漢灘病毒感染小鼠腹腔巨噬細(xì)胞模型的建立

張堯，馮偉，張曉曉，應(yīng)旗康，劉梓諭，吳興安，王芳

1.第四軍醫(yī)大學(xué) 學(xué)員旅，陜西 西安 710032；2.第四軍醫(yī)大學(xué) 微生物學(xué)教研室，陜西 西安 710032

漢灘病毒感染小鼠腹腔巨噬細(xì)胞模型的建立

張堯1，馮偉1，張曉曉2，應(yīng)旗康2，劉梓諭2，吳興安2，王芳2

1.第四軍醫(yī)大學(xué) 學(xué)員旅，陜西 西安 710032；2.第四軍醫(yī)大學(xué) 微生物學(xué)教研室，陜西 西安 710032

目的：建立漢灘病毒感染的小鼠腹腔巨噬細(xì)胞模型。方法：PBS灌洗6～8周齡C57BL/6小鼠腹腔，分離獲取小鼠腹腔巨噬細(xì)胞后，以100 TCID50漢灘病毒76-118株感染小鼠腹腔巨噬細(xì)胞，通過(guò)間接免疫熒光、ELISA和Realtime PCR檢測(cè)病毒感染情況。結(jié)果：病毒感染3d后，間接免疫熒光和ELISA檢測(cè)到病毒核衣殼蛋白的表達(dá)，Realtime PCR檢測(cè)到病毒核酸的表達(dá)。結(jié)論：建立了漢灘病毒感染小鼠腹腔巨噬細(xì)胞的模型，為進(jìn)一步闡明漢灘病毒的發(fā)病機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。

漢灘病毒；小鼠腹腔巨噬細(xì)胞；感染

漢灘病毒（Hantaan virus，HTNV）屬于布尼亞病毒科漢坦病毒屬，由其引起的腎綜合征出血熱（hemorrhagic fever with renal syndrome，HFRS）是一類(lèi)以發(fā)熱、出血和腎功能損傷為特征的急性傳染病[1]，全球每年發(fā)病人數(shù)達(dá)10萬(wàn)例,其中90％的病例發(fā)生于中國(guó),病死率高達(dá)0.3％～10％[2]。

漢灘病毒不僅可以直接引起全身小血管和毛細(xì)血管損傷、血管通透性增加和微循環(huán)障礙，還可引起免疫應(yīng)答異常，進(jìn)而引發(fā)高熱、出血及腎損害等臨床癥狀[3]。我國(guó)是HFRS疫情最為嚴(yán)重的國(guó)家，流行區(qū)域廣，發(fā)病人數(shù)居全球之首，且病死率較高[4]，主要型別為漢灘病毒和漢城病毒（Seoul virus，SEOV）。針對(duì)漢灘病毒目前尚無(wú)特異有效的治療藥物。

巨噬細(xì)胞是機(jī)體發(fā)揮抗病毒作用的重要免疫細(xì)胞，可通過(guò)分泌多種細(xì)胞因子而參與免疫調(diào)節(jié)[5]。探討漢灘病毒和巨噬細(xì)胞之間的關(guān)系，有助于了解病毒在體內(nèi)擴(kuò)散過(guò)程及巨噬細(xì)胞在發(fā)病機(jī)制中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

清潔級(jí)6～8周齡C57BL/6雌性小鼠，體重18～20g，由第四軍醫(yī)大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心飼養(yǎng)；漢灘病毒76-118株由本室保存；SYBR實(shí)時(shí)定量PCR試劑盒、PrimeScript RT-PCR試劑盒購(gòu)自TaKaRa公司；Cy3標(biāo)記的羊抗鼠IgG購(gòu)自康為世紀(jì)公司；抗?jié)h灘病毒單克隆抗體1A8及HRP-1A8由本室制備并保存，可識(shí)別漢灘病毒核衣殼蛋白（nucleo?protein，NP）上特異性抗原位點(diǎn)，具有較高的特異性結(jié)合活性。

1.2 小鼠腹腔巨噬細(xì)胞的分離、培養(yǎng)

采用椎骨脫臼法處死小鼠，立即放在超凈工作臺(tái)上，用75％乙醇消毒皮膚，剪開(kāi)腹部皮膚暴露腹腔，用無(wú)菌注射器吸取磷酸鹽緩沖液（PBS）灌洗腹腔，吸取腹腔灌洗液，制成腹腔巨噬細(xì)胞懸液，以PBS液洗細(xì)胞2次，離心（1500r/min，10min），用完全DMEM培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞濃度至1×106/mL鋪至24孔板的細(xì)胞玻片上，37℃、5％CO2培養(yǎng)箱中靜置2h，棄去上層懸浮細(xì)胞，PBS洗滌2次后加入完全DMEM培養(yǎng)基，24h后進(jìn)行病毒感染。

1.3 間接免疫熒光（IFA）檢測(cè)NP在感染細(xì)胞中的表達(dá)

用100 TCID50的漢灘病毒于37℃、CO2孵箱感染腹腔巨噬細(xì)胞2h后，添加含100mL/L胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液，于37℃、CO2孵箱中培養(yǎng)72h，按常規(guī)方法進(jìn)行IFA實(shí)驗(yàn)，一抗為抗?jié)h灘病毒NP抗體1A8（1∶1000稀釋?zhuān)?，二抗為Cy3標(biāo)記的羊抗鼠IgG（1∶2000稀釋?zhuān)瑹晒怙@微鏡觀察、照相。

1.4 病毒感染細(xì)胞中病毒核酸的檢測(cè)

設(shè)計(jì)編碼HTNV NP的S基因及小鼠GAPDH引物，由北京奧科生物公司合成。引物分別為HTNV S Forward（5′-GATCAGTCACAGTCTAGTC A-3′）、HTNV S Reverse（5′-TGATTCTTCCACCA TTTTGT-3′）、Mouse GAPDH Forward（5′-AGGCC GGTGCTGAGTATGTC-3′）和 Mouse GAPDH Re?verse（5′-TGCCTGCTTCACCACCTTCT-3′）。

用TRIzol法提取感染細(xì)胞的RNA，以其為模板用RT-PCR試劑盒進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，分別以 HTNV S Forward/Reverse及 Mouse GAPDH For?ward/Reverse為引物，用實(shí)時(shí)定量PCR試劑盒檢測(cè)樣本中的HTNV特異性核酸。

1.5 感染細(xì)胞中病毒抗原的檢測(cè)

收取病毒感染的巨噬細(xì)胞，于-80℃冰箱中快速冷凍20min，反復(fù)凍融3次后，4℃、12 000r/min離心30min，收集上清，采用夾心ELISA法檢測(cè)上清中的HTNV抗原。具體方法如下：取1∶2000稀釋的抗NP單克隆抗體于4℃包被過(guò)夜，用洗滌緩沖液洗滌3次后，將細(xì)胞裂解液上清按1∶10稀釋?zhuān)靠准尤?00μL，設(shè)置負(fù)孔和陰性對(duì)照，37℃孵育1h，洗滌3次后加入1∶2000稀釋的HRP-1A8抗體，37℃孵育1h，洗滌3次后加入TMB顯色，室溫靜置15min后加入2 mol/L H2SO4終止反應(yīng)，測(cè)定各孔的D450nm值。

2 結(jié)果

2.1 間接免疫熒光檢測(cè)漢灘病毒NP在漢灘病毒感染后的腹腔巨噬細(xì)胞中的表達(dá)

經(jīng)間接免疫熒光檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)漢灘病毒感染后，小鼠腹腔巨噬細(xì)胞能表達(dá)漢灘病毒核衣殼蛋白（圖1）。

2.2 漢灘病毒感染腹腔巨噬細(xì)胞中病毒抗原的檢測(cè)結(jié)果

漢灘病毒感染小鼠腹腔巨噬細(xì)胞后，以?shī)A心ELISA法檢測(cè)病毒感染細(xì)胞中HTNV特異性抗原，結(jié)果顯示病毒感染巨噬細(xì)胞的D450nm值與病毒感染Vero-E6細(xì)胞的D450nm值相當(dāng)，表明病毒感染后的巨噬細(xì)胞中有病毒抗原的表達(dá)（圖2）。

2.3 漢灘病毒感染腹腔巨噬細(xì)胞中病毒核酸的檢測(cè)結(jié)果

漢灘病毒感染腹腔巨噬細(xì)胞后，以qRT-PCR法檢測(cè)感染細(xì)胞中的病毒核酸，結(jié)果顯示感染組細(xì)胞中的病毒核酸拷貝數(shù)明顯高于對(duì)照組，表明病毒感染后巨噬細(xì)胞中有病毒核酸復(fù)制（圖3）。

圖1 漢灘病毒感染C57BL/6小鼠腹腔巨噬細(xì)胞中病毒抗原的間接免疫熒光結(jié)果

圖2 漢灘病毒感染C57BL/6小鼠腹腔巨噬細(xì)胞中病毒特異性抗原的ELISA檢測(cè)結(jié)果

圖3 漢灘病毒感染C57BL/6小鼠腹腔巨噬細(xì)胞中病毒核酸的qRT-PCR結(jié)果

3 討論

機(jī)體主要通過(guò)復(fù)雜的免疫系統(tǒng)抵御外來(lái)病原體，包括2種主要方式：非特異性和特異性的。病毒感染后，非特異性免疫提供首道防線且影響隨后的特異性免疫。巨噬細(xì)胞是機(jī)體免疫系統(tǒng)中具有多種功能的免疫細(xì)胞，參與機(jī)體非特異性免疫反應(yīng)，具有很強(qiáng)的吞噬功能。巨噬細(xì)胞在產(chǎn)生特異性細(xì)胞免疫和體液免疫之前發(fā)揮了重要的防御作用，同時(shí)能分泌多種細(xì)胞因子和趨化因子。細(xì)胞因子一方面可作為宿主介導(dǎo)控制病毒復(fù)制的重要組分，另一方面也可作為病毒破壞宿主免疫系統(tǒng)的重要因素。漢灘病毒的致病機(jī)理是病毒感染誘導(dǎo)宿主免疫病理[6]。因此，有必要進(jìn)一步研究漢灘病毒感染與巨噬細(xì)胞、細(xì)胞因子之間的關(guān)系，這對(duì)深入闡明漢灘病毒的致病機(jī)理尤為重要。

本實(shí)驗(yàn)主要以體外方式感染單核-巨噬細(xì)胞，檢測(cè)HTNV感染小鼠腹腔巨噬細(xì)胞的情況，通過(guò)間接免疫、ELISA和qRT-PCR法檢測(cè)，結(jié)果顯示HTNV能感染小鼠腹腔巨噬細(xì)胞并在其中增殖，為下一步研究巨噬細(xì)胞在漢灘病毒感染過(guò)程中的作用奠定了基礎(chǔ)。

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Establishment of Hantaan Virus Infected Mouse Peritoneal Elicit Macrophage

ZHANG Yao1,FENG Wei1,ZHANG Xiao-Xiao2,YING Qi-Kang2,LIU Zi-Yu2,WU Xing-An2,WANG Fang2*
1.Cadet,Fourth Military Medical University,Xi'an 710032;2.Department of Microbiology,Fourth Military Medical University,Xi'an 710032;China
*Corresponding author,E-mail:wangf07@fmmu.edu.cn

Objective:To establish a macrophage model for Hantaan virus（HTNV） infection by using the cul?ture of mouse peritoneal elicit macrophage.Methods:Inject 5mL of ice cold PBS（with 3％FCS） into the perito?neal cavity.After injection,gently massage the peritoneum to dislodge any attached cells into the PBS solution and then collect as much as possible,and deposit the collected cell suspension in tubes on ice.The mouse perito?neal macrophages were cultured and infected with 100 TCID50HTNV 76-118 strain.Indirect immunofluorescent as?say（IFA）,ELISA and real-time PCR were used to detect the protein or nucleic acid of Hantaan virus.Results:3 days after infection,the nucleoprotein was detected out by IFA and ELISA,the nucleic acid of nucleoprotein was confirmed by real-time PCR.Conclusion:Direct infection of HTNV on the cultured mouse peritoneal macro?phages were identified,to explore the pathogenic mechanism for HTNV infection.

Hantaan virus;mouse peritoneal elicit macrophage;infection

R373;R392.1

A

1009-0002（2017）04-0503-03

2017-01-06

國(guó)家自然科學(xué)基金（31470890，31270978）；軍隊(duì)重點(diǎn)課題（BWS13G）；陜西省科技統(tǒng)籌創(chuàng)新工程計(jì)劃（2013KTCL03-06）

張堯（1994- ），男，本科在讀，（E-mail）516091724@qq.com

王芳，（E-mail）wangf07@fmmu.edu.cn

10.3969/j.issn.1009-0002.2017.04.019