利用Red/ET同源重組構(gòu)建新型CCR5Δ32打靶載體

盧智勇，楊卓順，丁妍，袁雅紅，王小莉，于莉，李東升

湖北省十堰市太和醫(yī)院（湖北醫(yī)藥學院附屬醫(yī)院）生命科學研究所，湖北 十堰 442000

利用Red/ET同源重組構(gòu)建新型CCR5Δ32打靶載體

盧智勇，楊卓順，丁妍，袁雅紅，王小莉，于莉，李東升

湖北省十堰市太和醫(yī)院（湖北醫(yī)藥學院附屬醫(yī)院）生命科學研究所，湖北 十堰 442000

目的：目前應用TALENs或CRISPR-Cas基因編輯技術(shù)修飾CCR5基因以獲得抗HIV功能的研究策略基本是破壞CCR5基因而不是制造CCR5Δ32這樣天然存在的抗HIV基因型。為此，我們嘗試通過細菌內(nèi)同源重組技術(shù)構(gòu)建一個新穎的CCR5Δ32的打靶載體，以便能夠用于制備CCR5Δ32基因突變細胞系。方法：首先利用Red/ET同源重組系統(tǒng)將rpsl-neo片段插入細菌人工染色體（BAC）的CCR5基因中，隨后再次利用同源重組將一個不含32bp區(qū)域的非選擇性52bp片段替換該rpsl-neo片段，從而將BAC中的CCR5基因改造成CCR5Δ32基因型，最后將loxp-neo-loxp抗性基因插入CCR5基因的第2內(nèi)含子區(qū)域，制備出含有抗性基因的CCR5Δ32打靶載體，該載體可在Cre酶作用下刪除neo基因但只留下一個loxp在基因的內(nèi)含子區(qū)。結(jié)果：rpsl-neo片段成功插入CCR5之Δ32區(qū)并為非選擇性52bp片段替換，loxp-neo-loxp成功插入內(nèi)含子區(qū)。結(jié)論：通過Red/ET同源重組技術(shù)獲得CCR5Δ32-loxp-neo-loxp打靶載體。

細菌人工染色體；CCR5；同源重組；重組工程

盡管針對人類免疫缺陷病毒（human immuno?deficiency virus，HIV）的預防和治療到目前為止已取得一定進展，如抗病毒藥物和疫苗，但成本高昂療效有限，因此很有必要深入研究新型HIV治療靶標和治療措施。CCR5（C-C chemokine re?ceptor type 5）是HIV-1在靶細胞上的關(guān)鍵受體之一，可以介導HIV對靶細胞的感染[1]。在白人種族中存在CCR5的一種突變體即CCR5Δ32，與野生型CCR5相比缺失了32個堿基，從而使得該類人群天然對HIV具有抵抗力[2]。自從發(fā)現(xiàn)這個現(xiàn)象后，以CCR5為靶點的研究層出不窮，如CCR5小分子拮抗劑可以阻斷HIV-1的感染并開展相應的臨床試驗，另外通過抗體、核酶及siRNA敲低CCR5表達水平也可以對抗HIV-1的感染[3-5]。近來隨著ZFNs、TALENs和CRISPR-Cas9基因編輯技術(shù)的飛速發(fā)展，針對人類胚胎干細胞（human embryonic stem cells，hESCs）和T細胞進行CCR5的敲除亦屢見報道[6-8]。這3類基因編輯技術(shù)都是利用合成的核酸內(nèi)切酶在指定的DNA靶位切割雙鏈后造成雙鏈缺口即DSB，然后利用細胞本身的修復機制引入突變包括隨機敲除和定點插入，從而實現(xiàn)對細胞基因組的改造。通常，隨機敲除發(fā)生的概率遠較定點刪除和插入為高，因此絕大多數(shù)學者都是針對目的細胞如hESCs、造血干細胞、T細胞進行CCR5基因的隨機敲除突變[6-8]，僅有1篇報道聯(lián)合運用piggyBAC技術(shù)將CCR5基因改造為CCR5Δ32這一天然存在的突變形式[9]。盡管目前認為敲除CCR5基因不會對機體產(chǎn)生明顯的有害作用，但是如果能夠像CCR5Δ32既保留類似CCR5的功能又可獲得HIV抗感染能力，將是非常完美的研究方向和治療靶點。但是由于定點刪除的難度很高，很少有學者進行這種基因修飾，因此有必要構(gòu)建一種新型載體聯(lián)合基因編輯技術(shù)來提高靶細胞產(chǎn)生CCR5Δ32基因型的發(fā)生率。為此，我們通過聯(lián)合運用細菌人工染色體（bacterial artificial chromosome，BAC）和細菌內(nèi)同源重組技術(shù)，將BAC上的野生型CCR5基因改造成含有抗性基因的CCR5Δ32基因型。

細菌內(nèi)同源重組是一項高效特異地利用大腸桿菌工程菌構(gòu)建載體的分子克隆技術(shù)[10-11]，由于采用的是細菌基因組自身表達的同源重組酶進行質(zhì)粒或BAC的修飾改造，因此它不需要任何限制性內(nèi)切酶及其位點[12-13]，這個優(yōu)勢使得它可以用來構(gòu)建比較復雜或沒有合適內(nèi)切酶位點的載體。而且，考慮到BAC的巨大容量可以包含整個CCR5基因的外顯子、內(nèi)含子，以及如啟動子等基因調(diào)控單元，因此在BAC基礎(chǔ)上構(gòu)建的某個特定基因的載體，由于包含基因調(diào)控單元，更類似于內(nèi)源性的基因序列，對于基因打靶或基因編輯，相對普通分子克隆技術(shù)構(gòu)建的打靶載體而言具有更大優(yōu)勢（比如包含內(nèi)源性調(diào)控元件、更長的同源臂）。BAC是一種以F質(zhì)粒為基礎(chǔ)建構(gòu)而成的細菌染色體克隆載體，常用來克隆150kb左右的DNA片段，最多可保存300kb堿基。目前主要用于大片段基因組文庫的構(gòu)建和大的基因簇的相關(guān)研究，并在各類生物基因組計劃中發(fā)揮重要作用。細菌內(nèi)同源重組技術(shù)是將來源于噬菌體的3個與重組有關(guān)的基因整合進大腸桿菌染色體組中獲得的。簡言之，3個基因中的gam基因負責保護外源導入的DNA片段不被細菌自身的RecBCD核酸酶水解；而exo基因具備核酸外切酶活性，負責將雙鏈切割出一個單鏈突出末端；隨后beta基因就與該突出末端結(jié)合，將具有同源臂的外源DNA片段與靶位點DNA進行同源重組。傳統(tǒng)的載體構(gòu)建技術(shù)需要PCR擴增、酶切、連接等程序和相應的酶，尤其是需要相應的酶切位點，受限嚴重，而細菌內(nèi)同源重組技術(shù)則完全避免了酶切位點的限制，且高效精確，因此非常適合用于基因改造的打靶載體構(gòu)建[13-14]。

本研究中，我們采用類似Zhang等報道的重組技術(shù)[15-17]，首先針對CCR5基因中的Δ32區(qū)域設(shè)計并合成具備同源臂的rpsl-neo片段，將其電轉(zhuǎn)入含有BAC和pRedET的大腸桿菌DH10B中，通過該菌內(nèi)的同源重組系統(tǒng)將rpsl-neo片段插入BAC的CCR5中并替換掉含有Δ32的52bp區(qū)域（圖1，step1）；隨后設(shè)計并合成一段也具有同源臂的不含Δ32的180bp小片段（與野生型CCR5的Δ32區(qū)除沒有32bp外完全相同），同樣利用同源重組系統(tǒng)以180bp小片段替換掉rpsl-neo，從而獲得CCR5Δ32基因型（圖1，step2）；最后利用同樣的技術(shù)將loxp-neo-loxp抗性基因插入CCR5基因的第2內(nèi)含子區(qū)域，從而制備出一個含有抗性基因的CCR5Δ32打靶載體（圖1，step3）。

1 材料與方法

1.1 材料

細菌內(nèi)同源重組試劑盒購自Gene Bridges公司；BAC克?。寺√朢PCI 24F11）購自Invitrogen公司；質(zhì)粒pL452由南京大學模式動物所惠贈；引物購自上海生工公司；氯霉素、四環(huán)素、卡那霉素和鏈霉素購自Amresco公司；L-阿拉伯糖購自Calbiochem公司；Taq酶、pfu高保真酶購自TaKaRa公司；質(zhì)粒提取試劑盒、凝膠回收試劑盒購自O(shè)miga公司。PCR擴增儀（Epperdorrf公司）；凝膠成像儀、電泳儀（Bio-Rad公司）；電轉(zhuǎn)化儀（BTX公司）。

圖1 BAC-CCR5Δ32-loxp-neo-loxp載體構(gòu)建示意圖

1.2 含有CCR5同源臂的rpsl-neo片段插入BAC的CCR5基因中

基于同源重組試劑盒提供的rpsl-neo模板，PCR擴增含有CCR5Δ32區(qū)域兩側(cè)同源臂的rpslneo片段，引物為5'-AATCATCTTTACCAGATCTC AAAAAGAAGGTCTTCATTACACCTGCAGCT/GGCC TGGTGATGATGGCGGGATCG-3'和5'-AGCAGAT GACCATGACAAGCAGCGGCAGGACCAGCCCCAAG ATGACTATC/CTCGAGTCAGAAGAACTCGTCAAGA AGG-3'，其中“/”代表5'端同源臂區(qū)與 3'端 rpslneo引物的連接處。反應條件：95℃ 5min；95℃1min，58℃ 1min，72℃ 2.5min，30 次循環(huán)；72℃ 10min。電泳畢，切割1319bp片段并純化，然后在用0.3％～0.4％L-阿拉伯糖于37℃誘導45～60min的情況下將此純化片段電轉(zhuǎn)導入含有BAC和pRedET質(zhì)粒的大腸桿菌DH10B中，按照后面提及的同源重組步驟進行rpsl-neo插入，以替換含Δ32區(qū)域的52bp區(qū)，收集細菌涂布于含氯霉素（15μg/mL）、卡那霉素（15μg/mL）、四環(huán)素（3μg/mL）的LB瓊脂平板上，陽性克隆經(jīng)鑒定可獲得BAC-rpsl-neo。

1.3 180bp非選擇性片段插入替換rpsl-neo片段獲得CCR5Δ32基因型

首先依據(jù)CCR5的Δ32區(qū)兩側(cè)序列設(shè)計并合成2段各100bp的overlap單鏈DNA片段，該2片段的3'端20bp為堿基互補配對區(qū)，它們的堿基序列為5'-ACTTGGGTGGTGGCTGTGTTTGCGTCT CTCCCAGGAATCATCTTTACCAGATCTCAAAAAGA AGGTCTTCATTACACCTGCAGCTCTCATTTTCCATA CA-3'和5'-AGCAGAGTTTTTAGGATTCCCGAGTA GCAGATGACCATGACAAGCAGCGGCAGGACCAGC CCCAAGATGACTATCTTTAATGTATGGAAAATGAG AGCTG-3'。然后直接退火合成180bp的不含Δ 32之32bp的非選擇性片段。退火條件：2片段各取 300ng溶于 50μL PCR 反應體系中；94℃4min，以 94℃ 30s、55℃ 45s、72℃ 1min行 35次循環(huán)，72℃ 5min。電泳畢，切割180bp片段并純化，然后同上進行同源重組，將此短片段電轉(zhuǎn)導入含有BAC-rpsl-neo及pRedET質(zhì)粒的大腸桿菌DH10B，按照后面提及的同源重組步驟進行插入，以替換掉rpsl-neo，收集細菌涂布于含氯霉素（15μg/mL）、卡那霉素（15μg/mL）、四環(huán)素（3μg/mL）的LB瓊脂平板上（由于BAC上rpsl基因被替換，所以此時菌株在卡那霉素抗性消失的同時具備鏈霉素抗性），陽性克隆經(jīng)鑒定可獲得BAC-CCR5Δ32。

1.4 擴增loxp-neo-loxp抗性基因片段插入BACCCR5Δ32中

利用在線轉(zhuǎn)錄因子預測軟件TFSEARCH（http://www.cbrc.jp/papia/howt ouse/howtouse_tfsearch.html）對CCR5所有內(nèi)含子區(qū)域進行轉(zhuǎn)錄因子預測，選取第2內(nèi)含子區(qū)的無轉(zhuǎn)錄因子段作為插入loxp-neo-loxp片段的靶位點。以質(zhì)粒pL452為模板，PCR擴增含有CCR5第二內(nèi)含子同源臂的loxp-neo-loxp抗性基因片段，引物為5'-AAATCT TGAAATCTTATCTTCTGCTAAGGAGAACTAAACCC TCTCCAGTGAGATGCCTTCTGAATATGTGCCCACA AGAA/GAATTCCTGCAGCCCAATTCCGATC-3'和5'-TTAATATTAATTTTGACCATTTTTAGGCTTCCC TCTTGTCTGGAGGAAAAAGAAAAAAGAGAACCAG ACTTAGACACAAC/GCTCTAGAACTAGTGGATCCC CTCG-3'，其中“/”代表5'端同源臂區(qū)與 3'端 loxpneo-loxp引物的連接處。反應條件：95℃ 5min；98℃ 15s，55℃ 15s，72℃ 2min，5次循環(huán) ；98℃ 15s，65℃ 15s，72℃ 2min，26 次循環(huán)；72℃ 5min。電泳畢，切割1909bp片段并純化，同上電轉(zhuǎn)導入含有BAC-CCR5Δ32及pRedET質(zhì)粒的大腸桿菌DH10B，按照后面提及的同源重組步驟插入loxp-neo-loxp，收集細菌涂布于含有氯霉素（15μg/mL）、卡那霉素（15μg/mL）的LB瓊脂平板上，陽性克隆經(jīng)鑒定可獲得BAC-CCR5Δ32-loxp-neo-loxp。

1.5 電轉(zhuǎn)感受態(tài)細菌制備

取50～100μL含有BAC和/或pRedET質(zhì)粒的DH10B菌液加入4mL攜有相應抗生素的LB培養(yǎng)基中，37℃過夜增菌，當D600nm值為0.5～0.8時將菌液置于冰上20～30min，然后分裝入2～3支EP管中，4℃、3500r/min離心5min，棄上清，收集細胞沉淀，用冰預冷的10％甘油洗滌3次，按50～80μL/支用10％甘油重懸并置于-80℃保存，臨用時解凍即可。

1.6 電擊轉(zhuǎn)化與陽性克隆的篩選

在本實驗中，BAC克隆需要轉(zhuǎn)化入pRedET和插入片段，其電轉(zhuǎn)化程序完全相同。接種BAC克隆于2mL LB培養(yǎng)基中，并添加15μg/mL氯霉素，37℃、250r/min過夜培養(yǎng)，次日取 50～100μL過夜菌加入含有氯霉素的LB培養(yǎng)基中，37℃、250r/min培養(yǎng)至D600nm值為0.3左右時加入144μL 10％L-阿拉伯糖（終濃度為0.3％～0.4％），繼續(xù)培養(yǎng)1h左右直到D600nm值為0.5～0.8，然后按照1.5所述方法制備電轉(zhuǎn)感受態(tài)細菌用于后續(xù)質(zhì)粒或插入片段的電轉(zhuǎn)（僅電轉(zhuǎn)pRedET質(zhì)粒而不進行同源重組的話則不需要加入阿拉伯糖誘導這一步，直接進行下面的電轉(zhuǎn)程序即可）。

將制備好的電轉(zhuǎn)感受態(tài)細菌混合pRedET質(zhì)粒和/或rpsl-neo（或180bp非選擇性片段，或loxp-neo-loxp），轉(zhuǎn)入電擊杯并放入電轉(zhuǎn)儀中，按參數(shù)1750 V、5～6 ms進行電轉(zhuǎn)，取出菌液轉(zhuǎn)入一個15mL離心管中，37℃、70min振搖，以誘導同源重組反應的發(fā)生。最后將共約100μL菌液涂布于含有特定抗生素的LB瓊脂平板上，30℃培養(yǎng)20h，次日挑取菌落進行PCR鑒定，陽性菌落者送測序驗證。

2 結(jié)果

2.1 BAC-CCR5Δ32的構(gòu)建

首先PCR擴增rpsl-neo片段后純化得到1319bp片段（圖2A），此片段兩端各含有50bp的同源臂，隨后將其電轉(zhuǎn)入攜有pRedET質(zhì)粒的BAC菌株（該BAC上含有CCR5基因），在阿拉伯糖的誘導作用下pRedET質(zhì)粒發(fā)揮其同源重組功能，將具有50bp同源臂的rpsl-neo片段準確插入CCR5上的對應區(qū)域，瓊脂平板陽性菌落可在氯霉素、卡那霉素和四環(huán)素都存在的情況下生長，隨后陽性菌株的PCR鑒定可見6個克隆均存在1952和685bp片段，表明每個陽性菌株里面的部分BAC發(fā)生了正確的同源重組，即rpsl-neo準確插入了相應位置（圖2B），此為BAC-CCR5-rpsl-neo。

隨后我們將合成的2條寡核苷酸鏈退火延伸合成了180bp的非選擇性片段（圖2C），該片段具有rpsl-neo插入位置兩側(cè)的相對應的同源臂，并且此片段與該位置的CCR5基因序列完全一致，只是沒有Δ32區(qū)的32bp堿基序列；然后將此非選擇性片段電轉(zhuǎn)入攜有pRedET質(zhì)粒的BACCCR5-rpsl-neo菌株，按照同樣的重組程序替換掉rpsl-neo，可獲得BAC-CCR5Δ32。構(gòu)建成功的重組子可在氯霉素、鏈霉素和四環(huán)素都存在的情況下生長，令人驚訝的是隨后陽性菌株的PCR鑒定可見3個克隆均為168bp片段，表明每個陽性菌株里面的所有BAC發(fā)生了正確的同源重組即不僅rpsl-neo被替換，同時野生型BAC也被非選擇性片段置換（圖2D）。將BAC-CCR5Δ32菌株提取BAC后送測序，結(jié)果表明CCR5成功刪除了32bp（圖4A）。

圖2 BAC-CCR5Δ32的構(gòu)建

2.2 BAC-CCR5Δ32-loxp-neo-loxp的構(gòu)建

圖3 BAC-CCR5Δ32-loxp-neo-loxp的構(gòu)建

以質(zhì)粒pL452為模板，PCR擴增含有CCR5第2內(nèi)含子50bp同源臂的loxp-neo-loxp抗性基因片段，電泳結(jié)果表明存在1909bp片段（圖3A），切膠純化后將其電轉(zhuǎn)入BAC-CCR5Δ32菌株，以同樣的重組程序獲得重組子，該重組子可在氯霉素、卡那霉素和四環(huán)素都存在的情況下生長，隨后陽性菌株的PCR鑒定可見5個克隆均發(fā)生了重組插入，但是只有菌株4顯示2條片段（2324和415bp），這表明除4號菌株外其他陽性菌株里的所有BAC發(fā)生了正確的同源重組，即loxp-neoloxp準確插入了相應位置（圖3B），最后提取BAC送測序，結(jié)果表明loxp-neo-loxp成功插入相應位置（圖4B），構(gòu)建了BAC-CCR5Δ32-loxp-neo-loxp載體。

3 討論

細菌內(nèi)同源重組技術(shù)可在BAC上高效構(gòu)建各類載體，包括基因打靶載體，尤其適用于受精卵注射打靶載體獲得轉(zhuǎn)基因動物。本研究中我們詳細闡述了利用基于BAC的細菌內(nèi)同源重組構(gòu)建新型的CCR5Δ32打靶載體。首先我們合成了一段2kb左右的rpsl-neo片段，然后重組替換掉一段跨Δ32區(qū)域的CCR5上52bp序列，rpsl-neo的特性是賦予了宿主菌卡那霉素抗性和鏈霉素敏感性（BAC的宿主菌DH10B本身具有鏈霉素抗性，但rpsl的插入導致其抗性消失）；隨后我們構(gòu)建了180bp與CCR5Δ32基因型完全一致的非選擇性片段，并利用同樣技術(shù)重組替換掉rpsl-neo，此時含有BAC-CCR5Δ32的DH10B菌失去了卡那霉素抗性，但恢復了鏈霉素抗性，通過這種抗性的轉(zhuǎn)換我們篩選到BAC-CCR5Δ32的陽性菌株；最后我們合成并在CCR5內(nèi)含子區(qū)域插入了loxpneo-loxp片段，以賦予該打靶載體卡那霉素和G418抗性，方便將來用于細胞基因打靶的陽性克隆細胞富集。我們選擇在內(nèi)含子區(qū)域插入條件性抗性基因片段，目的是將來靶細胞一旦成功地敲除了32bp，獲得CCR5Δ32基因型后，可以引入Cre酶的表達去除此外源性的neo抗性基因，殘留的一個loxP序列也僅存在于內(nèi)含子區(qū)域，而且事先我們利用軟件預測了此內(nèi)含子區(qū)域不存在啟動子序列，從而不會影響CCR5Δ32基因后續(xù)的表達或表達效率，因此這成為該研究的一個重要的創(chuàng)新之處。

圖4 CCR5Δ32和loxp-neo-loxp構(gòu)建的測序結(jié)果

另有一項基于大腸桿菌DY380的同源重組技術(shù)，原理與本研究使用的系統(tǒng)基本一樣，但是由于它發(fā)揮功能必須在DY380細菌中，因此必須將BAC提取后轉(zhuǎn)化入DY380才能進行載體構(gòu)建，相對而言基于DH10B和pRedET質(zhì)粒的重組體系就十分便于編輯改造BAC并獲得打靶載體[10]。

圖2B結(jié)果顯示所有陽性菌落中rpsl-neo僅把每個陽性菌中的部分而非全部BAC重組置換，而圖2D則顯示當這些陽性菌在180bp非選擇性片段的重組反應中獲得一個令人十分驚奇的結(jié)果，即不僅類似圖2B中的已發(fā)生第一次重組反應的BAC-CCR5-rpsl-neo被置換成 BAC-CCR5Δ32，而且同一菌中的未發(fā)生第一次重組反應的野生型的BAC也被成功地置換成BAC-CCR5Δ32；同樣令人驚奇的，圖3B顯示5個陽性菌株里有4個的所有BAC都成功地重組插入了loxp-neo-loxp。對于上述兩個現(xiàn)象，我們推測可能是由于它們的同源臂區(qū)域較rpsl-neo的長所致[18-19]，因為非選擇性片段的同源臂左右平均各為90bp，loxp-neo-loxp左右同源臂均為80bp，而rpsl-neo卻僅為20bp。

總之，我們構(gòu)建了CCR5Δ32的新型打靶載體，為將來利用此載體在人胚胎干細胞或人血液T細胞中基因打靶獲得具有臨床意義的CCR5Δ32基因型的hESCs或T細胞奠定了基礎(chǔ)。

[1] Deng H,Liu R,Ellmeier W,et al.Identification of a major co-receptor for primary isolates of HIV-1[J].Na?ture,1996,381（6584）:661-666.

[2] Hutter G,Nowak D,Mossner M,et al.Long-term con?trol of HIV by CCR5 Delta32/Delta32 stem-cell trans?plantation[J].N Engl J Med,2009,360（7）:692-698.

[3] Swan C H,Buhler B,Steinberger P,et al.T-cell pro?tection and enrichment through lentiviral CCR5 intra?body gene delivery[J].Gene Ther,2006,13（20）:1480-1492.

[4] Akkina R,Banerjea A,Bai J,et al.siRNAs,ribo?zymes and RNA decoys in modeling stem cell-based gene therapy for HIV/AIDS[J].Anticancer Res,2003,23（3A）:1997-2005.

[5] DiGiusto D L,Krishnan A,Li L,et al.RNA-based gene therapy for HIV with lentiviral vector-modified CD34+cells in patients undergoing transplantation for AIDS-related lymphoma[J].Sci Transl Med,2010,2（36）:36ra43.

[6] Li L,Krymskaya L,Wang J,et al.Genomic editing of the HIV-1 coreceptor CCR5 in adult hematopoietic stem and progenitor cells using zinc finger nucleases[J].Mol Ther,2013,21（6）:1259-1269.

[7] Maier D A,Brennan A L,Jiang S,et al.Efficient clinical scale gene modification via zinc finger nucle?ase-targeted disruption of the HIV co-receptor CCR5[J].Hum Gene Ther,2013,24（3）:245-258.

[8] Mandal P K,Ferreira L M,Collins R,et al.Efficient ablation of genes in human hematopoietic stem and ef?fectorcells using CRISPR/Cas9[J].CellStem Cell,2014,15（5）:643-652.

[9] Ye L,Wang J,Beyer A I,et al.Seamless modifica?tion of wild-type induced pluripotent stem cells to the natural CCR5Delta32 mutation confers resistance to HIV infection[J].Proc Natl Acad Sci USA,2014,111（26）:9591-9596.

[10]Liu P,Jenkins N A,Copeland N G.A highly effi?cient recombineering-based method for generating con?ditional knockout mutations[J].Genome Res,2003,13（3）:476-484.

[11]Sharan S K,Thomason L C,Kuznetsov S G,et al.Re?combineering:a homologous recombination-based meth?od of genetic engineering[J].Nat Protoc,2009,4（2）:206-223.

[12]Bird A W,Erler A,Fu J,et al.High-efficiency coun?terselection recombineering for site-directed mutagene?sis in bacterial artificial chromosomes[J].Nat Methods,2012,9（1）:103-109.

[13]Westenberg M,Soedling H M,Mann D A,et al.Coun?ter-selection recombineering ofthe baculovirusge?nome:a strategy for seamless modification of repeatcontaining BACs[J].Nucleic Acids Res,2010,38（16）:e166.

[14]Wu S,Ying G,Wu Q,et al.A protocol for construct?ing gene targeting vectors:generating knockout mice forthe cadherin family and beyond[J].NatProtoc,2008,3（6）:1056-1076.

[15]Zhang Y,Buchholz F,Muyrers J P,et al.A new log?ic for DNA engineering using recombination in Esche?richia coli[J].Nat Genet,1998,20（2）:123-128.

[16]Heermann R,Zeppenfeld T,Jung K.Simple genera?tion of site-directed point mutations in the Escherich?ia coli chromosome using Red（R）/ET（R）recombination[J].Microb Cell Fact,2008,7:14.

[17]Wang S,Zhao Y,Leiby M,et al.A new positive/nega?tive selection scheme for precise BAC recombineering[J].Mol Biotechnol,2009,42（1）:110-116.

[18]FujimotoR,OsakabeT,SaitoM,etal.Minimum length of homology arms required for effective Red/ET recombination[J].BiosciBiotechnolBiochem,2009,73（12）:2783-2786.

[19]Bao Z,Cartinhour S,Swingle B.Substrate and target sequence length influence RecTE（Psy）recombineering efficiency in Pseudomonas syringae[J]. PLoS One,2012,7（11）:e50617.

Construction ofCCR5Δ32TargetingVectorwith Red/ET Homologous Recombination

LU Zhi-Yong,YANG Zhuo-Shun,DING Yan,YUAN Ya-Hong,WANG Xiao-Li,YU Li,LI Dong-Sheng*
Life Research Institute,Taihe Hospital,Hubei University of Medicine,Shiyan 442000,China*Corresponding author,E-mail:dsli1698@126.com

Objective:Recently modification of CCR5 locus for anti-HIV-1 infection was performed by the ge?nome editing methods like TELENs or CRISPR-Cas with the strategies of disruption of CCR5.To obtain the exact mutation of Δ32 deletion at the locus,we employed a novel strategy for developing CCR5Δ32 targeting vector based on Red/ET homologous recombination.Methods:Firstly,a rpsl-neo cassette flanked by two homology arms to CCR5 was amplified by PCR and then electroporated into E.coli DH10B with the BAC bearing CCR5.Through Red/ET homologous recombination,a 52bp DNA sequences containing Δ32 in CCR5 was replaced by rpsl-neo.Subsequently,a non-selectable fragment was electroporated and replaced the rpsl-neo resulting in Δ32 deletion at CCR5.Furthermore,a loxp-neo-loxp cassette was also introduced into intron 2 within CCR5 through the same machnism,which allows for G418 selection for future targeting human cells and will be cut under the Cre protein only leaving one loxp at the intron region.Results:rpsl-neo cassette was successfully inserted into CCR5 on BAC and replaced by non-selectable fragment and at the same time a loxp-neo-loxp cassette was also introduced into intron 2 of CCR5.Conclusion:CCR5Δ32-loxp-neo-loxp targeting vector was accessed by Red/ET homologous re?combination.

CCR5;bacterial artificial chromosome;homologous recombination;recombineering

Q78

A

1009-0002（2017）04-0415-07

2017-02-20

國家科技重大專項（2013ZX10001004-002-005）；湖北省教育廳科研項目（B2013111）

盧智勇（1973- ），男，博士，（E-mail）zylever@126.com

李東升，（E-mail）dsli1698@126.com

10.3969/j.issn.1009-0002.2017.04.003