玫煙色棒束孢SCAU-IFCF01產(chǎn)酶特性研究

雷妍圓，呂利華，何余容

(1.廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所/廣東省植物保護(hù)新技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣州 510640；2.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，廣州 510642)

玫煙色棒束孢SCAU-IFCF01產(chǎn)酶特性研究

雷妍圓1，呂利華1，何余容2*

(1.廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所/廣東省植物保護(hù)新技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣州 510640；2.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，廣州 510642)

采用3, 5-二硝基水楊酸(DNS)法、瓊脂平板透明圈法和專一性短肽底物Suc-Ala-Ala-Pro-Phe-pNA對玫煙色棒束孢Isariafumosorosea5個菌株在培養(yǎng)液、蟲體誘導(dǎo)下的幾丁質(zhì)酶和凝乳彈性蛋白酶(Pr1酶)活性進(jìn)行了研究。結(jié)果表明，玫煙色棒束孢在不同誘導(dǎo)源中均能產(chǎn)生幾丁質(zhì)酶和Pr1酶。DNS和透明圈比值法測得的各菌株間幾丁質(zhì)酶活性差異趨勢一致，高致病力菌株IFCF01的幾丁質(zhì)酶產(chǎn)酶水平顯著高于4個低致病力菌株。以蟲體誘導(dǎo)的菌株IFCF01幾丁質(zhì)酶活性最高達(dá)0.7815 IU/mL，顯著高于培養(yǎng)液誘導(dǎo)的0.3740 IU/mL。玫煙色棒束孢Pr1酶活性隨接種時間逐漸增高，且高致病力菌株產(chǎn)酶量顯著高于低致病力菌株。以蟲體培養(yǎng)的菌株IFCF01 Pr1酶活性最高值達(dá)2.34 μg/mL/min，顯著高于IFCF-D58的最高值0.88 μg/mL/min。蟲體誘導(dǎo)對幾丁質(zhì)酶和Pr1酶活性有明顯的促進(jìn)作用，推測與小菜蛾P(guān)lutellaxylostella幼蟲表皮含有刺激玫煙色棒束孢大量產(chǎn)酶的成分有關(guān)。

玫煙色棒束孢；小菜蛾；幾丁質(zhì)酶；凝乳彈性蛋白酶；酶活性

昆蟲病原真菌(Entomopathogenic fungi)作為農(nóng)林害蟲生物防治的一個重要組成部分，在持續(xù)控制害蟲、保護(hù)生態(tài)平衡方面具有不可替代的作用。盡管利用昆蟲病原真菌生物防治害蟲已經(jīng)取得了一定的成效，但與化學(xué)農(nóng)藥相比，卻普遍存在殺蟲速率緩慢、防效不穩(wěn)定等弱點(diǎn)(蒲蟄龍, 1985; de Faria and Wraight, 2007; 王記祥和馬良進(jìn), 2009; 王聯(lián)德等, 2010)。

病原真菌侵染寄主昆蟲的第一道屏障是表皮，在降解表皮過程中，真菌分泌產(chǎn)生多種胞外水解酶，包括蛋白質(zhì)酶、幾丁質(zhì)酶、脂酶、淀粉酶等(Charnley and Leger, 1991)，這個過程一般認(rèn)為是在酶的降解和芽管的機(jī)械壓力共同作用下完成的(St Leger, 1987)。昆蟲外骨骼的兩種主要組成成分是幾丁質(zhì)和蛋白質(zhì)(楊革等, 2005)，因此胞外蛋白酶和幾丁質(zhì)水解酶是菌株非常重要的毒力因子，其產(chǎn)酶活性高低是菌株毒力的重要因素(Kaur and Padmaja, 2009)。多年來關(guān)于昆蟲病原真菌酶活與毒力間相關(guān)性的探討，由于菌株或?qū)嶒?yàn)方法的差異，至今仍處于各持己見的階段。多數(shù)觀點(diǎn)認(rèn)為菌株的一系列胞外水解酶與其對寄主毒力間呈正相關(guān)(樊美珍等, 1991; 胡景江等, 1996; 彭國雄等, 2000; 林海萍等, 2008; 殷紅福等, 2011; 董晶等, 2015)。也有觀點(diǎn)認(rèn)為，胞外蛋白酶活性與其毒力相關(guān)性雖然顯著但卻是有限的，在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義上不足以將其作為菌株的毒力指標(biāo)(馮明光, 1998)。

玫煙色棒束孢Isariafumosorosea是一類重要的昆蟲病原真菌，能寄生多種蔬菜和果樹害蟲(陳巍巍和馮明光, 1999; Meyeretal., 2008; Marjorieetal., 2010)。本實(shí)驗(yàn)室曾報(bào)道一株對小菜蛾P(guān)lutellaxylostella具有高致病力的玫煙色棒束孢SCAU-IFCF01(呂利華等, 2007)，該菌株胞外蛋白酶水平與其對小菜蛾的致病力間呈極顯著的正相關(guān)(雷妍圓等, 2010)，但其產(chǎn)酶特性及與低致病力菌株間的差異仍有待評價。為此，本研究以玫煙色棒束孢IFCF01、IFCF-D、IFCF-D58、IFCF-D20、IFCF-D50為供試菌株，對不同誘導(dǎo)源下的菌株幾丁質(zhì)酶和凝乳彈性蛋白酶(Pr1酶)活性差異進(jìn)行研究，為利用玫煙色棒束孢進(jìn)行生物防治提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試蟲源和菌株

供試蟲源為室內(nèi)人工飼養(yǎng)多代的小菜蛾種群，飼養(yǎng)溫度為25℃±1℃，相對濕度60%-90%，光照條件L ∶D=14 ∶10，幼蟲長至4齡初供試。所用菌株為玫煙色棒束孢高致病力菌株IFCF01(原EBCL 03011或PFCF-O)和低致病力菌株IFCF-D、IFCF-D58、IFCF-D20、IFCF-D50(雷妍圓等, 2010)。各菌株接種于薩氏培養(yǎng)基SDAY(葡萄糖40 g，蛋白胨10 g，酵母膏10 g，瓊脂15-20 g，蒸餾水1 L)平板上，25℃全黑暗條件下培養(yǎng)20 d待用。

1.2 幾丁質(zhì)酶活力測定

1.2.1幾丁質(zhì)酶液制備

膠體幾丁質(zhì)培養(yǎng)液：1%膠體幾丁質(zhì)，基本鹽溶液(0.05% KH2PO4，0.05% MgSO4·7H2O，0.05% NaCl，0.001% FeSO4·7H2O)，蒸餾水定容，121℃滅菌20 min。固體培養(yǎng)基在上述液體培養(yǎng)基內(nèi)加2%瓊脂。將各菌株1.0×108孢子/mL濃度的孢子懸浮液接種于幾丁質(zhì)液體培養(yǎng)基，搖床120 r/min，25℃振蕩培養(yǎng)3 d后，樣液經(jīng)10000 r/min，4℃離心20 min，取上清液為待測酶液。

蟲體誘導(dǎo)液：取60頭4齡幼蟲，以0.05% Tween-80溶液清洗幼蟲，趁蟲體未干時將其放入菌體平板上，使蟲體表面沾滿分生孢子，然后將幼蟲移至有新鮮甘藍(lán)葉的培養(yǎng)皿中飼養(yǎng)，在接種16 h后(雷妍圓等, 2011)，將蟲體身上的分生孢子用基本鹽溶液洗下來，收集足夠體積后調(diào)整孢子濃度為108孢子/mL，離心取上清液為待測酶液。

1.2.2幾丁質(zhì)酶活性測定方法

氨基葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線：分別配制(100、200、300、400、500)μg/mL氨基葡萄糖溶液，測OD值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.2.1 3,5-二硝基水楊酸(DNS)法

參照王慶云等(2006)方法配制DNS。將上述獲得的酶液于37℃預(yù)熱3 min，取2 mL離心管分別加入200 μL酶液和200 μL膠體幾丁質(zhì)，混合均勻后置于37℃水浴60 min，再往離心管中加入400 μL DNS，沸水加熱10 min。10000 rpm離心10 min，530 nm測OD值。另取一管作為對照，先將酶液沸水煮5 min使酶失活，其余步驟相同。處理和對照各重復(fù)3次。酶活性計(jì)算公式為：

酶活力單位(IU/mL)=5 A·K·n/t

式中t為反應(yīng)時間；A為樣品中平行試驗(yàn)的平均吸光度；K為吸光常數(shù)，由標(biāo)準(zhǔn)曲線得出，數(shù)值上等于A為1時所相當(dāng)?shù)摩蘥數(shù)；n為測定樣品時的稀釋倍數(shù)。酶活力單位(IU/mL)為每1 mL酶液每1 min水解脫乙酰膠體幾丁質(zhì)產(chǎn)生1 μg氨基葡萄糖所需的酶量定義為一個酶活力單位。

1.2.2.2 平板透明圈法

幾丁質(zhì)固體培養(yǎng)基定量15 mL制成幾丁質(zhì)膠體-瓊脂平板。用1 mm2滅菌濾紙片沾取孢子懸浮液，25℃黑暗培養(yǎng)10 d后，以5%的NaOH溶液處理平板，菌落的周圍即顯示出清晰透明的環(huán)狀，這是由于玫煙色棒束孢產(chǎn)生的幾丁質(zhì)酶分解了膠體幾丁質(zhì)所致，用十字交叉法測量透明圈和菌落直徑，以兩者比值r表示產(chǎn)酶水平。重復(fù)3次。

1.3 彈性蛋白酶Pr1活力測定

1.3.1彈性蛋白酶Pr1酶液制備

明膠培養(yǎng)液：用0.05% Tween-80溶液洗下平板的分生孢子，四層擦鏡紙過濾，濾去菌絲等碎片，12000 r/min離心10 min。滅菌水洗滌2次，同上離心收集孢子，然后將孢子接種于明膠液體培養(yǎng)基(1%明膠，基本鹽溶液(0.03% NaCl，0.03% K2HPO4和0.03% MgSO4·7H2O))(胡景江等, 1996)，調(diào)整孢子濃度為108孢子/mL。搖床120 r/min，25℃振蕩培養(yǎng)，分別在4 h、8 h、16 h、24 h取樣，離心取上清液為待測酶液。

蟲體誘導(dǎo)液：取200頭4齡幼蟲，以0.05% Tween-80溶液清洗幼蟲，趁蟲體未干時將放入菌體平板上，使蟲體表面沾滿分生孢子，然后將幼蟲移至有新鮮甘藍(lán)葉的培養(yǎng)皿中飼養(yǎng)，分別在接種后4 h、8 h、16 h、24 h、48 h和72 h將蟲體身上的孢子用基本鹽溶液洗下，收集足夠體積后調(diào)整孢子濃度為108孢子/mL，離心取上清液為待測酶液。

1.3.2彈性蛋白酶Pr1活性測定方法

各菌株P(guān)r1酶活性分析參照St Leger等(1996)方法測定。以短肽Suc-Ala-Ala-Pro-Phe-pNA為專一底物，10 μL底物(1 mM)加入30 μL Tris-HCl(pH7.95，0.1 M)和10 μL酶液，在25-28℃下反應(yīng)5-10 min，于紫外光分光光度計(jì)(Shimadzu UV-1800)測A410值。重復(fù)3次。Pr1產(chǎn)生水平以A410/mL/min表示。

1.4 數(shù)據(jù)處理

用DPS數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)(唐啟義和馮明光, 2002)的鄧肯氏新復(fù)極差法(Duncan’s multiple range test, DMRT)進(jìn)行差異顯著性分析(P<0.05)。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

由氨基葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線求得線性回歸方程為y=0.0015 x+0.0078，R2=0.9953，說明在已知濃度范圍內(nèi)有良好的線性關(guān)系(圖1)。

圖1 氨基葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 The standard curve of glucosamine

2.2 玫煙色棒束孢的幾丁質(zhì)酶水平

分別以DNS和瓊脂平板透明圈法測定的幾丁質(zhì)酶產(chǎn)酶水平如表1。在不同誘導(dǎo)源下，各菌株間幾丁質(zhì)酶活性有顯著差異，分別以培養(yǎng)液和蟲體誘導(dǎo)的酶活由高到低排列皆為IFCF01>IFCF-D58>IFCF-D20>IFCF-D50>IFCF-D。同一菌株在不同誘導(dǎo)源下產(chǎn)酶活性也存在不同程度差異，尤其體現(xiàn)在菌株IFCF01和IFCF-D58上，表現(xiàn)為蟲體誘導(dǎo)產(chǎn)生的酶活顯著高于培養(yǎng)液誘導(dǎo)。幾丁質(zhì)膠體-瓊脂平板上，各菌株的透明環(huán)的直徑與菌落直徑的比值r之間存在顯著差異，幾丁質(zhì)酶水平變化范圍為1.03-1.56，以r的大小作為菌株產(chǎn)幾丁質(zhì)酶水平的大小排列為IFCF01﹥IFCF-D58﹥IFCF-D20﹥IPFCF-D50﹥IFCF-D。DNS法與透明圈比值法測得的各菌株間幾丁質(zhì)酶活性差異趨勢一致。

表1 菌株在不同誘導(dǎo)源下的幾丁質(zhì)酶活性

注：表中數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤，同一列數(shù)據(jù)后不同小寫字母表示經(jīng)DMRT檢驗(yàn)差異顯著(P<0.05)，同一行數(shù)據(jù)后不同大寫字母表示經(jīng)DMRT檢驗(yàn)差異顯著(P<0.05)。Note: Data in a column (row) are presented as Mean±SE, followed by different small (capital) letters indicate significant difference (P<0.05) by DMRT test.

2.3 玫煙色棒束孢的Pr1酶水平

以高致病力菌株IFCF01和低致病力菌株IFCF-D58為例，兩個菌株在蟲體誘導(dǎo)后的4-24 h間均可產(chǎn)生Pr1酶，但酶活性存在差異(圖2)。隨著接種時間的增加，各菌株的Pr1酶活性皆逐漸增高，且菌株IFCF01的產(chǎn)酶量在各時期均顯著高于IFCF-D58。產(chǎn)酶量最高值出現(xiàn)在接種后24 h，該時期IFCF01的Pr1酶活性達(dá)2.34 μg/mL/min，IFCF-D58為0.88 μg/mL/min。菌株IFCF01的產(chǎn)酶量增加最快的時期在8-16 h期間，IFCF-D58產(chǎn)酶量增加最快的時期在16-24 h，在產(chǎn)酶時間上后者比前者晚了約8 h。

2.4 不同誘導(dǎo)源下玫煙色棒束孢IFCF01的Pr1酶水平

分別以明膠液體培養(yǎng)基和蟲體誘導(dǎo)高致病力菌株IFCF01，隨接種時間進(jìn)程其Pr1酶活性變化如圖3。從產(chǎn)酶速度來看，經(jīng)蟲體誘導(dǎo)后產(chǎn)酶量增加最快的時期在8-16 h。從產(chǎn)酶量來看，菌株在蟲體上各時期的產(chǎn)酶量均顯著高于明膠培養(yǎng)基，蟲體誘導(dǎo)的Pr1酶最大產(chǎn)量比明膠液體培養(yǎng)基誘導(dǎo)的最大產(chǎn)量高出約2倍。此外，菌株IFCF01在蟲體上與明膠液體培養(yǎng)基中的產(chǎn)酶方式不完全相同。接種至蟲體后酶活性一直上升，而接種至明膠液體培養(yǎng)基48 h內(nèi)活性上升，至72 h出現(xiàn)下降。

圖2 玫煙色棒束孢IFCF01和IFCF-D58在蟲體上的連續(xù)產(chǎn)Pr1酶情況Fig.2 The Pr1 activity of Isaria fumosorosea IFCF01 and IFCF-D58 induced by Plutella xylostella larvae注：圖中數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤，不同小寫字母表示經(jīng)DMRT檢驗(yàn)在0.05水平上差異顯著。圖3同。Note: Data are presented as Mean±SE, different superscripted small letters indicate significant difference (P<0.05) by DMRT test. Same to Fig.3.

圖3 玫煙色棒束孢IFCF01在明膠液體培養(yǎng)基和蟲體上的連續(xù)產(chǎn)Pr1酶情況Fig.3 The Pr1 activity of Isaria fumosorosea IFCF01 induced by Plutella xylostella larvae and gelatin culture medium

3 結(jié)論與討論

昆蟲病原真菌侵染寄主，從分生孢子萌發(fā)到菌體重新在蟲體上產(chǎn)生孢子的過程，可大致分為體表吸附萌發(fā)、體壁穿透和體內(nèi)定殖等三個階段。孢子穿透表皮需通過合成、分泌一系列胞外水解酶來分解表皮結(jié)構(gòu)成分以完成入侵(Cole and Hoch, 1991)，還必須克服昆蟲體壁上包括抗菌肽、脂肪酸和其它一些物質(zhì)的抑菌作用(Latgéetal., 1987)。一般最先產(chǎn)生蛋白酶降解蛋白質(zhì)，使幾丁質(zhì)和脂類物質(zhì)裸露于蛋白間隙，再分泌幾丁質(zhì)、脂酶等降解幾丁質(zhì)、脂類等物質(zhì)，酶的作用消除了孢子入侵屏障的同時，還給真菌入侵提供了營養(yǎng)(付志堅(jiān)等, 2000)。

多項(xiàng)研究結(jié)果表明，昆蟲病原真菌的致病性與胞外水解酶系的作用密切相關(guān)(樊美珍等, 1991; 胡景江等, 1996; 彭國雄等, 2000; 林海萍等, 2008; 殷紅福等, 2011; 董晶等, 2015)。從本研究結(jié)果來看，用DNS法和瓊脂平板透明圈法測得的5個玫煙色棒束孢菌株間幾丁質(zhì)酶活性差異趨勢一致，皆表現(xiàn)為菌株致病力與酶活水平成正比。經(jīng)蟲體誘導(dǎo)后，各菌株的幾丁質(zhì)酶活性較培養(yǎng)液培養(yǎng)有不同程度的增高，表明小菜蛾幼蟲體壁含有刺激孢子大量產(chǎn)生幾丁質(zhì)水解酶的成分。研究中供試菌株對小菜蛾4齡幼蟲致病力分別為IFCF01﹥IFCF-D58﹥IFCF-D20﹥IFCF-D50﹥IFCF-D(雷妍圓等, 2010)，各菌株在不同誘導(dǎo)條件下測得的幾丁質(zhì)酶產(chǎn)酶水平分別為IFCF01﹥IFCF-D58﹥IFCF-D20﹥IFCF-D50﹥IFCF-D，可見幾丁質(zhì)酶產(chǎn)酶水平與致病力之間有一定的正相關(guān)趨勢，這與此前胞外蛋白酶產(chǎn)生水平與致病力之間具線性相關(guān)的結(jié)論較為一致(雷妍圓等, 2010)。雖然蟲體對低致病力菌株的酶活性有一定的誘導(dǎo)增效作用，但提高效果有限，可能與孢子活力不佳有關(guān)。

玫煙色棒束孢高致病力菌株比低致病力菌株更早產(chǎn)生Pr1酶，表現(xiàn)出更快的產(chǎn)酶速度，說明產(chǎn)Pr1酶速度對侵染速度起著關(guān)鍵作用，其關(guān)系到菌株能否在接種初期成功定殖，以進(jìn)一步侵染和致病寄主。菌株IFCF01在蟲體上各時期的Pr1酶產(chǎn)酶量均顯著高于明膠培養(yǎng)基，其最大產(chǎn)量約為明膠液體培養(yǎng)基的2倍，說明小菜蛾幼蟲表皮成分刺激了孢子大量產(chǎn)酶。受蟲體誘導(dǎo)后IFCF01的產(chǎn)Pr1酶量在8-16 h期間有小幅的快速增長，這與此前通過透射電鏡觀察到該時期分生孢子迅速萌發(fā)、形成附著孢和菌絲穿透表皮層等現(xiàn)象相吻合(雷妍圓等, 2011)。明膠液體培養(yǎng)基對Pr1酶的誘導(dǎo)作用有限，到后期Pr1酶活性呈下降趨勢，可能是由于固定體積的液體內(nèi)，菌株分泌的Pr1酶隨時間進(jìn)程逐漸達(dá)到飽和狀態(tài)，最終由合成轉(zhuǎn)為分解，也可能與培養(yǎng)基中營養(yǎng)物質(zhì)被消耗有關(guān)。

以往的研究多采用蟲尸粉誘導(dǎo)胞外水解酶(彭仁旺等, 1996; 邱立友等, 2000; 鄧彩萍等, 2011)，其誘導(dǎo)效果與蟲尸粉來源有關(guān)，并且因菌株而異。本研究的玫煙色棒束孢供試菌株孢子粉產(chǎn)量高，可實(shí)現(xiàn)活蟲誘導(dǎo)，比使用非寄主昆蟲的蟲尸粉更接近實(shí)際侵染效果。盡管包括本研究在內(nèi)的許多觀點(diǎn)認(rèn)為酶活性與菌株的致病力相關(guān)，但僅以一種或幾種酶的活性來評定菌株致病力仍缺乏客觀性。昆蟲體壁成分的復(fù)雜性和組織結(jié)構(gòu)的多層次性并存，穿壁過程可能是一個多環(huán)節(jié)、多步驟、涉及多種因素的分子事件(彭仁旺等, 1996)，昆蟲病原真菌侵染寄主是多因素共同作用的結(jié)果。本研究僅對不同誘導(dǎo)源下玫煙色棒束孢幾丁質(zhì)酶和Pr1酶活性及各菌株間酶活性差異進(jìn)行了初步探索，還需從宏觀的組學(xué)角度、分子生物學(xué)和遺傳操作等手段作進(jìn)一步的研究。

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StudyoninductionofenzymeactivityofentomopathogenicfungusIsariafumosoroseaSCAU-IFCF01

LEI Yan-Yuan1, Lü Li-Hua1, HE Yu-Rong2*

(1. Guangdong Provincial Key Laboratory of High Technology for Plant Protection/Institute of Plant Protection, Guangdong Academy of Agricultural Sciences, Guangzhou 510640, China; 2. College of Agriculture, South China Agriculture University, Guangzhou 510642, China)

The activity of chitinases and Pr1 protease ofIsariafumosoroseastrains IFCF01, IFCF-D58, IFCF-D, IFCF-D20 and IFCF-D50 was studied under the liquid culture mediums and larvae-induced mediums by DNS method, agar flat method and specific peptide substrate Suc-Ala-Ala-Pro-Phe-pNA respectively. The results showed that two enzymes could be produced in liquid culture medium and larvae-induced medium. The trends of chitinases activities with the change of determined methods among fiveI.fumosoroseastrains were in good agreements, and the chitinease activity of high-pathogenicity strain IFCF01 was significantly higher than those relative low-pathogenicity strains.I.fumosoroseaIFCF01 could secrete high amounts of extracellular chitinase (0.7815 IU/mL) with larvae-induced mediums, which showed significantly higher than that with liquid culture mediums (0.3740 IU/mL). The changing pattern of Pr1 activity was corresponding in larvae-induced mediums during the inoculation process, and the Pr1 activity of high-pathogenicity strain IFCF01 was significantly higher than that of the relative low-pathogenicity strain IFCF-D58. The highest Pr1 activity of strain IFCF01 reached 2.34 μg/mL/min, which was significantly higher than 0.88 μg/mL/min of strain IFCF-D58. Both chitinase and Pr1 activity increased with the larvae-induced medium, which indicated that the activity of enzymes could be enhanced by some cuticle components ofPlutellaxylostellalarvae.

Isariafumosorosea;Plutellaxylostella; chitinase; Pr1; enzyme activity

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Q966;S476

A

1674-0858(2017)05-1000-07

國家自然科學(xué)基金青年科學(xué)基金項(xiàng)目(31401743)；廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院院長基金(201426)

雷妍圓，女，1981年生，博士，助理研究員，研究方向?yàn)槔ハx生物信息學(xué)及分子生物學(xué)，E-mail：leiyanyuan@163.com

*通訊作者Author for correspondence, E-mail: yrhe@scau.edu.cn

Received: 2017-03-22; 接受日期Accepted: 2017-05-15