發(fā)現(xiàn)控制晝夜節(jié)律的分子機制的科學背景

卡洛斯·伊巴涅斯

2017年度諾貝爾生理學或醫(yī)學獎授予了杰弗里·霍爾、邁克爾·羅斯巴什和邁克爾·楊，以獎勵他們發(fā)現(xiàn)的控制晝夜節(jié)律的分子機制。晝夜節(jié)律由內部生物鐘驅動，這個微生物鐘能預期晝夜循環(huán)以優(yōu)化生物體的生理和行為。

生物體能夠在生理和行為上適應晝夜節(jié)律的時間，這一發(fā)現(xiàn)已經很久了，但內生晝夜節(jié)律鐘的存在一直到20世紀之后才最終確定下來。1971年，西摩·本澤爾和羅納德·科諾普卡辨認出果蠅突變體表現(xiàn)出24小時正常周期的蛹孵化和自主活動的變化。實驗表明，突變涉及相同的基因，后來被命名為周期（per）。

10年之后，在布蘭迪斯大學展開合作的霍爾和羅斯巴什以及洛克菲勒大學的楊分離出該周期基因并對其進行了分子表征，但其結構和序列并沒有立即表明晝夜節(jié)律鐘的分子機制?；魻?、羅斯巴什和楊的一系列突破，最終得出了轉錄翻譯反饋回路（TTFL）的概念。在這種機制中，per 及其伴侶基因永恒（tim）的轉錄被其自身的基因產物——周期（PER）和永恒（TIM）——蛋白質壓制，產生自主振蕩。當時的轉錄機制并不明顯，自發(fā)維持的晝夜TTFL的發(fā)現(xiàn)是一個新的范式。

之后，三位科學家進一步的研究揭示了一系列互鎖的TTFL，以及復雜的反應網絡。這些研究成果涉及蛋白磷酸化的調節(jié)和TTFL 組分降解、蛋白復合物裝配、核易位以及其他翻譯后修飾，會產生約24小時一個周期的振蕩。單個細胞中的晝夜節(jié)律振蕩器對攜帶信號的反應不同，并控制各種生理輸出，例如睡眠模式、體溫、激素釋放、血壓和代謝?；魻枴⒘_斯巴什和楊的創(chuàng)新發(fā)現(xiàn)揭示了解釋晝夜節(jié)律適應的重要生理機制，對人類健康和疾病的研究具有重要意義。

是什么讓我們產生時間概念？

地球上生命的一個重要特征就是適應環(huán)境的能力。不同的地理位置具有不同的環(huán)境，生物體會逐漸適應不同的環(huán)境條件以增強其生存力。然而，在任何一個位置，由于地球在其軸上的旋轉，每天都會發(fā)生光和溫度的重大變化。為了適應這種變化，大多數(shù)生物體已經發(fā)展出一種內部的生物鐘，可以預測晝夜的周期，并幫助它們優(yōu)化其生理和行為。這種內在的日常節(jié)奏被稱為“晝夜節(jié)律”。晝夜節(jié)律在生命的整個進化過程中是一直存在的。我們知道，無論是單細胞的藍藻細

菌和原生動物生命形式，還是所有多細胞生物體，包括真菌、植物、昆蟲、嚙齒動物和人類，這些生命形式中都存在晝夜節(jié)律。晝夜節(jié)律系統(tǒng)的構建塊由自維持24小時節(jié)律發(fā)生器或振蕩器組成，確定內部振蕩器與外部刺激（被稱為授時因子，即計時器）的連接或夾帶一定機制（如光線）使其連接，并輸出允許及時調度生理過程的機制。

從節(jié)奏到時鐘

有關生物調整其生理和行為，以適應晝夜節(jié)律的時間這方面的觀察記錄已經有很長的歷史了，而且最早觀察的是植物中的葉和花的運動。例如，含羞草的葉子晚上合攏白天展開。1729年， 法國天文學家讓·雅克·多爾都·德·麥朗將含羞草置于黑暗中，觀察到葉片在一天的適當時間有節(jié)奏地展開、合攏，表明其晝夜節(jié)律的內源性來源。大約200年后，德國植物生理學家和晝夜節(jié)律研究先驅歐文·邦寧將一種豆類植物的葉子精心連接到一臺波動曲線記錄儀上，分別記錄了

正常晝夜周期和恒定的光照條件下葉子的運動。他觀察到葉子的運動節(jié)律持續(xù)存在。在這之前，有關植物和動物的晝夜節(jié)律行為是由內生時鐘控制還是僅僅是對晝夜節(jié)律外部刺激的反應的問題，在科學界一直都有激烈的爭論。最終，內生晝夜節(jié)律鐘的存在終于在20世紀后建立起來。

晝夜節(jié)律和時鐘基因的遺傳性

隨著時間的推移，除了周期性葉片運動之外，許多相關的生理特性都被發(fā)現(xiàn)受生物鐘控制，晝夜節(jié)律的遺傳開始被認為是自然選擇的產物。20世紀30年代，歐文·邦寧的經典研究表明，盡管親本植物暴露于非晝夜節(jié)律光照期，但是植物的晝夜節(jié)律仍然可以遺傳，并且在不同時期的雜種之間雜交，從而產生具有中等周期的植物。到20世紀60年代中期，研究生物鐘的生物學研究團體已經得到穩(wěn)定確立，并且開始考慮時鐘基因的概念。

正是在這個時候，在加州理工學院工作的西摩·本澤爾和他的學生羅納德·科諾普卡開始研究改變了晝夜節(jié)律表型的突變果蠅。本澤爾與當時的幾位遺傳學家和行為科學家不同，他堅信具體行為可能受到單一基因作用的影響，并且有可能通過分離攜帶突變個體基因的生物進行證明。本澤爾和科諾普卡使用經典的化學誘變策略，分離出三種不同的突變體株，顯示蛹羽化及自主活動正常24小時循環(huán)的變化。其中一個突變體無規(guī)則，另一個突變體具有較短的19小時周期，第三個時間更長，為28小時。映射實驗使用當時已知的遺傳標記，將所有三個突變體大致定位于果蠅X染色體的相同區(qū)域。重要的是，互補性測試表明，這三個突變涉及相同的基因，后來被命名為周期。在此基礎上，本澤爾和科諾普卡推斷，不規(guī)則的突變體將攜帶無效突變，使基因失活，并且具有較長和較短周期的突變體將攜帶錯義突變，莫名其妙地以相反的方式改變基因產物的功能。后來的研究顯示，這兩個推斷都是正確的。然而，盡管本澤爾繼續(xù)致力這一課題，科諾普卡繼

續(xù)研究該周期位點，更精確地繪制其染色體位置，但直到20世紀80年代中期，在布蘭迪斯大學合作的杰弗里·霍爾和邁克爾·羅斯巴什以及洛克菲勒大學的邁克爾·楊才將該周期基因進行了分子克隆并測序。至此，第一個生物鐘基因被分離，其結構被分子表征，但時間的原始遺傳識別和其cDNA的克隆和測序都沒有指出晝夜節(jié)律鐘的分子機制。

轉錄翻譯反饋回路

在per被克隆后的幾年里，杰弗里·霍爾和邁克爾·羅斯巴什開始研究其蛋白質產物（PER）如何發(fā)揮晝夜節(jié)律的作用，提出了一個“膜梯度”模型，其中PER被設想為像泵一樣在膜上形成梯度，達到閾值后，通過光敏通道消散。另一個模型提出PER蛋白是將細胞聚集在一起的蛋白多糖，從而促進通過間隙連接形成細胞間連接。有了可靠的PER抗體，這一方面的研究終于實現(xiàn)了一系列突破。首先，霍爾和羅斯巴什的實驗室發(fā)現(xiàn)果蠅大腦神經元中豐富的PER 蛋白呈現(xiàn)24小時循環(huán)，夜間出現(xiàn)峰值。由per基因編碼的mRNA顯示出果蠅腦中豐度的晝夜循環(huán)，表明PER蛋白的循環(huán)由周期mRNA的循環(huán)產生，周期mRNA水平的峰值在PER蛋白豐度峰值前幾小時發(fā)生。重要的是，一個無意義的突變體不能產生周期mRNA的振蕩水平，但野生型PER蛋白可以挽救環(huán)狀mRNA的表達?；谶@些觀察，霍爾和羅斯巴什提出負自動調節(jié)反饋模型的觀點，認為PER 蛋白的積累導致周期mRNA表達的減弱。因此，PER蛋白被發(fā)現(xiàn)是核蛋白，并以時間調節(jié)的方式在細胞核和細胞質之間穿梭，為PER蛋白是某種轉錄調節(jié)因子的觀點提供了支持。

與此同時，楊通過一個新的前瞻性研究，發(fā)現(xiàn)了永恒（tim）這個影響晝夜節(jié)律鐘的另一基因。楊的實驗室發(fā)現(xiàn)，永恒mRNA的水平也在24小時內循環(huán)，TIM可以直接結合PER，通過阻斷PER降解來影響其核定位和豐度。重要的是，per表達的循環(huán)在tim的突變體蠅中被消除，相反，永久性表達的晝夜循環(huán)在周期突變體蠅中喪失。這些進展鞏固了TTFL的基本概念框架，成為促進時鐘基因自動調節(jié)中晝夜循環(huán)的機制。

如上所述，當時的轉錄機制并不明顯，科學界正在考慮不同的替代方案。因此，發(fā)現(xiàn)自我維持的晝夜TTFL代表了一種新的范式。

PER和TIM的轉錄的激活機制仍然未知。這個問題是通過發(fā)現(xiàn)時鐘（Clk）和per基因來解決的。Clk基因是約瑟夫·高橋首先在小鼠身上鑒定到的?；虍a物、時鐘（CLK）和循環(huán)（CYCLE）相互作用，含有基本的螺旋—環(huán)—螺旋（bHLH）基序，并結合PER 中的特定元素和TIM，從而積極調節(jié)其轉錄。后來的研究顯示，TIM和PER可作為CLK活性的負調節(jié)因子。由此，晝夜反饋循環(huán)被關閉。

晝夜分子時鐘裝置的工作模式非常復雜，包括許多附加的組成部分，它們共同促進其晝夜周期。重要的是，由于轉錄和翻譯反應通常是快速的，所以必須對核心TTFL機制施加顯著的延遲以產生24小時振蕩。這是通過涉及調節(jié)蛋白磷酸化和TTFL組分降解，蛋白質復合組裝，核易位和其他翻譯后修飾的復雜網絡實現(xiàn)的。一項重要的觀察表明，這種延遲的基本機制來自楊發(fā)現(xiàn)的雙倍基因（DBT）。額外的蛋白質整合了可以夾帶時鐘的環(huán)境輸入，例如隱花色素基因（cry）的蛋白質產物，并促進其與TIM的結合，導致其在蛋白酶體中的降解。當早晨到達時，TIM被降解，使得PER更容易受到DBT的磷酸化和隨后的降解。

其他生物體的晝夜節(jié)律鐘

TTFL機制也是包括人在內的其他多細胞生物體晝夜節(jié)律鐘的基本原理。果蠅中核心時鐘蛋白的幾個同源物，包括CLK和PER，在哺乳動物晝夜節(jié)律計時中起著相似的作用。雖然植物主要使用與果蠅晝夜節(jié)律鐘不同的轉錄因子，但TTFL是統(tǒng)一的主要原則。然而，在藍細菌中，已經發(fā)現(xiàn)依賴于順序蛋白磷酸化事件的不同類型的轉錄非依賴性晝夜節(jié)律振蕩子。值得注意的是，使用純化的藍細菌CLK蛋白和ATP可以在體外重建晝夜節(jié)律。由過氧化物氧化蛋白的高氧化反應引起的與

轉錄無關的振蕩也在真核生物中得到描述，包括人類紅細胞。這種TTFL獨立振蕩的生理相關性是未知的。然而，這些結果表明，在哺乳動物細胞中也可能存在用于產生晝夜節(jié)律振蕩的其他機制。

生物鐘的夾帶和同步

晝夜節(jié)律程序在中央和外圍水平都受到管制。在哺乳動物中，中心起搏點位于下丘腦的視交叉上核（SCN），并且是晝夜主節(jié)律鐘。視網膜接收光輸入并將該信息中繼到SCN，并同步其自身的神經元細胞時鐘。中央時鐘通過體液因子和外周自主神經系統(tǒng)調節(jié)整個體內的晝夜節(jié)律。當然，晝夜節(jié)律基因表達的能力在整個生物體內是普遍的，并且大多數(shù)外周器官和組織都可以分離地表達晝夜節(jié)律振蕩。因此，動物的晝夜節(jié)律系統(tǒng)類似時鐘店而非單個時鐘。這就提出了如何有效地同步這么多時鐘的問題。

外部時鐘可以通過SCN和環(huán)境線索同步，包括取食、身體活動和溫度。不同組織的外部時鐘控制相關生理輸出，如葡萄糖生產、脂肪儲存和激素釋放；這些反過來又作為整個身體組織中時鐘的保持線索，最終反饋給SCN。因此，生物體的晝夜節(jié)律系統(tǒng)是互連振蕩器和反饋回路網絡。中央和周邊時鐘之間的關系，以及本地和外部線索影響它們的多種方式，是通向新發(fā)現(xiàn)的一個活躍的研究領域。

晝夜節(jié)律生物學與人類健康

時間生物學對我們生理學的許多方面都產生著影響。例如，晝夜節(jié)律鐘有助于調節(jié)睡眠模式、取食行為、激素釋放、血壓和體溫，分子鐘也在許多組織中起局部關鍵作用。在動物模型中，消除Clk 基因可導致激素的心律失常產生，如皮質酮和胰島素。Clk基因也通過控制糖異生、胰島素敏感性和血糖全身振蕩對代謝產生深遠的影響。睡眠對正常的腦功能至關重要，晝夜節(jié)律障礙與睡眠障礙以及抑郁、雙相情感障礙、認知功能、記憶形成和一些神經系統(tǒng)疾病有關。在罕見的情況下，睡眠障礙是由于晝夜節(jié)律基因的突變導致的。研究表明，我們的生活方式與我們內生的晝夜節(jié)律規(guī)定的節(jié)奏之間的慢性不對準可能與各種疾?。òò┌Y、神經變性疾病、代謝紊亂和炎癥）的風險增加有關。目前，科學界正在努力研究計時生物學和藥理學方法來修改晝夜時鐘的周期、相位或幅度，以改善人體健康。

綜上所述，自我維持的轉錄/ 翻譯反饋回路的發(fā)現(xiàn)是晝夜節(jié)律基因控制細胞和組織中晝夜節(jié)律振蕩的分子機制的核心組成部分。這一發(fā)現(xiàn)提供了一種新范式，使我們能夠理解生物體如何預期和適應日常環(huán)境的提示，例如光。這三位獲獎者的重要發(fā)現(xiàn)闡明了基本的生理機制，使得晝夜節(jié)律生物學已經發(fā)展成一個廣泛而高度動態(tài)的研究領域，對我們的健康和幸福有著重要的影響。