和苦瓜素Ⅱ能顯著抑制斜紋夜蛾幼蟲中腸的蛋白酶和淀粉酶活性(駱穎等，2012)?？喙纤豂對亞洲玉米螟幼蟲生長發(fā)育的抑制作用可能與其抑制了幼蟲體內(nèi)的海藻糖酶和磷酸酯酶活性有關(guān)(曹溪等，2015)。關(guān)于苦瓜素類化合物對昆蟲酚氧化酶活性的影響未見報道。

酚氧化酶(phenoloxidase，PO)是昆蟲體內(nèi)的一種重要酶類，參與昆蟲表皮的“鞣化”和“醌化”過程，使昆蟲的新表皮得以黑化和硬化(劉守柱等，2009)。同時，酚氧化酶參與昆蟲的免疫反應(yīng)以及傷口愈合(Theopoldetal., 2004；張永亮等，2008)，在昆蟲的變態(tài)發(fā)育和免疫系統(tǒng)中起著重要作用(羅萬春和薛超彬，2010)。目前環(huán)境友好型的植物源殺蟲劑已成為尋找新型害蟲控制劑的重要途徑。從天然植物化合物中篩選酚氧化酶抑制劑的研究日益受到重視，也是探索新殺蟲化合物的最有希望的途徑之一(張宗炳等，1993；羅萬春和薛超彬，2010)。Kubo等(1999，2000)從茴芹、腰果等植物中提取了一系列黃酮類天然產(chǎn)物，并測定了它們對蘑菇酪氨酸酶活性的抑制作用及作用機理。劉偉等(2009)從牛耳楓Daphniphyllumcalycinum提取物中分離的Deoxycalyciphylline B和Methyl homosecoda-phniphyllate兩種生物堿對甜菜夜蛾Spodopteraexigua酚氧化酶具有較好的抑制活性作用。芹菜素對甜菜夜蛾和小菜蛾酚氧化酶活性有較強的抑制作用(高興祥等，2003；Wangetal., 2005a)。槲皮素對甜菜夜蛾酚氧化酶活性(羅萬春等，2005)和槐尺蠖Semiothisacinerearia酚氧化酶活性(Wangetal., 2005b)均有較強的抑制作用。這些研究為開發(fā)以酚氧化酶為靶標的害蟲控制劑提供了理論依據(jù)。我們用含有苦瓜葉乙酸乙酯萃取物的人工飼料飼喂亞洲玉米螟幼蟲后，發(fā)現(xiàn)對亞洲玉米螟幼蟲體內(nèi)酚氧化酶活性有明顯的抑制作用。為了闡明苦瓜素類化合物對昆蟲的作用機理、尋找新的以酚氧化酶為靶標的植物源殺蟲劑，本文研究和比較了苦瓜葉乙酸乙酯萃取物及其活性成分苦瓜素類化合物對亞洲玉米螟幼蟲酚氧化酶活性的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

供試蟲源：亞洲玉米螟是本實驗室長期飼養(yǎng)種群。采用陳其津的人工飼料配方(陳其津等，2000)，在養(yǎng)蟲室內(nèi)(溫度26℃±2℃，RH 60%-70%，光周期為14L ∶10D)人工飼養(yǎng)。

供試藥劑與試劑：苦瓜葉乙酸乙酯萃取物(膏狀物)、苦瓜素Ⅰ(純度97%)、苦瓜素Ⅱ(純度97%)和苦瓜皂苷元L(純度95%)等均由本課題組從苦瓜葉乙醇粗提物中分離并純化獲得(凌冰等，2008)。苦瓜素Ⅰ、苦瓜素Ⅱ和苦瓜皂苷元L的化學結(jié)構(gòu)見圖1。印楝素A(純度98%)和硫脲(純度>99%)均購自Sigma公司。牛血清蛋白(電泳純)、鄰苯二酚、SDS和考馬斯亮藍G250均購自北京鼎國生物技術(shù)有限責任公司產(chǎn)品。

圖1 苦瓜素Ⅰ和Ⅱ(A)和苦瓜皂苷元L(B)的化學結(jié)構(gòu)Fig.1 Chemical structures of momordicinⅠandⅡ(A) and momordicoside L (B)

主要儀器：Eppendorf centrifuge 5810高速冷凍離心機(德國)，iMark酶標儀13601(伯樂)，UV-1800紫外分光光度計(上海美譜達儀器有限公司)，移液器(德國Eppendorf 公司)等。

1.2 試驗方法

1.2.1不同濃度藥液混合飼料的配制

參照朱春亞等(2014)方法，稱取1 g苦瓜葉乙酸乙酯萃取物，用丙酮溶解后再用50%的丙酮水溶液配制成1.25、2.5、5、10和20 mg/mL 5個濃度藥液，按人工飼料:藥液為5 ∶1的比例配制含有0.025%、0.05%、0.1% 、0.2%和0.4%苦瓜葉乙酸乙酯萃取物的混合飼料，以50%的丙酮水溶液為對照，待混合飼料中的溶劑自然揮發(fā)并凝固后，4℃保存?zhèn)溆谩Ｓ孟嗤椒ㄅ渲坪锌喙纤丌癫煌瑵舛鹊幕旌巷暳蟼溆谩?/p>

1.2.2試蟲處理

選取個體大小一致的亞洲玉米螟3齡幼蟲，先饑餓4 h，然后分別用添加了不同濃度的苦瓜葉乙酸乙酯萃取物和苦瓜素Ⅰ的人工飼料連續(xù)飼養(yǎng)72 h，以不添加這些物質(zhì)的人工飼料飼喂亞洲玉米螟3齡幼蟲為對照處理。分別于24 h和48 h提取不同處理試蟲的酚氧化酶供測定。

1.2.3酶液的制備

每一處理選取個體大小一致的試蟲15頭為一組放入預(yù)冷的玻璃勻漿器中，加入5 mL、 pH 7.0的0.1 mol/L磷酸緩沖液在冰浴條件下勻漿。然后將勻漿液在4000 r/min、4℃條件下離心10 min，取上清液作為待測酶源。

1.2.4酶活力測定

參照周利琳等的方法(周利琳等，2009)并略有改進。向帶塞試管中加入2.0 mL 0.2 moL/L PBS(pH 7.0)和0.5 mL酶液，振蕩混勻后置于37℃水浴中預(yù)保溫5 min，然后加0.5 mL 0.04 mol/L鄰苯二酚，于37℃水浴中振蕩反應(yīng)5 min后加入0.3 mL 5% SDS終止反應(yīng)。以加入0.2 mol/L PBS(pH 7.0)的試管為對照。冷卻后用酶標儀測定其412 nm處的光密度值(OD)。每個處理重復(fù)3次。以考馬斯亮藍法測定蛋白質(zhì)含量。

1.2.5體外酚氧化酶酶液制備

參考劉春英等(2004)粗酶制備方法并略有改進。選取大小一致、發(fā)育健康的5齡第2 天亞洲玉米螟幼蟲，用75%酒精擦拭體表，濾紙吸干，稱重。按10 mL/g加入0.02 mol/L PBS(pH7.0)，于預(yù)冷的勻漿器中勻漿。4℃下8000 r/min離心10 min。取上清液，冰浴磁力攪拌下，緩慢加入硫酸銨粉末至40%飽和度，5-10 min內(nèi)加完。之后繼續(xù)攪拌10-15 min，4℃下8000 r/min離心20 min，收集沉淀物，溶解于0.02 mol/L PBS(pH 7.0)中，4℃，透析過夜。期間更換數(shù)次透析液，直至透析液中無SO42-檢出，得到純化倍數(shù)為2.50。初純化酶液的酶活力回收率為92.61%，供酶活力測定。

1.2.6幾種有機溶劑對體外酚氧化酶活力的影響測定

取100 μL酶液，加入2 mmol/L的L-DOPA 1 mL，30 ℃下溫育1 min。取200 μL酶和底物混合液，用iMark酶標儀監(jiān)測4 min內(nèi)OD490的變化，以0.05 mol/L PBS(pH 7.0)替代酶液為對照調(diào)零。以每分鐘每毫克蛋白質(zhì)引起吸光值增加0.001為一個酶活力單位。分別測定了丙酮、甲醇、乙醇和二甲基亞砜等常見有機溶劑在亞洲玉米螟酚氧化酶測活體系中對酶活力的影響。

1.2.7苦瓜素類化合物對體外酚氧化酶活力的影響測定

按肖婷等(2007)方法。在200 μL的測活體系中，包含終濃度為1 mmol/L的L-DOPA和0.1 mol/L PBS(pH6.9)，37℃溫育30 min，加入10 μL酶液，振蕩5 s，于iMark酶標儀測定490 nm處吸光值。每30 s記錄一個吸光值，光密度值隨時間的增長而增加，得到一條直線，由斜率求得酶活力。以每分鐘每毫克蛋白質(zhì)引起吸光值增加0.001為一個酶活力單位。將苦瓜素Ⅰ、苦瓜素Ⅱ、苦瓜皂苷元L和對照藥劑葫蘆素B、硫脲和印楝素A分別用少量二甲基亞砜溶解，并稀釋成不同濃度的溶液，以5%的濃度為測活體系中有機溶劑的最終含量，分別測定這幾種化合物對亞洲玉米螟酚氧化酶活力的影響。

1.2.8蛋白質(zhì)含量測定

采用Brandford法(Bradford, 1976)，以牛血清蛋白(BSA)為標準蛋白。

1.2.9數(shù)據(jù)分析

獲得的數(shù)據(jù)采用SAS 9.0版軟件進行方差分析(ANOVA)。并用鄧肯氏新復(fù)極差檢驗法(Duncan’s multiple range test，DMRT) 檢驗化合物不同濃度處理間的差異顯著性(P=0.05)。

2 結(jié)果與分析

2.1 苦瓜葉乙酸乙酯萃取物對亞洲玉米螟幼蟲體內(nèi)酚氧化酶活力的抑制作用

用含有0.025%-0.4% 苦瓜葉乙酸乙酯萃取物的人工飼料飼喂亞洲玉米螟幼蟲，24 h和48 h后分別測定其酚氧化酶活力。以對照組幼蟲的酚氧化酶相對活力為100%, 得到苦瓜葉乙酸乙酯萃取物各濃度處理后幼蟲的酚氧化酶相對活力大小如圖2所示。結(jié)果分析表明，用含有0.025%-0.4%苦瓜葉乙酸乙酯萃取物的人工飼料飼喂亞洲玉米螟幼蟲后對其體內(nèi)的酚氧化酶活力均有明顯的抑制作用。隨著苦瓜葉乙酸乙酯萃取物濃度的增加，酚氧化酶的相對活力逐漸降低，且明顯低于對照(24 h：F5,17=81.49，P<0.0001；48 h：F5,17=153.48，P<0.0001)；處理24 h和48 h，隨著苦瓜葉乙酸乙酯萃取物濃度的增加和處理時間的延長，對酚氧化酶活力的抑制作用也逐漸增強，表現(xiàn)出明顯的濃度-時間效應(yīng)。比較不同處理時間對酶活力的抑制作用以處理48 h的最強。以苦瓜葉乙酸乙酯萃取物濃度為自變量(x),酶抑制率(y)為因變量作回歸，求出處理48 h的回歸方程為：Y=5.9717+1.2613X(r=0.9816)，I50為0.17%(95%置信區(qū)間為0.11%-0.27%)。結(jié)果表明，苦瓜葉乙酸乙酯萃取物對亞洲玉米螟幼蟲酚氧化酶活力的抑制作用可能是其抑制幼蟲生長發(fā)育的原因之一。

圖2 不同濃度苦瓜葉乙酸乙酯萃取物處理亞洲玉米螟幼蟲體內(nèi)酚氧化酶的相對活力Fig.2 PPO relative activity exerted by different dosage of ethyl acetate extracts of Momordica charantia leaves on Ostrinia furnacalis larvae in vivo

2.2 苦瓜素Ⅰ對亞洲玉米螟幼蟲體內(nèi)酚氧化酶活力的抑制作用

用含有不同濃度苦瓜素Ⅰ的人工飼料飼喂亞洲玉米螟幼蟲后對其體內(nèi)酚氧化酶活力的影響見圖3。從圖3可以看出，苦瓜素Ⅰ對亞洲玉米螟幼蟲體內(nèi)酚氧化酶的活性有明顯的抑制作用。處理24 h和48 h，除了0.05%濃度處理24 h的酚氧化酶活力與對照差異不顯著外，其余各濃度處理的酚氧化酶活力均顯著低于對照(24 h：F5,17=132.84，P<0.0001；48 h：F5,17=646.43，P<0.0001)，且隨著濃度的增加和處理時間的延長，酶活力逐漸降低，抑制作用逐漸增強。以苦瓜素Ⅰ的濃度為自變量(x),酶抑制率(y)為因變量作回歸，求出苦瓜素Ⅰ處理48 h的回歸方程為Y=5.5226+1.1159X(r=0.9958)，苦瓜素Ⅰ對酚氧化酶活力抑制中濃度I50為0.34%(95%置信區(qū)間為0.21%-0.56%)。

圖3 不同濃度苦瓜素Ⅰ處理亞洲玉米螟幼蟲體內(nèi)酚氧化酶的相對活力Fig.3 Changes of PPO relative activity dependent on dosage of momordicin-in larvae of Ostrinia furnacalis

2.3 幾種有機溶劑對玉米螟幼蟲體外酚氧化酶活力的影響

以L-DOPA為底物，測定了丙酮、甲醇、乙醇和二甲基亞砜等常見有機溶劑在亞洲玉米螟酚氧化酶測活體系中對酶活力的影響。由圖4A可以看出，丙酮在較低含量時對亞洲玉米螟離體酚氧化酶的活力影響不大，但隨著丙酮含量的增加，離體酚氧化酶的相對酶活力逐漸降低；當丙酮含量為5%時，相對酶活力為49.27%；當丙酮含量為7.5%時，相對酶活力僅為24.22%。由圖4B可見，當乙醇含量大于2.5%和甲醇含量大于5%時，離體酚氧化酶活力開始明顯降低，乙醇含量為2.5%和甲醇含量為5%時，相對酶活力分別為77.15%和79.87%；而二甲基亞砜含量為2.5%、5%和7.5%時，相對酶活力分別為102.39%、97.99%和97.23%；當二甲基亞砜含量提高至8.75%時，相對酶活力降為72.96%。比較丙酮、甲醇、乙醇和二甲基亞砜等常見有機溶劑對亞洲玉米螟離體酚氧化酶活力的影響可以看出，二甲基亞砜在亞洲玉米螟酚氧化酶測活體系中的含量在0-7.5%范圍時對亞洲玉米螟離體酚氧化酶相對活力的影響最小，離體酚氧化酶相對酶活力均大于97%，故選用二甲基亞砜作為不同供試藥劑的溶劑。

圖4 幾種有機溶劑對亞洲玉米螟離體酚氧化酶活力的影響Fig.4 Effects of organic solvents on the PPO activity of Ostrinia furnacalis larvaes in vitro

2.4 苦瓜素Ⅰ、苦瓜素Ⅱ和苦瓜皂苷元L對亞洲玉米螟幼蟲體外酚氧化酶活力的抑制作用

以亞洲玉米螟離體酚氧化酶為酶液，分別測定了苦瓜葉提取物中含有的苦瓜素Ⅰ、苦瓜素Ⅱ、苦瓜皂苷元L和葫蘆素B等苦瓜葉抗蟲化合物以及對照藥劑印楝素A和硫脲對亞洲玉米螟離體酚氧化酶活力的影響(見圖5)。從圖5可以看出，硫脲、苦瓜素Ⅰ和苦瓜素Ⅱ不同濃度處理后，亞洲玉米螟離體酚氧化酶活性均隨著不同化合物濃度的增加而逐漸降低，與不用任何藥劑處理的對照相比差異顯著(硫脲：F5,17=54.38，P<0.0001；苦瓜素Ⅰ：F5,17=24.49,P<0.0001；苦瓜素Ⅱ：F6,41=19.36，P<0.0001)，并表現(xiàn)出明顯的濃度效應(yīng)。印楝素A較高濃度處理(500 μg/mL和2000 μg/mL)的酚氧化酶活性雖然與不用任何藥劑處理的對照有明顯差異(F5,17=3.02，P=0.0253)，但并沒有表現(xiàn)出明顯的濃度效應(yīng)。而苦瓜皂苷元L和葫蘆素B的不同濃度處理后，對酚氧化酶活性的影響均與不用任何藥劑處理的對照差異不顯著(苦瓜皂苷元L：F5,35=1.73，P=0.1574；葫蘆素B：F5,35=1.76，P=0.1512)。以苦瓜素Ⅰ、苦瓜素Ⅱ和硫脲的濃度為自變量(x)，酚氧化酶活力的抑制率(y)為因變量分別進行回歸分析，得到的回歸方程見表1。從表1可以看出，苦瓜素Ⅰ對亞洲玉米螟離體酚氧化酶活性的抑制作用較強，苦瓜素Ⅱ?qū)喼抻衩酌x體酚氧化酶活性的抑制作用次之。

圖5 苦瓜素Ⅰ、苦瓜素Ⅱ和苦瓜皂苷元L處理亞洲玉米螟幼蟲離體酚氧化酶的相對活力Fig.5 Inhibition effects of momordicin-, momordicin II and momordicoside L on PPO activity of larvae of Ostrinia furnacalis

表1 苦瓜素Ⅰ、苦瓜素Ⅱ?qū)喼抻衩酌x體酚氧化酶活性的抑制作用

注：括號中數(shù)字代表置信度為95%的置信區(qū)間。Note: Numbers in brackets represent 95% confidence intervals.

3 結(jié)論與討論

苦瓜葉提取物對昆蟲的生物活性近些年來備受人們的關(guān)注(Yasuietal., 1998； Abeetal., 2000；李紹勤等，2001)，其主要活性成分苦瓜素類化合物(如苦瓜素Ⅰ和苦瓜素Ⅱ)雖然對多種害蟲幼蟲的直接“殺死”活性不高(凌冰等，2008；駱穎等，2012a，2012b)，但它們均能明顯抑制小菜蛾和亞洲玉米螟幼蟲體重的增長及延長幼蟲的發(fā)育歷期(凌冰等，2008；曹溪等，2015)；用苦瓜素Ⅰ飼喂了亞洲玉米螟幼蟲后使其成蟲的產(chǎn)卵量明顯下降，種群增長得到明顯控制(曹溪等，2015)。本研究發(fā)現(xiàn)，苦瓜葉乙酸乙酯萃取物及其活性成分苦瓜素Ⅰ對亞洲玉米螟幼蟲酚氧化酶的活性有明顯的抑制作用，這可能是其控制害蟲生長發(fā)育的重要作用靶標之一。在體內(nèi)酶活力測定中，苦瓜葉乙酸乙酯萃取物和苦瓜素 Ⅰ對亞洲玉米螟幼蟲體內(nèi)酚氧化酶活力的抑制中濃度分別為0.17%和0.34%，苦瓜葉乙酸乙酯萃取物對酚氧化酶活力的抑制作用明顯強于苦瓜素Ⅰ，這可能是苦瓜葉乙酸乙酯萃取物中還含有其他活性化合物。在離體酶活力測定中，苦瓜素Ⅰ和苦瓜素Ⅱ?qū)喼抻衩酌紫x離體酚氧化酶的活力均表現(xiàn)出抑制作用，這些化合物之間是否存在對酚氧化酶活性的聯(lián)合抑制作用或增效作用有待進一步研究。苦瓜素Ⅰ、苦瓜素Ⅱ和苦瓜皂苷元L對離體亞洲玉米螟酚氧化酶活力的影響測定結(jié)果表明，苦瓜素Ⅰ對離體酚氧化酶活力的抑制作用最強，苦瓜素Ⅱ的抑制作用次之，而苦瓜皂苷元L對酚氧化酶的活力無明顯的抑制作用；這可能是3種化合物的化學結(jié)構(gòu)差異造成的(圖3)。這些研究結(jié)果可為以苦瓜素Ⅰ的化學結(jié)構(gòu)為模板開發(fā)酚氧化酶抑制劑提供依據(jù)。

近些年來，以酚氧化酶為靶標的植物源抑制劑的研究得到了人們的關(guān)注(王樹棟等，2004；羅萬春等，2005；Wangetal., 2005 b；劉偉等，2009)，不同的抑制劑對酚氧化酶活性的抑制作用是不同的。肖婷等概括分析了苯甲酸及其衍生物、5-甲基水楊酸、曲酸、芹菜素、槲皮素等酚氧化酶抑制劑的抑制類型包括混合型抑制、競爭性抑制和非競爭性抑制3種。槲皮素對酚氧化酶的作用方式為競爭性抑制作用，它既可以與銅離子結(jié)合，又可以和酚氧化酶活性中心的銅離子螯合抑制酶活性；芹菜素的作用方式屬于非競爭性抑制作用，它們可以與銅離子結(jié)合，但并不影響酚氧化酶活性中心的銅離子；2-羥基-4-甲氧基苯甲醛縮苯胺的作用方式雖然與芹菜素相同，但它是因發(fā)生其他反應(yīng)而降低了酶活(肖婷等，2007)。我們的研究結(jié)果表明，苦瓜素Ⅰ對亞洲玉米螟幼蟲體內(nèi)酚氧化酶活性的抑制作用表現(xiàn)出明顯的濃度-時間效應(yīng)，苦瓜素Ⅰ等化合物的結(jié)構(gòu)與已報道的酚氧化酶抑制劑完全不同，其對酚氧化酶的抑制作用方式和作用機理尚需進一步研究驗證。

本文的研究結(jié)果表明，苦瓜素Ⅰ和苦瓜素Ⅱ?qū)ハx體內(nèi)酚氧化酶活性的抑制作用是苦瓜素類化合物抑制昆蟲生長發(fā)育的作用機理之一。另外，無論是體內(nèi)還是體外測定，苦瓜素Ⅰ都對亞洲玉米螟幼蟲酚氧化酶活性表現(xiàn)出顯著的抑制作用，這為尋找新的以酚氧化酶為靶標的植物源殺蟲劑提供了可靠依據(jù)。同時，對進一步揭示苦瓜抗蟲的化學機制有重要意義。鑒于苦瓜素類化合物的特殊結(jié)構(gòu)特征，以此為模版進行系列合成，以期發(fā)現(xiàn)對亞洲玉米螟酚氧化酶具有更高活性的化合物作為“昆蟲生命活動干擾劑”進行開發(fā)，開辟亞洲玉米螟防治新途徑。

References)

Abe M, Matsuda K. Feeding deterrents fromMomordicacharantialeaves to cucurbitaceous feeding beetle species [J].AppliedEntomologyandZoology, 2000, 35 (1): 143-149.

Bradford MM.A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding [J].AnalyticalBiochemistry, 1976, 72: 248-254.

Cao X, Zhu CY, Zhang MX,etal. Bioactivity of momordicin I againstOstriniafurnacalis(Lepidoptera: Pyralidae) and its effects on the metabolizing enzyme activities in larval bodies of the moth[J].ActaEntomologicaSinica, 2015, 58 (6): 825-633. [曹溪, 朱春亞, 張茂新, 等. 苦瓜素I對亞洲玉米螟的生物活性及對其幼蟲體內(nèi)代謝酶活性的影響[J]. 昆蟲學報, 2015, 58 (6): 625-633]

Chandravadana MV, Pal AB. Triterpenoid feeding deterrent ofRaphidopalpafoveicollisL. (red pumpkin beetles) fromMomordicacharantiaL. [J].CurrentScience, 1983, 52 (2): 87-88.

Chen QJ, Li GH, Pang Y. A simple artificial diet for mass rearing of some noctuid species [J].EntomologyKnowledge, 2000, 37 (6): 325-327. [陳其津, 李廣宏, 龐義. 飼養(yǎng)五種夜蛾科昆蟲的一種簡易人工飼料[J]. 昆蟲知識, 2000, 37 (6): 325-327]

Gao XX, Luo WC, Xie GY,etal. Effects of apigenin, vanillic acid and kojic acid on the phenoloxidase activity inSpodopteraexiguaHubner [J].JournalofPlantResourceEnvironment, 2003, 12 (3): 16-19. [高興祥, 羅萬春, 謝桂英, 等. 芹菜素等3種生物源化合物對甜菜夜蛾酚氧化酶的抑制作用[J]. 植物資源與環(huán)境學報, 2003, 12 (3): 16-19]

Grover JK, Yadav SP. Pharmacological actions and potential uses ofMomordicacharantia: A review [J].JournalofEthnopharmacology, 2004, 93 (1): 123-132.

Kubo I, Kinst-Hori I. Flavonols from saffron flower: Tyrosinase inhibitory activity and inhibition mechanism[J].JournalofAgriculturalandFoodChemistry, 1999, 47 (10): 4121-4125.

Kubo I, Kinst-Hori I, Chaudhuri SK,etal. Flavonols fromHeterothecainuloides: Tyrosinase inhibitory activity and structural criteria [J].BioorganicMedicinalChemistry, 2000, 8 (7): 1749-1755.

Li SQ, Deng WX, Zhang QD. Thekilling action and growth influenece ofMomordicacharantiaextracts onLiriomyzasativae[J].JournalofHuazhongAgriculturalUniversity, 2001, 20 (6): 539-543. [李紹勤, 鄧望喜, 張求東. 苦瓜葉片提取液對美洲斑潛蠅殺蟲作用與生長發(fā)育的影響[J]. 華中農(nóng)業(yè)大學學報, 2001, 20 (6): 539-543]

Ling B, Wang GC,Ya J,etal. Studies on antifeeding activity and active ingredients againstPlutellaxylostellafromMomordicacharantialeaves [J].ScientiaAgricultSinica, 2008, 41 (10): 3116-3122. [凌冰, 王國才, 軋霽, 等. 苦瓜葉提取物對小菜蛾的拒食活性及有效成分研究[J]. 中國農(nóng)業(yè)科學, 2008, 41 (10): 3116-3122]

Ling B, Xiang YL, Wang GC,etal. Antifeedant and antioviposition activies ofMomordicacharantialeaf ethanol extract againstLiriomyzasativae[J].ChineseJournalAppliedEcology, 2009, 20 (4): 836 -842. [凌冰, 向亞林, 王國才, 等. 苦瓜葉提取物對美洲斑潛蠅取食和產(chǎn)卵行為的抑制作用[J]. 應(yīng)用生態(tài)學報, 2009, 20 (4): 836-842]

Liu CY, Luo WC, Li FZ,etal. Purification and characterization of polyphenol oxidase fromSemiothisacinereariaBremeretGrey (Lepidoptera: Geometridae) [J].ActaEntomologicaSinica, 2004, 47 (2): 184-188. [劉春英, 羅萬春, 李方正, 等. 槐尺蠖多酚氧化酶的純化及酶學特征[J]. 昆蟲學報, 2004, 47 (2): 184-188]

Liu SZ, Xue CB, Luo WC. Phenoloxidase activity during cuticle sclerotization in larvae ofTenbriomolitor(Coleoptera: Tenebrionidae) [J].ActaEntomologicaSinica, 2009, 52 (9): 941-945. [劉守柱, 薛超彬, 羅萬春. 黃粉蟲幼蟲體壁硬化過程中酚氧化酶活性的變化[J]. 昆蟲學報, 2009, 52 (9): 941-945]

Liu W, Xiao T, Du L,etal. Inhibitory effects of two compounds extracted fromDaphniphyllumcalycinumon phenoloxidase ofSpodoteraexigua[J].ScientiaAgriculturaSinica, 2009, 42 (10): 3720-3725. [劉偉, 肖婷, 杜磊, 等. 牛耳楓提取物對甜菜夜蛾酚氧化酶的抑制作用[J]. 中國農(nóng)業(yè)科學, 2009, 42 (10): 3720-3725]

Luo WC, Gao XX, Yu TC,etal. Inhibitory effect of quercetin on the activity of phenoloxidase inSpodopteraexigua(Hübner) (Lepidoptera: Noctuidae) [J].ActaEntomologicaSinica, 2005, 48 (1): 36- 41. [羅萬春, 高興祥, 于天叢, 等. 櫟皮酮對甜菜夜蛾酚氧化酶的抑制作用[J]. 昆蟲學報, 2005, 48 (1): 36-41]

Luo WC, Xue CB.Insect Phenoloxidase and Its Inhibitors [M]. Beijing: Science Press, 2010. [羅萬春, 薛超彬. 昆蟲酚氧化酶及其抑制劑[M]. 北京: 科學出版社, 2010]

Luo Y, Ling B, Xie JF,etal. Inhibition effects ofMomordicacharantialeaves on the experimental population ofSpodopteralitura[J].ActaEcologicaSinica, 2012, 32 (13): 4173-4180. [駱穎, 凌冰, 謝杰鋒, 等. 苦瓜葉乙酸乙酯提取物對斜紋夜蛾實驗種群的抑制作用[J]. 生態(tài)學報, 2012, 32 (13): 4173-4180]

Luo Y, Zhang MX, Ling B. Effects of ethyl acetate extracts ofMomordicacharantialeaves on digestive enzymes ofSpodopteralitura(Fabricius) [J].JournalEnvironmentEntomology, 2012, 34 (3): 289-294. [駱穎, 張茂新, 凌冰. 苦瓜葉乙酸乙酯萃取物對斜紋夜蛾消化酶活性的影響[J]. 環(huán)境昆蟲學報, 2012, 34 (3): 289-294]

Mekuria DB, Kashiwagi T, Tebayashi S,etal. Cucurbitane triterpenoid oviposition deterrent fromMomordicacharantiato the leafminer,Liriomyzatrifolii[J].BioscienceBiotechnologyBiochemistry, 2005, 69 (9): 1706-1710.

Mekuria DB, Kashiwagi T, Tebayashi S,etal. Cucurbitane glucosides fromMomordicacharantialeaves as oviposition deterrents to the leafminer,Liriomyzatrifolii[J].ZeitschriftFürNaturforschungC, 2006, 61 (1-2): 81-86.

Subratty AH, Gurib-Fakim A, Mahomoodally F. Bitter melon: An exotic vegetable with medicinal values [J].NutritionandFoodScience, 2005, 35 (3/4): 143-147.

Theopold U, Schmidt O, S?derh?ll K,etal. Coagulation in arthropods: defence, wound closure and healing[J].TrendsinImmunology, 2004, 25 (6): 289-294.

Yasui H, Kato A, Yazawa M.Antifeedants to armyworms,SpodopteralituraandPseudaletiaseparata, from bitter ground leaves,Momordiacharantia[J].JournalofChemicalEcology, 1998, 24 (5): 803-813.

Wang SD, Luo WC, Xiao T,etal. Inhibitory effects of apigenin on phenoloxidase of diamondback moth,Plutellaxylostella(Lepidoptera Plutellidae) [J].BiopesticideInternational, 2005a, 1 (1/2): 82-90.

Wang SD, Luo WC, Gao XX,etal. Inhibitory effects of kojic acid on phenoloxidase of diamondback moth,Plutellaxylostella[J].ScientiaAgricultureSinica, 2004, 37 (9): 1316-1321. [王樹棟, 羅萬春, 高興祥, 等. 曲酸對小菜蛾酚氧化酶抑制作用的研究[J]. 中國農(nóng)業(yè)科學, 2004, 37 (9): 1316-1321]

Wang XY, Liu CY, Zhang JD,etal. Inhibitory kinetics of quercet in on phenoloxidase from loopworm [J].InsectScience, 2005b, 12 (6): 435-441.

Xiao T, Xue CB, Luo WC,etal. Inhibitory effects of 2-hydroxy-4-methoxybenzylidene-aniline on phenoloxidase fromPierisrapae(L.) (Lepidoptera: Pieridae) [J].ActaEntomologicaSinica, 2007, 50 (9): 900-906. [肖婷, 薛超彬, 解先業(yè), 等. 2-羥基-4-甲氧基苯甲醛縮苯胺對菜青蟲酚氧化酶的抑制作用[J]. 昆蟲學報, 2007, 50 (9): 900-906]

Zhang YL, Zhu Y. Expressionprofile analysis ofPPO1 gene in the silkworm,Bombyxmori, during metamorphosis stages [J].CanyeKexue, 2008, 34 (4): 741-744. [張永亮, 朱勇. 家蠶變態(tài)期酚氧化酶原基因PPO1的表達譜分析[J]. 蠶業(yè)科學, 2008, 34 (4): 741-744]

Zhang ZB, Leng XF. Toxicology andInsecticide Application[M]. Beijing: Chemical Industry Press, 1993: 331-337. [張宗炳, 冷欣夫. 殺蟲藥劑毒理及應(yīng)用[M]. 北京: 化學工業(yè)出版社, 1993: 331-337]

Zhou LL, Si SY, Wang ZX,etal. Biochemical mechanisms of beet armyworm (Spodopteraexigua) resistance to tebufenozide [J].ActaEntomologicaSinica, 2009, 52 (4): 386-394. [周利琳, 司升云, 汪鐘信, 等. 甜菜夜蛾對蟲酰肼抗性的生化機制[J]. 昆蟲學報, 2009, 52 (4): 386-394]

Zhu CY, Liu H, Cao X,etal. Effects of ethyl acetate extracts ofMomordicacharantialeaves on metabolizing enzymes in Asian corn borer,Ostriniafurnacalis(Guenée) (Lepidoptera: Pyralidae) [J].JournalofEnvironmentalEntomology, 2014, 36 (4): 531-537. [朱春亞, 劉歡, 曹溪, 等. 苦瓜葉萃取物對亞洲玉米螟代謝酶活性的影響. 環(huán)境昆蟲學報[J]. 2014, 36 (4): 531-537]

InhibitioneffectsofmomordicinIonphenoloxidaseofAsiancornborer,Ostriniafurnacalis(Guenée) (Lepidoptera:Pyralidae)

FANG Yue, ZHU Chun-Ya, CAO Xi, GUO Zi-Jun, LING Bing*

(Key Laboratory of Bio-Pesticide Innovation and Application of Guangdong Province, Department of Entomology, South China Agricultural University, Guangzhou 510642, China)

In order to explore the insecticidal mechanism of momordicins on pest, here, ethyl acetate extracts ofMomordicacharantialeaves and momordicin I were selected to evaluate inhibitory effects to phenoloxidase activity ofOstriniafurnacalislarvaeinvivo, and momordicin I, momordicin II and the aglycone of momordicoside L were also treated for phenoloxidase activityinvitro. The results showed that ethyl acetate extracts ofM.charantialeaves and momordicin I exerted significant inhibitory effects on phenoloxidase activity ofO.furnacalislarvea. The results showed that ethyl acetate extracts ofM.charantialeaves and momordicin I exerted significant inhibitory effects on phenoloxidase activity ofO.furnacalislarvae. Moreover, momordicin I and momordicin II could inhibit the activity of phenoloxidaseinvitro, theIC50values were 169.28 μg/mL and 1182.08 μg/mL, respectively. The inhibitory effects of momordicin I were more potent than momordicin II on phenoloxidase activity. In conclusion, the major mechanism of action of growth inbibition can be attributed to activity ofO.furnacalislarvae phenoloxidase inhibited by ethyl acetate extracts ofM.charantialeaves and momordicin I.

Ostriniafurnacalis; phenoloxidase; momordicin I; inhibition

方月，朱春亞，曹溪，等.苦瓜素Ⅰ對亞洲玉米螟幼蟲酚氧化酶活性的抑制作用[J].環(huán)境昆蟲學報，2017,39(5):1105-1113.

Q965;S433.4

A

1674-0858(2017)05-1105-09

廣東省省級科技計劃項目(2013B090700009-03);國家自然科學基金項目(31171849)

方月，女，1990年生，遼寧沈陽人，碩士，主要從事農(nóng)業(yè)昆蟲與害蟲防治研究, E-mail:534644575@qq.com

*通信作者Author for correspondence，E-mail: gzhbling@scau.edu.cn

Received: 2016-05-05；接受日期Accepted: 2016-07-17