4株南極真菌的形態(tài)學和分子鑒定及其中3株的蛋白磷酸酶、脂肪酸成分分析

黃金昌，田曉清，樊成奇，喬玉寶，唐瑩瑩馬麗艷，陸亞男，楊 橋，黃洪亮

4株南極真菌的形態(tài)學和分子鑒定及其中3株的蛋白磷酸酶、脂肪酸成分分析

黃金昌1，2，田曉清1，樊成奇1，喬玉寶1，2，唐瑩瑩1，2馬麗艷1，陸亞男1，楊 橋1，黃洪亮1

（1.中國水產(chǎn)科學研究院東海水產(chǎn)研究所，農(nóng)業(yè)部東海與遠洋漁業(yè)資源開發(fā)利用重點實驗室，上海 200090；2.上海海洋大學，上海 201306）

由于極地獨特的地理、氣候及環(huán)境特點，使得極地微生物及其代謝產(chǎn)物具有新穎性與多樣性。采用3種選擇性培養(yǎng)基的稀釋平板涂布法，從南極普里茲灣海洋沉積物中分離得到4株真菌菌株，經(jīng)過形態(tài)學、18s rDNA-ITS序列分析，分別鑒定為隱球酵母 Cryptococcus sp.NJF1、曲霉 Aspergillus sp.NJF3、枝孢霉Cladosporium sp.NJF4和Cladosporium sp.NJF6；對其中的曲霉NJF3、枝孢霉NJF4和NJF6等3株真菌開展了蛋白磷酸酶含量和大田軟海綿酸OA對該酶的抑制作用測試，并分析了菌株提取物中的脂肪酸成分。結(jié)果顯示：NJF3、NJF4和NJF6有很好的蛋白磷酸酶活性，以蛋白磷酸酶-PP為外標，測定酶含量分別為0.732 2 U·g－1、0.678 U·g－1和1.229 2 U·g－1，且100 nM OA對 NJF3和 NJF4蛋白磷酸酶有一定抑制作用，而 NJF6需要200 nM OA才可以輕微抑制其蛋白磷酸酶活性；3株真菌的脂肪酸成分以油酸為主，相對含量分別達到32.4%、37.2%、40.1%，而NJF4和NJF6還含有較高含量的亞油酸，相對含量分別達到 27.3%、29.8%。本研究可為下一步開展菌株的酶、天然代謝產(chǎn)物研究奠定基礎(chǔ)。

極地微生物；Aspergillus sp.；Cladosporium sp.；蛋白磷酸酶；脂肪酸

南極具有獨特的地理及氣候特征，除在短暫的夏季部分地區(qū)有冰雪融化外，其余地區(qū)均常年被冰雪所覆蓋。變化極大的光照輻射、季節(jié)性的光照時間、極低的溫度孕育了特殊的生物多樣性，而特殊的生物多樣性往往孕育著特殊的化學多樣性和生物活性的多樣性［1］。據(jù)不完全統(tǒng)計，南極大陸已發(fā)現(xiàn)大約251個真菌種，其中有至少20個為新種，約占8%，顯示了南極真菌的多樣性和新穎性［2］。

蛋白磷酸酶是一類調(diào)控酶，它主要選擇性地對細胞內(nèi)蛋白的一些氨基酸磷酸化位點進行去磷酸化，從而與蛋白激酶共同調(diào)控細胞內(nèi)蛋白翻譯后的磷酸化修飾水平，在細胞內(nèi)的信號轉(zhuǎn)導、細胞循環(huán)、次生代謝產(chǎn)物及底物的轉(zhuǎn)化過程中起著非常重要的作用［3－6］。而脂肪酸作為微生物一類重要的代謝產(chǎn)物，其組成分析將為菌株代謝產(chǎn)物的深入研究奠定基礎(chǔ)。本研究對4株來自南極普里茲灣海域海泥的真菌進行了分類鑒定，并對其中3株曲霉和枝胞霉進行了蛋白磷酸酶含量和大田軟海綿酸OA對該酶的抑制作用測試，分析了菌株提取物中的脂肪酸成分，以期為下一步開展菌株的酶、天然代謝產(chǎn)物研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 樣品和處理器材

1.1.1 樣品來源

南極海洋沉積物來自中國第29次南極科學考察普里茲灣海域，站位 78°0.6′E、66°56′S。

1.1.2 儀器與試劑

高壓滅菌器（上海申安醫(yī)療器械廠，LDZX-75KBS型）；微生物恒溫培養(yǎng)箱（上海一恒科學有限公司，DHP 9162A型）；大型恒溫培養(yǎng)箱（Shanghai Chemstar Instruments Co Ltd，ATB-032型）；超凈工作臺（北京東聯(lián)哈爾儀器有限公司，DL-CJ-INDII型）；臺式高速離心機（湖南湘儀離心機儀器有限公司，H-1560型）；超聲波清洗器（上海漢克科學儀器有限公司，SK250LH型）；PCR儀（杭州朗基科學儀器有限公司，AG-22331型）；凝膠成像系統(tǒng)（上海天能科技有限公司，GIS-1600型）；顯微鏡（上海光學儀器一廠，XSP-44X.9型）；酶標儀（TECAN，SPARK 10M型）。

試劑：真菌DNA小劑量快速提取試劑盒（上海生工生物公司）；18s引物（上海邁浦生物公司）；PCR擴增體系（康為世紀）；其它試劑均為國藥集團分析純。HP-20大孔吸附樹脂（Mitsubishi Chemical Ltd，Japan）；凝 膠 Sephadex LH-20（Pharmacia Biotech，Sweden）；預制 GF254 TLC硅膠板（青島海洋化學公司）；液相用乙腈（色譜級，Tedia，USA）；其余溶劑均為分析純（AR，上海國藥集團）。

1.1.3 培養(yǎng)基和緩沖液

分離培養(yǎng)基：孟加拉紅固體培養(yǎng)基（蛋白胨5.0 g，葡萄糖 10.0 g，磷酸二氫鉀 1.0 g，硫酸鎂0.5 g，瓊脂 20.0 g，1／3000孟加拉紅溶液 100 mL，陳海水1 000 mL）［8］；PDA固體培養(yǎng)基（馬鈴薯 200.0 g，葡萄糖 10.0 g，瓊脂 18.0 g，陳海水1 000 mL）；YPD固體培養(yǎng)基（酵母膏 10.0 g，蛋白胨20.0 g，葡萄糖20.0 g，瓊脂18.0 g，陳海水1 000 mL）。用于分離菌株時每種培養(yǎng)基添加氯霉素和萘啶酮酸各30 U·mL－1，pH 6.0～6.5［9］。

發(fā)酵培養(yǎng)基：YPD液體培養(yǎng)基。

緩沖溶液（A溶液）：30 mmol·L－1Tris-HCl，2 mmol·L－1EDTA，20 mmol·L－1MgCl2緩沖溶液，pH 8.4，4℃冷藏；BSA溶液（B溶液）：用A溶液配制 0.2 mg·mL－1的 BSA溶液（含 2 mmol·L－1DTT），4℃冷藏；測試溶液（C溶液）：用B溶液配制25 mmol·L－1p-NPP溶液，作為底物溶液，避光保存［7］。

1.2 方法

1.2.1 菌株的分離

稱取1 g左右南極土壤樣品加入到10 mL無菌水中，震蕩混勻后靜置于4℃培養(yǎng)箱中過夜，將樣品懸液做梯度稀釋為 10－1、10－2、10－3、10－4。10－3和10－42個梯度分別取 100μL涂布于孟加拉紅固體培養(yǎng)基、PDA固體培養(yǎng)基和YPD固體培養(yǎng)基上，每個樣品做3個平行。將平板放于27℃培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)。培養(yǎng)約1～2周后待培養(yǎng)基生長出真菌菌落，根據(jù)菌落形態(tài)、所產(chǎn)色素顏色、干燥性等特征挑取形態(tài)差異較大的真菌，及時轉(zhuǎn)移到相應的新鮮培養(yǎng)基上劃線分離純化。為了得到純菌落，分離純化步驟至少進行3次。分離得到的菌株暫時保存于YPD培養(yǎng)基斜面，4℃冰箱備用。

1.2.2 菌落形態(tài)觀察

將純化菌株接種在新鮮YPD培養(yǎng)基平板，于27℃倒置培養(yǎng)7～10 d，觀察并記錄菌落大小、顏色、質(zhì)地、有無分泌物等特征［10］。載玻片上滴一滴清水，刮取少量菌絲體和孢子在清水中分散均勻，蓋上蓋玻片。于光學顯微鏡10×40倍下觀察菌絲形狀、大小等特性及孢子的外形、顏色。仔細觀察并記錄［11］。

1.2.3 r DNA-ITS序列分析

將真菌液體發(fā)酵液減壓抽濾濃縮得菌絲體，取適量菌體于研缽中，加入液氮充分研磨至粉末狀［12］。使用真菌DNA小劑量快速提取試劑盒提取真菌基因組DNA，并于－20℃保存?zhèn)溆谩２捎?18S-EF3：TCCTCTAAATGACCRAGTTTG 和18S-EF4：GGAAGGGRTGTATTTATTAG，擴增真菌18 s r DNA-ITS序列。

PCR擴增體系為50μL∶2×Taq PCR Master Mix 25μL，引物各2μL，模板 DNA 5μL，重蒸水16μL。擴增程序：94℃預變性5 min，94℃變性30 s，56℃退火30 s，72℃延伸1 min，共35個循環(huán)，最后72℃延伸10 min［13］。取5μL PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)質(zhì)量分數(shù)為1%的瓊脂糖凝膠，100 V電泳30 min，檢測 DNA大小，然后用凝膠成像分析系統(tǒng)拍照?；蚪MDNA－20℃保存統(tǒng)一送上海生工生物工程有限公司測序。

測得的序列在Genbank庫與已有的序列進行在線同源比對，選取指標靠前、分類比較相近的種屬序列8～10個，利用ClustalW多序列比對分析［14］，尋找基因突變位點。應用 MEGA 6.0軟件，采用鄰接法（Neighbor-Joining，NJ）對 NJF3、NJF4、NJF6構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，自展法檢測發(fā)育樹，自展數(shù)據(jù)集為1 000次，根據(jù)系統(tǒng)發(fā)育樹中組群關(guān)系對菌株進行分類［15］。

1.2.4 蛋白磷酸酶活性篩選［7］

本實驗采用對硝基苯磷酸二鈉（p-NPP）為底物的方法測定蛋白磷酸酶酶活。p-NPP是無色或稍帶黃色的結(jié)晶固體，在堿性磷酸酶的作用下被水解為游離磷酸及對硝基苯酚，對硝基苯酚在強堿性條件下呈醌式結(jié)構(gòu)而顯示亮黃色，在405 nm處有強烈的吸收峰。

取0.5 g菌絲體（取1.2.3中粉末狀菌絲體）加入3 mL B溶液。超聲30 min，15 000轉(zhuǎn)離心1 h。在96孔微孔板中加入樣品液，然后快速加入底物溶液（總體系200μL）。

測試組：125μL原液＋25μL BSA緩沖液＋50μL底物。

NJF3和NJF4抑制組：125μL原液 ＋23μL BSA緩沖液＋50μL底物＋2μL OA，體系中OA終濃度100 nM。

NJF6抑制組：125μL原液＋21μLBSA緩沖液＋50μL底物＋4μLOA，OA終濃度200 nM。

空白組：150μLBSA緩沖液＋50μL底物。

按時間梯度，使用酶標儀每隔15 min測試、記錄405 nm處的OD值［16］，作時間t-OD值關(guān)系圖。

1.2.5 3株真菌油脂的提取

分離鑒定為曲霉NJF3、枝孢霉NJF4和NJF6的3株真菌各取發(fā)酵液1 L，分別按照如下流程提取油脂成分：減壓過濾得上清液和菌絲體；菌絲體在超低溫冰箱－80℃冷凍12 h，取出后迅速加入0.2 L乙酸乙酯，超聲提取0.5 h，減壓過濾得到提取液，重復提取3次；上清液用0.2 L乙酸乙酯萃取3～4次，收集乙酸乙酯液；合并全部乙酸乙酯液并減壓蒸餾得總油脂部位。因總油脂極性成分較多，不易溶解于正己烷，無法按照食品的脂肪酸分析方法進行有效的前處理，因此分別將3株真菌總油脂部位溶解于50 mL 80%的甲醇溶液，加500 mg氫氧化鉀水解過夜，然后加1M的稀鹽酸中和到pH 7.0，加30 mL石油醚（60～90℃）萃取3次，合并石油醚萃取液并減壓蒸餾，分別得曲霉NJF3油脂0.5 g、枝孢霉NJF4油脂0.7 g和 NJF6油脂 0.6 g。

1.2.6 3株真菌油脂的分析

分別稱取3株真菌的油脂約300 mg，按照GB／T 17376－1998動植物油脂標準進行脂肪酸甲酯制備，再按照GB／T 17376－1998動植物油脂標準進行脂肪酸甲酯的氣相色譜分析；各脂肪酸組分的相對含量以面積歸一法計算得出。待測樣的衍生制備、GC-MS測試及含量計算均由上海市食品研究所檢測中心完成。

2 結(jié)果與分析

2.1 真菌的鑒定

2.1.1 形態(tài)學觀察

菌株NJF1、NJF3、NJF4和NJF6的菌落、菌絲體特征見圖1、圖2，特征描述見表1。

表1 4株南極真菌的菌落、菌絲體特征［17－18］Tab.1 Characteristics of colony and mycelium of 4 strains fungus

圖1 4株南極真菌的菌落照片F(xiàn)ig.1 Photos of 4 strains fungus colony

圖2 4株南極真菌的顯微照片F(xiàn)ig.2 Microphotographs of 4 strains fungus colony

2.1.2 rDNA-ITS分析

PCR擴增18s r DNA并測序，所得序列與Genbank數(shù)據(jù)庫進行同源性比對，4株菌分屬于3個屬，分別為 Cryptococcus sp.、Aspergillus sp.、Cladosporium sp.。序列 ClustalW比對分析后［19］，結(jié)果見圖3。

比對發(fā)現(xiàn)，Cryptococcus antarcticus（AB032630）菌株在667位由C突變?yōu)門，1566位由G突變?yōu)锳；Cryptococcus bhutanenais（AB032620）菌株在699位由C突變?yōu)門。NJF1菌株與Genbank庫的菌株高度同源，結(jié)合形態(tài)學特征可確定為隱球酵母 Cryptococcus sp.NJF1。

由構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹可知，與菌株NJF3序列同源性較高的是曲霉Aspergillus versicolor（GU227343），相似度為 73%；NJF3與 Aspergillus silvaticus（AF548067）和 Aspergillus flavus（D63696）相似度也很高。結(jié)合形態(tài)學特征，確定為曲霉Aspergillus sp.NJF3。與菌株NJF4和NJF6同源性較高的分別是枝孢霉Cladosporium sphaerospermum （KJ443070）和 Cladosporium allicinum（AY251096），且這兩株菌的序列同源性很高。結(jié)合形態(tài)學特征，確定為枝孢霉Cladosporium sp.NJF4和 Cladosporium sp.NJF6。

圖3 菌株NJF1多序列比對分析Fig.3 Multiple sequence alignment analysis of strains NJF1

圖4 菌株NJF3、NJF4和NJF6構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.4 Phylogenetic tree for strains NJF3，NJF4 and NJF6

2.2 株真菌的蛋白磷酸酶活性

以對硝基苯磷酸二鈉（p-NPP）為底物，分別測定曲霉NJF3、枝孢霉NJF4和NJF6的蛋白磷酸酶酶活，反應進程見圖5。

圖5 NJF3、NJF4和NJF6蛋白磷酸酶酶活反應進程圖Fig.5 Enzyme reaction process diagrams of NJF3，NJF4 and NJF6

由圖5可知，NJF3菌株和NJF4菌株的酶反應緩慢，在測試時間內(nèi)呈不斷上升趨勢。該兩株菌抑制組OD值略低于原液組，可知100 nM OA對它們的蛋白磷酸酶有輕微抑制作用。NJF6菌株的酶反應迅速，體系的OD值45 min時達到3.50，之后不再發(fā)生明顯變化，可知反應到達終點。OA是選擇性的蛋白磷酸酶抑制劑［20］，對蛋白磷酸酶不同亞型的抑制活性有較大差異，對PP1、PP2A的 IC50分別為 312、1.2 nM。3株真菌中的蛋白磷酸酶可能具有一定的結(jié)構(gòu)性能差異，因此OA對它們表現(xiàn)出不同的作用效果。

為測定各菌株蛋白磷酸酶含量，選取蛋白磷酸酶λ-PP作為外標，在反應時間30 min點采集不同濃度的 λ-PP蛋白磷酸酶（4、8、12、16、20 U）OD值，作吸光度-酶含量標準曲線（圖6）。

圖6 λ-PP蛋白磷酸酶反應進程30 min標準曲線圖Fig.6 Standard curve of proteinλ-PP phosphatase reaction at 30 min

在反應時間為30 min點采集不同菌株原酶液及原酶液＋不同濃度OA的去磷酸化反應體系的OD值，根據(jù)標準曲線計算3株真菌原酶液及原酶液＋不同濃度OA后的蛋白磷酸酶含量。數(shù)據(jù)結(jié)果（表2）表明：NJF3、NJF4和 NJF6均含有不同量的蛋白磷酸酶，且菌株NJF6含量最高，為1.229 2 U·g－1；100 nM OA對 NJF3和 NJF4磷酸酶反應有一定抑制作用，尤其是NJF3菌株的抑制組蛋白磷酸酶含量為0.679 2 U·g－1菌體，相比原液組下降較為明顯，而NJF6菌株需要200 nM OA才可以輕微抑制其蛋白磷酸酶活性。

表2 菌株NJF3，NJF4和NJF6蛋白磷酸酶含量Tab.2 Protein phosphatase content of strains NJF3，NJF4 and NJF6

磷酸化是細胞內(nèi)蛋白翻譯后修飾的主要途徑之一［21］，真菌菌株 NJF3、NJF4和 NJF6的蛋白磷酸酶測試結(jié)果為后續(xù)嘗試利用表觀遺傳學方法調(diào)控菌株的代謝過程［22］，即利用蛋白磷酸酶抑制劑影響菌株細胞內(nèi)蛋白翻譯后的磷酸化修飾水平，進而影響次級產(chǎn)物多樣性奠定了基礎(chǔ)。

2.3 3株真菌的脂肪酸組成

曲霉NJF3、枝孢霉NJF4和NJF6的油脂分別經(jīng)衍生制備和GC-MS測試分析，所含的脂肪酸種類及其相對含量結(jié)果見表3。從所含飽和脂肪酸看，3株真菌油脂的相同點在于均是以棕櫚酸、硬脂酸為主，棕櫚酸分別為 31.8%、18.0%和16.7%，硬脂酸分別為 19.6%、13.6%和 13.4%；差異在于曲霉NJF3的總飽和脂肪酸和棕櫚酸含量明顯高于其它2個菌株，且二十四碳酸相對含量也達到3.5%，而枝孢霉NJF4和NJF6的其它短鏈、長鏈脂肪酸成分較為微量或者未能檢出。

表3 NJF3，NJF4和NJF6的脂肪酸組成Tab.3 Fatty acid composition of NJF3，NJF4 and NJF6

在不飽和脂肪酸方面，曲霉 NJF3、枝孢霉NJF4和NJF6的總不飽和脂肪酸相對含量分別達到 38.4%、66.5%、69.9%，曲霉 NJF3的總不飽和脂肪酸顯著低于枝孢霉NJF4和NJF6；3株真菌不飽和脂肪酸均以油酸為主，相對含量分別達到 32.4%、37.2%、40.1%，而 NJF4和 NJF6還含有較高含量的人體必需的亞油酸，相對含量分別達到 27.3%、29.8%。

分析結(jié)果表明，枝孢霉NJF4和NJF6的總不飽和脂肪酸、油酸、亞油酸含量較為豐富，總飽和脂肪酸、棕櫚酸、硬脂酸含量較低，總體上二者質(zhì)量較為接近，因此，枝孢霉NJF4和NJF6的油脂在不飽和脂肪酸利用方面可能具有較好的應用潛力。在以往的相關(guān)報道中，極地真菌脂肪酸中不飽和脂肪酸含量達到60%以上的報道尚少，尤其是NJF6不飽和脂肪酸含量達69.9%，比已發(fā)現(xiàn)的青霉和曲霉生產(chǎn)油脂得到的不飽和脂肪酸含量高很多。而曲霉NJF3總飽和脂肪酸、棕櫚酸、硬脂酸含量偏高，總不飽和脂肪酸尤其是亞油酸含量較低，脂肪酸類成分質(zhì)量上與枝孢霉NJF4和NJF6差距較大，利用價值相對較小。

3 小結(jié)

本研究自南極普里茲灣海洋沉積物中分離得到4株真菌菌株，分屬于隱球酵母Cryptococcus sp.NJF1、曲 霉 Aspergillus sp.NJF3、枝 孢 霉Cladosporium sp.NJF4和 Cladosporium sp.NJF6。經(jīng)測定，NJF3、NJF4和NJF6有很好的蛋白磷酸酶活性。同時，測試大田軟海綿酸OA對該酶的抑制作用，結(jié)果顯示：100 nM OA對NJF3和NJF4蛋白磷酸酶有一定抑制作用，而NJF6需要200 nM OA才可以輕微抑制其蛋白磷酸酶活性。分析NJF3、NJF4和NJF6的油脂成分，均以油酸為主，而NJF4和NJF6還含有較高含量的亞油酸，在不飽和脂肪酸利用方面可能具有較好的應用潛力。

［1］ 張波濤，繆錦來，李光友，等.極地微生物活性物質(zhì)研究進展［J］.海洋科學，2004，28（2）：58－63.

ZHANG B T，MIAO J L，LI G Y，et al.Research progress of polar microbial active substances［J］.Marine science，2004，28（2）：58－63.

［2］ 朱天驕，車 茜，李德海，等.南極真菌多樣性及代謝產(chǎn)物研究［C］.“全球變化下的海洋與湖沼生態(tài)安全”學術(shù)交流會，2014，江蘇南京.

ZHU T J，CHE Q，LI D H，et al.Studies on the diversity and metabolism of fungi in Antarctica［C］.‘Marine and lake ecological security under global change’Academic seminar，2014，NanJing China.

［3］ COHEN P T W.Novel protein serine／threonine phosphatases：variety is the spice of life［J］.Trends in Biochemical Sciences，1997，22（7）：245－251.

［4］ JACKSON M D，DENU J M.Molecular reactions of protein phosphatases-insights from structure and chemistry［J］.Chemical Reviews，2001，32（40）：2313－2340.

［5］ TAMURA S，TORIUMI S，SAITO J，et al.PP2C family members play key roles in regulation of cell Survival and apoptosis［J］.Cancer Science，2006，97（7）：563－567.

［6］ TONG Y，QUIRION R，SHEN SH，et al.Cloning and characterization of a novel mammalian PP2C isozyme［J］.The Journal of Biological Chemistry，1999，273（52）：35282－35290.

［7］ 郭萌萌，吳海燕，薛瑞宇，等.磷酸酶抑制比色法快速測定貝類中腹瀉性貝毒素［J］.現(xiàn)代食品科技，2014，30（6）：263－267.

GUO M M，WU H Y，XUE R Y，et al.To determine the Diarrhetic Shellfish Poisoning in shellfish with the phosphatase inhibition methods［J］.Modern Food Science and Technology，2014，30（6）：263－267.

［8］ 張初署，劉 陽，邢福國，等.七種培養(yǎng)基對黃曲霉分離效果的比較［J］.核農(nóng)學報，2013，27（2）：208－212.

ZHANG CS，LIU Y，XING F G，et al.The effect comparison of seven kinds of culture medium to Aspergillus flavus［J］. Journal of Nuclear Agricultural Sciences，2013，27（2）：208－212.

［9］ MAHLER H R，PERLMAN P，HENSON C，et al.Selective effects of chloramphenicol，cycloheximide and nalidixic acid on the biosynthesis of respiratory enzymes in yeast［J］.Biochemical and Biophysical Research Communications，1968，31（3）：474－480.

［10］ 龍良鯤，姚 青，羊宋貞，等.一株叢枝菌根真菌的形態(tài)與分子鑒定［J］.華南農(nóng)業(yè)大學學報，2006，27（4）：40－42.

LONG L K， YAO Q， YANG S Z， et al.Morphological and molecular identification of an arbuscular mycorrhizal fungi［J］.Journal of South China Agricultural University，2006，27（4）：40－42.

［11］ 倪孟祥，胡 穎.北極海泥來源抗菌活性真菌的篩選及菌株H5的初步研究［J］.化學與生物工程，2013，30（5）：61－64.

NI M X，HU Y.Screening of antibacterial active fungi and preliminary study of strain H5 in arctic sea mud［J］.Chemical and Biochemical Engineering，2013，30（5）：61－64.

［12］ 蔡文嬌，徐大彬，藍 霞，等.一種提取真菌基因組DNA的新方法［J］.農(nóng)業(yè)研究與應用，2014（3）：1－5.

CAI W J，XU D B，LAN X，et al.A new method for extracting DNA from a fungal genome ［J］.Agricultural Research and Application，2014（3）：1－5.

［13］ BRUNATI M，ROJAS J L，SPONGA F，et al.Diversity and pharmaceutical screening of fungi from benthicmats of Antarctic lakes［J］. Marine Genomics，2009，2（1）：43－50.

［14］ 周啟武，趙寶玉，路 浩，等.苦馬豆內(nèi)生真菌分離鑒定與多樣性分析［J］.畜牧獸醫(yī)學報，2013，44（3）：465－474.

ZHOU QW，ZHAOB Y，LU H，et al.Separation and identification and diversity analysis of endogenous fungi in Sphaerophysa salsula［J］.Acta Veterinaria Et Zootechnica Sinica，2013，44（3）：465－474.

［15］ 李艷玲，王德才，史仁玖，等.泰山黃精內(nèi)生真菌的分離鑒定及抑菌活性研究［J］.中草藥，2013，44（11）：1490－1494.

LI Y L，WANG D C，SHI R J，et al.Isolation and identification and antibacterial activity of endogenous fungi in Polygonatum sibiricum Red［J］.Chinese Herbs，2013，44（11）：1490－1494.

［16］ 趙小峰.堿性磷酸酶分離純化和比活性測定實驗的優(yōu)化［J］.生物學通報，2013，48（1）：45－47.

ZHAO X F.The separation and purification of alkaline phosphatase and the optimization of specific activity determination experiment ［J］. The Biological Bulletin，2013，48（1）：45－47.

［17］ 容 爍，韓建榮.絲狀真菌 Mars菌落特征初步研究［J］.科技情報開發(fā)與經(jīng)濟，2008，18（32）：150－151.

RONG S，HAN J R.A preliminary study on the characteristics of filamentous fungi Mars［J］.Sci-Tech Information Development＆Economy，2008，18（32）：150－151.

［18］ VILENA G K，F(xiàn)UJIKAWA T，TSUYUMU S，et al.Structural analysis of biofilms and pellets of Aspergillus niger by confocal laser scanning microscopy and cryo scanning electron microscopy［J］.Bioresource Technology，2010（101）：1920－1926.

［19］ TAN G，MUFFATO M，LEDERGERBER C，et al.Current methods for automated filtering of multiple sequence alignments frequently［J］.Society of Systematic Biologists，2015，64（5）：778－791.

［20］ 周 鑰，張學景，蔡于琛，等.蛋白磷酸酶1和2A抑制劑的研究進展［J］.中國藥學雜志，2007，42（5）：324－328.

ZHOU Y，ZHANG X J，CAI Y C，et al.Research progress in protein phosphatase 1 and 2A inhibitors［J］.Chinese Journal of Pharmaceuticals，2007，42（5）：324－328.

［21］ 阮班軍，代 鵬，王 偉，等.蛋白質(zhì)翻譯后修飾研究進展［J］.中國細胞生物學學報，2014，36（7）：1027－1037.

RUAN B J，DAI P，WANG W，et al.Research progress of protein post-translational modification［J］.Chinese Journal of Cell Biology，2014，36（7）：1027－1037.

［22］ 張 偉，陳 敏，邵長倫，等.化學表觀遺傳修飾方法在真菌次級代謝產(chǎn)物研究中的應用［J］.中國海洋藥物，2014，33（5）：83－91.

ZHANG W，CHEN M，SHAO C L，et al.The application of chemical epigenetic modification on the study of secondary metabolites in fungi［J］.Chinese Journal of Marine Drugs，2014，33（5）：83－91.

Antarctic fungi：molecular identification，analysis of their protein phosphatase and fatty acid

HUANG Jin-chang1，2，TIAN Xiao-qing1，F(xiàn)AN Cheng-qi1，QIAO Yu-bao1，2，TANG Ying-ying1，2，MA Li-yan1，LU Ya-nan1，YANG Qiao1，HUANG Hong-liang1
（1.Key laboratory of East China Sea＆Oceanic Fishery Resources Exploitation and Utilization，Ministry of Agriculture，East China Sea Fisheries Research Institute，Shanghai 200090，China；2.Shanghai Ocean University，Shanghai 201306，China）

Due to the unique characteristics of geography，climate and environment，the microorganisms in polar area and their metabolites show high diversity and novelty.4 fungus strains were isolated from an Antarctic marine sediment sample collected in Prydz Bay by dilution-plate method with 3 selective culture mediums.They were identified as Cryptococcus sp.NJF1，Aspergillus sp.NJF 3，Cladosporium sp.NJF4 and Cladosporium sp.NJF6 with morphological and 18 s rDNA-ITS sequence analysis.Assay of protein phosphatase content and inhibitory effect of okadaic acid（OA）to the protein phosphatase，as well as fatty acid analysis of Aspergillus sp.NJF3，Cladosporium sp.NJF4 and NJF6 were carried out.Good results of protein phosphatase were obtained，and by comparison with theλ-PP standard，the protein phosphatase content reached 0.7322 U· g－1，0.678 U· g－1and 1.2292 U· g－1in NJF3，NJF4 and NJF6，respectively.The protein phosphatase in NJF3 and NJF4 were weakly inhibited by 100 nM OA，while that in NJF6 could only be slightly inhibited by 200 nM OA.Oleic acid was the major fatty acid in these three fungi strains with relative content of 32.4%，37.2%and 40.1%，respectively，and there was also high content of linoleic acid at 27.3%and 29.8%in NJF4 and NJF6.This study laid a foundation for the future investigation on the enzyme and natural metabolites of these fungi strains.

polar microorganisms；Aspergillus sp.；Cladosporium sp.；protein phosphatase；fatty acid

Q 939

A

1004－2490（2017）05－0562－09

2017－04－06

公益性行業(yè)（農(nóng)業(yè)）科技專項（No.201203018）；南極周邊海域磷蝦等生物資源考察與評估專項（No.CHINARE2016－01－06，CHINARE2017－01－06）

黃金昌，男，碩士研究生，研究方向為天然產(chǎn)物化學。

陸亞男，副研究員。E-mail：luyn＠ecsf.ac.cn