磺胺類抗生素與胞外聚合物作用的熱化學機制

王 靜,張程程,吉芳英*,晏 鵬

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磺胺類抗生素與胞外聚合物作用的熱化學機制

王 靜1,張程程2,吉芳英2*,晏 鵬3

(1.重慶建筑工程職業(yè)學院交通與市政工程系,重慶 400072；2.重慶大學三峽庫區(qū)生態(tài)環(huán)境教育部重點實驗室,重慶 400045；3.中國科學院重慶綠色智能技術研究院,重慶 400714)

本研究利用等溫滴定微量熱技術獲得了胞外聚合物和磺胺類抗生素的相互作用的熱力學參數,探索了其作用機制.結果表明,胞外蛋白和磺胺二甲基嘧啶(SMZ)強烈結合,結合過程由疏水相互作用驅動的熵作為主要驅動力.結合強度顯著地受pH和離子強度的影響.在pH為6.8的近中性條件下,EPS和SMZ的結合反應最有利,且構象變化最大.離子強度對EPS和SMZ之間的相互作用有明顯的影響.該研究的結果表明,活性污泥中存在的EPS對抗生素的遷移轉化有顯著影響.

胞外聚合物；等溫滴定微量熱；磺胺二甲基嘧啶；pH值；離子強度

磺胺類抗生素是現代醫(yī)學中常用的一類人工合成的抗菌消炎藥,因生產成本低、抗菌廣譜等優(yōu)勢現已成為世界上應用最為廣泛的抗生素之一[1-3].由于它們對微生物具有抑制效應,常規(guī)的活性污泥法對其去除效果非常有限,導致它們在污水廠出水中有殘留,已在世界各地包括我國的污水處理廠出水中檢出[4].

胞外聚合物(EPS),是由微生物在一定條件下分泌的高分子物質,覆蓋在微生物細胞表面及填充在污泥絮體內部空隙中[5].EPS具有大量的活性官能團和疏水區(qū)域,有很強的吸附和絡合污染物的能力[6-8].

磺胺類抗生素在污水處理廠的有效去除主要依賴于污泥絮體的吸附和生物降解[9-10],其中作為活性污泥主要成分的EPS對磺胺類抗生素的吸附具有重要的研究意義和價值,這引起了國內外污水處理領域相關學者的廣泛關注[11].目前,通常采用化學分析法結合吸附模型的方式研究EPS與磺胺類抗生素的相互作用[12].但是,該方法具有耗時、精度低、靈敏度低等缺點,極大的阻礙了對其相互作用機制的認識.等溫滴定微量熱法是近年來發(fā)展起來的一種直接測量生物分子結合過程中的放熱或者吸熱的技術,在單次實驗中即可提供一系列有關分子相互作用的完整信息[13].等溫滴定微量熱法與常規(guī)分析方法相比具有靈敏度高、精度高、快速、免標記、無損、原位等特點.本研究運用等溫滴定微量熱法探討EPS模擬物與磺胺類抗生素的結合程度,以及離子強度和pH值對結合程度的影響.從熱力學的角度深入探討EPS與磺胺類抗生素間的相互作用機制,明晰EPS在磺胺類抗生素去除過程中所起的作用,揭示磺胺類抗生素去除過程中的干擾因素和影響規(guī)律,為磺胺類抗生素在活性污泥系統(tǒng)中的高效去除提供理論依據.

1 材料與方法

1.1 儀器與材料

牛血清白蛋白、葡聚糖、腐殖酸鈉、磺胺二甲基嘧啶(SMZ),試劑均為分析純.枯草芽孢桿菌菌種(ATCC6633,廣州省微生物菌種保藏中心).酵母浸粉、蛋白胨均購于北京奧博星生物技術有限責任公司.

ITC200型等溫滴定微量熱儀,DW-86L386型超低溫冰箱,Virtis BT4KXL型冷凍干燥機.

1.2 實驗方法

1.2.1 細菌培養(yǎng)與EPS 提取冷凍干燥的枯草芽孢桿菌菌種,于滅活培養(yǎng)基(5g/L酵母浸粉,10g/L蛋白胨,5g/L NaCl)中在30℃下培養(yǎng)24h,隨后取1~2mL轉移至250mL滅活培養(yǎng)基中,培養(yǎng)40h(30℃),然后提取EPS.將細胞懸浮液分裝于50mL離心管中離心(5000,4℃,20min),去除上清液,小心清洗剩余球團1~2次,后加入去離子水將球團沖洗下來至燒杯或錐形瓶超聲(功率40%,時間3min×2次),將懸浮液轉移至離心管,在4℃(7800~ 8000)離心50min,上清液即為EPS.經0.45μm濾膜過濾,而后冷凍干燥,于–40℃保存?zhèn)溆?

1.2.2 EPS模擬物與SMZ結合實驗 EPS的主要組成物質為蛋白質和多糖,腐殖質,通常以牛血清白蛋白(BSA)、葡聚糖(Glucan)和腐殖酸鈉(HA-Na)為EPS組分中的蛋白、多糖和腐殖質類物質的模擬物[14-16].所有溶液均用PBS緩沖液(1mmol/L, pH 6.8)配制.等溫滴定的主體牛血清白蛋白(BSA)、葡聚糖和HA-Na濃度均為5g/L,配體SMZ濃度為0.5g/L.所有的溶液在滴定前進樣過程中真空脫氣,以防出現氣泡干擾熱量檢測.

1.2.3 環(huán)境因素實驗 采用磷酸鹽緩沖體系調節(jié)pH值為5.7、6.8和8.0的緩沖液(1mmol/L).用NaCl調節(jié)離子強度分別為5mmol/L、50mmol/L和500mmol/L的 IS 1、IS 2 和IS 3溶劑.不同pH值和離子條件下主體EPS的濃度為5g/L,配體SMZ的濃度為0.5g/L,用ITC-200測定反應中吸收和放出的熱量.

1.2.4 等溫滴定微量熱法 反應體積: 0.2mmol/L,進樣針容積為40μL,反應溫度:20℃;總注射次數: 19次;參照功率:5μCal/s;攪拌器轉速:1000r/min.磺胺二甲基嘧啶溶液和PBS緩沖液分別滴定EPS模擬物,其中緩沖液滴定EPS模擬物為實驗對照,用于扣除反應過程中的稀釋熱量.數據用Origin 7.0進行擬合分析得到結合化學計量數(),結合常數()和焓變(Δ).

2 結果與討論

2.1 EPS組分對結合反應的影響

對EPS模擬物與SMZ的結合反應進行ITC檢測,熱譜圖見圖１,獲得的結合參數見表１.由圖1可知,SMZ與BSA和HA-Na結合的每一次滴定有明顯的負峰出現,表明相互作用均是放熱過程;而與葡聚糖的滴定反應熱譜圖中,每一次滴定基本出現正峰,第二滴的峰面積為0.57313μcals,低于1μcals,且每滴的熱量變化微弱,表明SMZ與EPS中多糖模擬物葡聚糖的結合十分微弱.

SMZ與BSA和HA-Na非線性擬合出的熱力參數、推導得到的吉布斯自由能變Δ及熵變Δ如表1所示.SMZ與BSA和HA-Na結合的吉布斯自由能變Δ和Δ皆為負值,表明均為典型的可自發(fā)進行的放熱反應.SMZ與BSA的結合化學計量數為0.865sites,是SMZ與HA-Na的結合化學計量數(0.176sites)的近5倍; SMZ與BSA結合的結合常數比與HA-Na結合的結合常數略小1個數量級,表明EPS中的蛋白模擬物BSA較腐殖質模擬物HA-Na與SMZ的結合容量更大,但后者的復合物更穩(wěn)定.SMZ與BSA結合過程中的熵變Δ< 0,｜Δ｜>｜ＴΔ｜,表明結合后體系構象變化受到限制[17],BSA與SMZ的結合是以氫鍵和范德華力為主要作用力的焓驅動過程.而SMZ與HA-Na結合過程中的熵變Δ> 0,｜Δ｜<｜ＴΔ｜,說明體系的無序度增加[18],反應主要是以疏水性相互作用為主要驅動力的熵驅動過程[19].

圖1 SMZ與EPS模擬物結合的熱譜圖和非線性擬合

a- SMZ to BSA,b- SMZ to HA-Na,c- SMZ to Glucan

表1 SMZ與EPS模擬物的反應熱力學參數

2.2 pH、離子強度對結合反應的影響

不同pH條件下EPS分別與SMZ的滴定反應的熱譜圖及非線性擬合圖分別如圖2所示.熱譜圖均有典型的負峰,表明EPS與SMZ的結合在不同pH條件下均為放熱反應.EPS與SMZ在接近中性條件時結合放出的熱量相對酸性和堿性條件下較小,擬合曲線斜率較低.由表2中EPS與SMZ結合的熱力學參數可知,不同pH條件下,吉布斯自由能變Δ均小于零,且–ΔpH6.8>– ΔpH8.0>–ΔpH5.7,表明EPS與SMZ的結合反應在熱力學上是有利的自發(fā)反應,在pH 6.8時反應在熱力學上最為有利;結合常數的大小順序為:pH6.8>pH8.0>pH5.7,且pH6.8高出一個數量級,表明EPS-SMZ結合物在近中性條件下穩(wěn)定性最好;EPS與SMZ結合過程中反映構象變化的熵變Δ均大于零,大小順序為ΔpH6.8>ΔpH8.0>ΔpH5.7,表明體系的無序度均增加[18],且在近中性條件時體系構象變化最大;由|Δ|<|TΔ|,表明EPS與SMZ的結合反應是以疏水性相互作用為主要驅動力的熵驅動過程[19],不同pH條件下EPS與SMZ結合的化學計量數變化不大且均接近1sites,皆略大于與EPS的蛋白類模擬物BSA與SMZ的結合化學計量數(0.865sites),表明EPS中的蛋白類物質在結合SMZ的過程中發(fā)揮著重要作用.由此可知,EPS與SMZ的結合化學計量比受到溶液pH的影響程度不大,但在近中性條件pH 6.8時,EPS與SMZ的結合反應熱力學上最為有利,構象變化最大,EPS-SMZ結合物穩(wěn)定性最高.

圖2 不同pH下對SMZ與EPS結合的熱譜圖及其非線性擬合

a- pH 5.7,b- pH 6.8,c- pH 8.0

表2 不同pH下SMZ與EPS反應的熱力學參數

不同離子強度(IS)下EPS與SMZ滴定反應的熱譜圖及非線性擬合圖分別如圖3所示.從圖3可以看出,離子強度IS 1(5mmol/L)和IS 3(500mmol/L)條件下,EPS和SMZ反應的熱譜圖均出現典型的負峰,表明在低離子強度和高離子強度下的結合均為放熱反應;而在IS 2(50mmol/L)條件下,EPS與SMZ反應的熱譜圖均為正峰,表明該條件下的結合反應為吸熱反應.

據表3,各離子強度下EPS與SMZ結合的吉布斯自由能變Δ均為負,表明反應均是熱力學上有利的自發(fā)過程.在離子強度為5mmol/L時,Δ為–4.10′104cal/(mol×K),表明EPS與SMZ在該條件下的結合中體系有序度大幅增加,結合化學計量數極小.在離子強度為50mmol/L時,Δ(1555 ± 394.0) cal/mol為正,表明在該條件下的反應是一個吸熱過程.由式知,負焓變和正熵變有利于熱力學的自發(fā)反應,在溶液離子強度50mmol/L時,Δ> 0,Δ> 0,表明該反應是一個由熵驅動的過程;離子強度500mmol/L時,Δ< 0,Δ> 0,表明在高離子強度下,EPS與SMZ的結合反應是一個由焓熵共同驅動的過程,但｜Δ｜<｜ＴΔ｜,表明結合反應主要是以疏水性相互作用為主要驅動力的熵驅動過程[17].對比離子強度分別為5mmol/L、50mmol/L及500mmol/L條件下EPS與SMZ結合的熱力學參數大小,發(fā)現離子強度5mmol/L時,EPS與SMZ結合微弱;IS在50mmol/L和500mmol/L之間,溶液離子強度越高,EPS與SMZ的結合常數和負吉布斯自由能變–Δ越大,表明高離子強度下EPS與SMZ的結合更易自發(fā)進行,且EPS-SMZ結合物更穩(wěn)定;但焓變絕對值｜Δ｜、熵變Δ和結合化學計量數越小,表明高離子強度不利于EPS與SMZ的大量結合.綜上表明,EPS與SMZ的相互作用受離子強度影響顯著,過低和過高離子強度均不利于二者的結合.

圖3 不同離子強度下對SMZ與EPS結合的熱譜圖及其非線性擬合

a-5mmol/L,b-50mmol/L,c-500mmol/L

表3 不同離子強度下SMZ與EPS反應熱力學參數

3 結論

3.1 SMZ與BSA的結合化學計量數為0.865sites,結合是以氫鍵和范德華力為主要作用力的焓驅動過程;SMZ與HA-Na的結合化學計量數為0.176sites,結合是以疏水性相互作用為主要驅動力的熵驅動過程.SMZ與葡聚糖無明顯結合.因此在活性污泥系統(tǒng)中,SMZ的去除過程EPS的蛋白類物質發(fā)揮著重要作用,EPS與SMZ的結合是以疏水性相互作用為主要驅動力的熵驅動過程.

3.2 pH對EPS與SMZ結合化學計量數的影響較小,但在中性條件時,EPS與SMZ的結合反應在熱力學上最為有利,體系構象變化最大,且EPS-SMZ結合物穩(wěn)定性最高.

3.3 離子強度對EPS與SMZ的相互作用具有顯著影響EPS與SMZ在離子強度5mmol/L時,結合微弱;在50mmol/L和500mmol/L之間,離子強度越高,EPS與SMZ的結合更易自發(fā)進行,且復合物更穩(wěn)定,但結合化學計量數較小.

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Thermochemical mechanism of the interaction between sulfamethazineantibiotics and extracellular polymers.

WANG Jing1, ZHANG Cheng-cheng2, JI Fang-ying2*, YAN Peng3

(1.Department of Traffic and Municipal Engineering, Chongqing Jianzhu College, Chongqing 400072, China；2.Key Laboratory of the Three Gorges Reservoir Region’s Eco-Environments, Ministry of Education, Chongqing University, Chongqing 400045, China；3.Chongqing Institute of Green and Intelligent Technology, Chinese Academy of Sciences, Chongqing 400714, China)., 2017,37(10)：3758~3763

Thermodynamic parameters of interactions between extracelluar polymeric substances (EPS) and sulfamethazine antibiotics were investigated by isothermal titration calorimetry (ITC) in this study. Results showed that extracellular proteins strongly combined with sulfamethazine (SMZ), and the binding process depended on entropy driven by the hydrophobic interaction as the main driving force. The binding was significantly affected by pH and ionic strength. The binding of EPS and SMZ and the conformational change was the most favorable and the maximal, respectively, at the condition of pH 6.8. The ionic strength had a significant effect on the interaction between EPS and SMZ. The results implied that EPS contained in activated sludge may had a significant influence on the fate of antibiotics in water environment.

extracelluar polymeric substances；isothermal titration calorimetry (ITC)；sulfamethazine；pH；ionic strength

X703

A

1000-6923(2017)10-3758-06

王 靜(1985-),女,四川樂山人,碩士,講師,主要從事水污染控制技術研究.發(fā)表論文10篇.

2017-03-30

國家水體污染控制與治理重大科技專項(2013ZX07315- 001-02);重慶市建設科技計劃項目(城科字2015第1-32號);重慶市教委科學技術研究項目(:KJ1504207);重慶建筑工程職業(yè)學院青年基金項目.

* 責任作者, 教授, jfy@cqu.edu.cn