鰱魚(yú)魚(yú)鱗膠原蛋白抗氧化鈦的結(jié)構(gòu)鑒定

陳日春，鄭寶東

(1.福建賽福食品檢測(cè)研究所有限公司，福建福州350000；2.福建農(nóng)林大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院，福建福州350002)

鰱魚(yú)魚(yú)鱗膠原蛋白抗氧化鈦的結(jié)構(gòu)鑒定

陳日春1，鄭寶東2

(1.福建賽福食品檢測(cè)研究所有限公司，福建福州350000；2.福建農(nóng)林大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院，福建福州350002)

為了對(duì)鰱魚(yú)魚(yú)鱗膠原蛋白抗氧化肽進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定，連續(xù)采用DEAE-52陰離子交換層析、Sephadex G-15葡聚糖凝膠層析和RP-HPLC對(duì)相對(duì)分子量小于1kU的抗氧化肽（SCSCP）進(jìn)行分離純化，再通過(guò)SDS-PAGE、質(zhì)譜、傅里葉紅外光譜等方法進(jìn)行抗氧化肽鑒定。本方法分離純化的結(jié)果得到高純度抗氧化肽，其相對(duì)分子量為576.9，由Glu、His、Pro和Tyr組成，4種氨基酸的摩爾比為n(Glu):n(His):n(Pro):n(T yr)=1:1:1:1；氨基酸序列為HPEY（His-Pro-Glu-Tyr）。經(jīng)檢索，此為一種新型抗氧化肽。

鰱魚(yú)；膠原蛋白；抗氧化肽；結(jié)構(gòu)鑒定

自從Marcuse[1]第一次報(bào)道蛋白肽的抗氧化作用以來(lái)，關(guān)于動(dòng)植物蛋白水解物或肽的抗氧化特性的研究報(bào)道非常多，例如向日葵[2]、苜蓿葉[3]、鯖魚(yú)肌肉蛋白[4]、牛皮明膠[5]、金槍魚(yú)魚(yú)骨[6]等。由于每年都有數(shù)量龐大的魚(yú)類(lèi)加工副產(chǎn)物（魚(yú)皮、魚(yú)骨、魚(yú)鱗等）形成，這些副產(chǎn)物通常被認(rèn)為是低值資源，其市場(chǎng)及潛在價(jià)值被忽略。此外，對(duì)這些魚(yú)類(lèi)加工副產(chǎn)物的不當(dāng)處理還是造成環(huán)境污染的主要因素。膠原蛋白作為一種結(jié)構(gòu)蛋白，在魚(yú)類(lèi)加工副產(chǎn)物（魚(yú)鱗、魚(yú)皮、魚(yú)骨等）中含量非常豐富，充分利用這些膠原蛋白生產(chǎn)高附加值的活性肽，不僅能夠變廢為寶，還能一定程度上減少環(huán)境污染。采用生物酶解技術(shù)將這些副產(chǎn)物轉(zhuǎn)化成市場(chǎng)可接受的高附加值產(chǎn)品，已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于食品領(lǐng)域。因此利用不同種類(lèi)的魚(yú)類(lèi)加工副產(chǎn)物生產(chǎn)抗氧化水解物和肽引起了研究人員極大的關(guān)注，例如阿拉斯加鱈魚(yú)[7]、軍曹魚(yú)[8]、巨型魷魚(yú)[9]等。

因此利用鰱魚(yú)魚(yú)鱗生產(chǎn)膠原蛋白，并進(jìn)一步采用生物酶解技術(shù)制備膠原蛋白抗氧化活性肽，不僅可作為天然的抗氧化劑使用，提高魚(yú)類(lèi)加工副產(chǎn)物的市場(chǎng)及潛在價(jià)值，還可以增加就業(yè)和商業(yè)機(jī)會(huì)，具有廣闊的市場(chǎng)前景與積極的現(xiàn)實(shí)意義。

然而，盡管上述的鰱魚(yú)魚(yú)鱗膠原蛋白抗氧化肽（SCSCP）已經(jīng)過(guò)初步純化，但畢竟還是以肽為主的含有蛋白質(zhì)和氨基酸等物質(zhì)的混合體系，而且由于肽分子的大小、組成和結(jié)構(gòu)等方面的多樣性和復(fù)雜性，要進(jìn)一步了解鰱魚(yú)魚(yú)鱗膠原蛋白肽中抗氧化活性較好的肽鏈及其表現(xiàn)出抗氧化活性的機(jī)理，就需要利用各種分離技術(shù)對(duì)其進(jìn)行進(jìn)一步分離純化而獲得明確的活性肽的組成，并進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定，從而找到肽段結(jié)構(gòu)與活性之間的關(guān)系，為明確鰱魚(yú)魚(yú)鱗膠原蛋白抗氧化活性肽的作用機(jī)理做鋪墊。

1、實(shí)驗(yàn)部分

1.1 主要試驗(yàn)材料與試劑

鰱魚(yú)魚(yú)鱗 收集于福州市華林路永輝超市EUE-52纖維素填料 南京都萊生物科技有限公司葡聚糖凝膠Sephadex G-15 南京都萊生物科技有限公司其它化學(xué)試劑均為分析純或優(yōu)級(jí)純

1.2 主要試驗(yàn)儀器

旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海亞榮生化儀器廠SPD-20A高效液相色譜 日本島津公司Capell pack C18 UG120（?20×250mm）色譜柱 日本資生堂Zorbax SB-C18（?4.6×250 mm）色譜柱 美國(guó)安捷倫公司4700 ProteomicsAnslyzer 串聯(lián)飛行時(shí)間質(zhì)譜儀 Applied Biosystems, USA

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 SCSCP的制備

魚(yú)鱗→除雜→清洗→晾干（含水量17%）→EDTA溶液浸泡脫鈣（料液比1:30，EDTA濃度0.17mol/L，浸泡時(shí)間30h）→清洗至中性→氫氧化鈉溶液浸泡脫雜蛋白（料液比（w/v）1:8，氫氧化鈉溶液濃度0.1mol/L，浸泡時(shí)間6 h）→酶法提取膠原蛋白（液料比（v/w）18.0，胃蛋白酶添加量25.51U·mg-1，提取時(shí)間61.9h）→300目濾布過(guò)濾→濾液→鹽析（0.9mol/L氯化鈉，鹽析24h）→10ku透析袋中透析24h→凍干→膠原蛋白→酶解（底物濃度5.47%，酶解時(shí)間4.24h，酶添加量4200U·g-1）→依次采用5ku、3ku和1ku超濾膜過(guò)濾→濾液干燥→SCSCP。

1.3.2 離子交換層析分離純化抗氧化肽

取適量SCSCP凍干樣品，溶于Tris-HcL緩沖溶液（20mmol/L，pH8.0），配成20mg/mL的樣品溶液備用。將EUE-52填料裝入玻璃層析柱（2.5×60cm）中，采用Tris-HcL緩沖溶液（20mmol/L，pH 8.0）對(duì)層析柱進(jìn)行平衡洗脫，取4mL樣品溶液上柱，用0-2.0mol/L的氯化鈉溶液進(jìn)行線(xiàn)性梯度洗脫，流速1.0mL/min，采用自動(dòng)部分收集器收集洗脫液，4mL/管，同時(shí)采用紫外檢測(cè)器進(jìn)行跟蹤檢測(cè)215nm處的吸光度，最后將屬于同一峰的收集液混合，凍干后分析其對(duì)和·OH自由基的清除能力。

1.3.3 凝膠層析分離純化抗氧化肽

將處理好的葡聚糖凝膠SephadexG-15裝入玻璃層析柱（1.5×100cm），用蒸餾水平衡凝膠層析柱。將離子交換層析法分離所得的抗氧化活性最強(qiáng)的組分溶于蒸餾水配制成20mg/mL的溶液，取4mL上柱，用蒸餾水進(jìn)行洗脫，流速1mL/min，用自動(dòng)部分收集器收集洗脫液，4mL/管，同時(shí)采用紫外檢測(cè)器跟蹤檢測(cè)215nm處的吸光度，最后將屬于同一峰的收集液混合，凍干后分析其對(duì)和·OH自由基的清除能力。

1.3.4 反相高效液相色潽法（RP-HPLC）分離純化抗氧化肽

采用RP-HPLC對(duì)凝膠層析法分離純化所得抗氧化活性最強(qiáng)的肽段作進(jìn)一步分離。RP-HPLC分離分兩步進(jìn)行，第一步采用半制備柱Capell pack C18 UG120（20×250mm）進(jìn)行分離；流速2 mL/min；取濃度為10mg/mL樣品1mL進(jìn)樣，采用含有0.1%三氟乙酸的乙腈溶液（0-40%v/v）進(jìn)行線(xiàn)性梯度洗脫。于波長(zhǎng)215nm下進(jìn)行檢測(cè)，最后將屬于同一峰下的組分收集混合，凍干后分析其對(duì)和·OH自由基的清除能力。

第二步RP-HPLC，取第一步RP-HPLC分離所得的抗氧化活性最強(qiáng)的肽段50μL進(jìn)樣。檢測(cè)條件：色譜柱：Zorbax SB-C18（4.6×250mm），流速1mL/min，采用含有0.1%三氟乙酸的乙腈溶液（0-20%v/v）進(jìn)行線(xiàn)性梯度洗脫，檢測(cè)波長(zhǎng)215nm。最后將同一峰下的組分收集混合，凍干后分析其對(duì)和·OH自由基的清除能力。

1.3.5 抗氧化肽的氨基酸組成分析

取鰱魚(yú)魚(yú)鱗膠原蛋白樣品（10-20mg）置于6mol/L鹽酸溶液中，于110℃真空條件下酸水解24h，然后采用氨基酸分析儀測(cè)定水解液中氨基酸組成。

1.3.6 MALDI-TOF-TOF MS質(zhì)譜分析抗氧化肽

質(zhì)譜儀：4700proteomicsAnalyzer（TOF/TOF）串聯(lián)飛行時(shí)間質(zhì)譜儀；

分析軟件：4700 Explorer；

點(diǎn)樣方式：先點(diǎn)0.5μL的樣品于MALDI不銹鋼靶板上，自然干燥后，再點(diǎn)上0.5μL 0.5g/Lα-氰基-4-羥基肉桂酸（CCA）溶液（溶劑為0.1%三氟乙酸+50%的乙氰）中，在室溫下自然晾干。另點(diǎn)0.5μL 0.5g/LCCA 溶液（不加樣品）作為空白對(duì)照。

激光源為355nm波長(zhǎng)的Nd:YAG激光器，加速電壓20kV，采用正離子模式和自動(dòng)獲取數(shù)據(jù)的模式采集數(shù)據(jù)。儀器先用myoglobin酶解肽段進(jìn)行外標(biāo)校正?；|(zhì)和樣品的PMF質(zhì)量掃描范圍為相對(duì)分子質(zhì)量為100-1000。經(jīng)MS測(cè)定后，直接選擇與對(duì)照基質(zhì)的PMF圖有差異的肽段離子進(jìn)行MS/MS分析。

1.3.7 DPPH·自由基清除活性的測(cè)定

DPPH·自由基清除活性的測(cè)定參照Shimau等的方法略作修改。取2.5mL樣品液置于試管中，加入2.5L溶于95%乙醇的DPPH溶液（0.1mmol/L），將混合物激烈振蕩10s，然后置于室溫下反應(yīng)30min，反應(yīng)結(jié)束后，于517nm下測(cè)量反應(yīng)混合物吸光度，同時(shí)以2.5mL蒸餾水代替樣品液做空白對(duì)照。樣品液對(duì)DPPH·自由基清除活性按式（3-2）計(jì)算：

式中：B0為空白對(duì)照吸光度，B為樣品吸光度。

自由基清除活性的測(cè)定參照Wang等的方法略作修改。取1mL樣品溶液置于試管中，加入1mL氯化硝基四氮唑藍(lán)（NBT，2.52mmol/L）和1mL煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（624mmol/L），添加1mL吩嗪硫酸甲酯溶液（PMS，120μmol/L）啟動(dòng)反應(yīng)，于25℃下反應(yīng)5min后測(cè)量產(chǎn)物560nm處吸光度，同時(shí)以蒸餾水代替樣品液做空白對(duì)照。樣品液對(duì)自由基的清除活性按式（3-3）計(jì)算：

式中：C0為空白對(duì)照吸光度，C為樣品吸光度。

1.3.9 ·OH自由基清除活性的測(cè)定

·OH自由基清除活性的測(cè)定參照Wang等的方法。在該方法中，·OH自由基通過(guò)Fenton反應(yīng)形成。羥自由基能夠?qū)⒍r(jià)鐵離子氧化成三價(jià)鐵離子，并且只有二價(jià)鐵離子能與1,10-菲啰啉結(jié)合生成紅色化合物，該化合物在波長(zhǎng)為536nm處有吸收。羥自由基的濃度反映了反應(yīng)液的脫色程度。取1.0mL1,10-菲啰啉（1.865mmol/L）與2.0mL樣品液于具塞試管中混合，加入1.0mLFeSO4·7H2O（1.865mmol/L），最后加入1.0mLH2O2溶液（0.03%，v/v）啟動(dòng)反應(yīng)，將試管置于37℃水浴中反應(yīng)60min，于536nm處測(cè)量反應(yīng)混合液吸光度，并以蒸餾水代替樣品液做陰性對(duì)照，以蒸餾水代替過(guò)氧化氫作為空白對(duì)照。樣品對(duì)·OH自由基的清除活性按式（3-4）計(jì)算：

2018年豐盛控股的旅游業(yè)務(wù)布局已經(jīng)初具規(guī)模，在直接或間接入股途牛和驢媽媽兩大OTA平臺(tái)的基礎(chǔ)上，公司也先后與美團(tuán)、同程、攜程、八爪魚(yú)等網(wǎng)站開(kāi)展了合作。公司搭建旅游供應(yīng)鏈平臺(tái)不到一年時(shí)間，已和上百家旅行社達(dá)成業(yè)務(wù)合作，除了在業(yè)務(wù)上幫助出境游的旅行社在海外代采以外，豐盛控股已經(jīng)實(shí)現(xiàn)為國(guó)內(nèi)旅行社代為購(gòu)買(mǎi)機(jī)票、酒店、門(mén)票、線(xiàn)路產(chǎn)品等業(yè)務(wù)。2019年，豐盛控股將加大文旅產(chǎn)業(yè)的投資布局，同時(shí)深耕旅游供應(yīng)鏈平臺(tái)的業(yè)務(wù)發(fā)展。

·OH自由基清除率（%）=(D－D0)/(D0－D1)×100% （3-4）

式中：D為樣品吸光度，D1為陰性對(duì)照吸光度，D0為空白對(duì)照吸光度。

1.3.10 數(shù)理統(tǒng)計(jì)

采用DPS7.05軟件進(jìn)行單因素方差分析，組間比較采用Tukey法，P＜0.05表示差異顯著。實(shí)驗(yàn)結(jié)果以平均值±SD表示。

2、結(jié)果與分析

2.1 離子交換層析分離純化抗氧化肽

如圖1所示，SCSCP經(jīng)DEAE-52纖維素離子交換層析分離后，依次收集到A、B、C、D、E五個(gè)組分。其中A-C為未結(jié)合組分，D和E為結(jié)合組分，由于DEAE-52纖維素為陰離子交換樹(shù)脂，因此可初步判斷A-C為堿性肽段，D和E為中性或弱酸性肽段。分別考察各組分對(duì)自由基的清除活性，結(jié)果如圖2所示。組分E對(duì)自由基的清除活性最強(qiáng)（P＜0.05），對(duì)DPPH·、O－·和·OH的清除率分別為83.83±0.58%、56.43±1.27%和65.47±0.75%。

圖1 離子交換層析分離純化組分SCSCPFig．1 Separation of fraction SCSCP-IV by ion-exchange chromatography．

圖2 離子交換層析分離純化組分SCSCP后各產(chǎn)物對(duì)自由基的清除活性Fig．2 Free radical scavenging activity of fractions obtained by ionexchange chromatography

2.2 凝膠層析分離純化抗氧化肽

凝膠層析的原理是不同的溶質(zhì)因不同程度進(jìn)入分離介質(zhì)而在液相中停留的時(shí)間不同，凝膠的孔徑和溶質(zhì)分子大小的關(guān)系決定了層析時(shí)該溶質(zhì)在層析柱中的保留時(shí)間，不同的物質(zhì)因保留時(shí)間不同而分離。

由于SCSCP是經(jīng)截留分子量為1ku的超濾膜分離后的產(chǎn)物，因此采用Sephadex G-15葡聚糖凝膠層析對(duì)離子交換層析得到對(duì)自由基清除活性較強(qiáng)的組分E進(jìn)一步純化，結(jié)果如圖3所示。收集到E1、E2和E3三個(gè)組分，其中E1的洗脫體積最小，分子量最大；E3洗脫體積最大，分子量最小。分別測(cè)定E1、E2和E3組分對(duì)自由基的清除率，結(jié)果如圖6-4所示。組分E3的自由基清除活性最強(qiáng)（P＜0.05），對(duì)DPPH·、O－·和·OH的清除率分別為90.70±0.70%、75.72±2.25%和80.63±選擇E3組分作進(jìn)一步純化。

圖 3 凝膠層析法分離純化組分EFig．3 Separation of fraction E by gel filtration chromatography

圖4 凝膠層析法分離組分E后所得各組分的自由基清除活性Fig．4 Free radical scavenging activity of fractions obtained by gelfiltration chromatography

2.3 反相高效液相色潽法（RP-HPLC）分離純化抗氧化肽

反相層析（reversed phase chromatography，RPC）是根據(jù)溶質(zhì)與固定相之間的疏水作用，在非極性固定相上，用極性相對(duì)較大的液體作為流動(dòng)相，進(jìn)行物質(zhì)分離分析的一種液相層析方法，是目前高效液相層析分離中最廣泛的一種分離模式。

如圖5所示，E3組分經(jīng)RP-HPLC分離純化后，收集到9個(gè)組分，分別考察這9個(gè)組分對(duì)自由基的清除活性，結(jié)果如圖6所示。組分E3-4對(duì)的活性最強(qiáng)（P＜0.05），對(duì)DPPH·、O－·和·OH的清除率分別為91.80±1.08%、79.23±4.10%和82.17±2.35%。選擇E3-4進(jìn)行下一步的純度鑒定。

圖5 反相高效液相色譜法分離純化組分E3Fig．5 Separation of fraction E3 by RP-HPLC

圖6 反相高效液相色譜法分離組分E3后所得各組分的自由基清除活性Fig．6 Free radical scavenging activity of fractions obtained by RP-HPLC

2.4 抗氧化肽的純度鑒定

2.5 抗氧化肽的氨基酸組成

圖7 組分C3-4 的 RP-HPLC分析圖譜Fig．7 Analytical RP-HPLC chromatography of Fraction C3-4

對(duì)組分E3-4進(jìn)行氨基酸組成分析，為后面的測(cè)序工作提供一定的基礎(chǔ)，結(jié)果如圖8所示。組分E3-4中含有4種氨基酸，分別為谷氨酸、組氨酸、脯氨酸和酪氨酸，且4種氨基酸的摩爾比為n(gl u):n(his):n(pro):n(tyr)=1:1:1:1。

2.6 MALDI-TOF-TOF MS質(zhì)譜分析抗氧化肽

圖8 組分C3-4的氨基酸組成分析圖譜Fig．8 Amino acid composition analysis chromatography of Fraction C3-4

MALDI-TOF是目前蛋白質(zhì)鑒定中精確測(cè)定相對(duì)分子質(zhì)量的手段，特別適合對(duì)混合蛋白多肽類(lèi)物質(zhì)的相對(duì)分子質(zhì)量的測(cè)定，具有測(cè)定速度快、效率高、操作容易、靈敏度和分辨率高且樣品用量少（pmol水平）等優(yōu)點(diǎn)；同時(shí)結(jié)合液相色譜的聯(lián)用技術(shù)可以高效率的鑒定多肽物質(zhì)；特別是當(dāng)各種原理的質(zhì)譜技術(shù)串聯(lián)應(yīng)用時(shí)，不但可以得到多肽的相對(duì)分子質(zhì)量信息，還可以測(cè)定它的序列結(jié)構(gòu)。本章采用 MALDI-TOF/TOF MS 和 TOF-MS/MS來(lái)測(cè)定抗氧化肽段 E3-4的質(zhì)量指紋圖譜和氨基酸序列。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖9和圖10所示。

圖9是組分E3-4的一級(jí)質(zhì)譜圖，圖中的橫坐標(biāo)為離子的質(zhì)荷比(m/z)，縱坐標(biāo)為離子強(qiáng)度。在圖6-8中577.9的峰是E3-4片段質(zhì)子化后離子([M+H]+)的峰，所以減去一個(gè)H+質(zhì)子后，得到的576.9就是E3-4片段的相對(duì)分子質(zhì)量，這與氨基酸組成分析中估算的分子量相符。圖譜中的其他質(zhì)荷比是一些雜肽質(zhì)子化后的離子峰，所有相對(duì)分子質(zhì)量的計(jì)算結(jié)果均是使用Peptide Companion軟件得到。

MALDI-TOF/TOF MS技術(shù)不僅能夠準(zhǔn)確測(cè)定肽段的相對(duì)分子質(zhì)量，還可以直接預(yù)測(cè)肽段中的氨基酸排列順序。將一級(jí)質(zhì)譜中離子強(qiáng)度最高的母離子，進(jìn)入二級(jí)質(zhì)譜，使用惰性原子碰撞肽段使其肽鍵斷裂，通過(guò)計(jì)算得到的各肽段相對(duì)分子質(zhì)量數(shù)值上的差值就可以推斷肽段的氨基酸序列。得到的質(zhì)譜圖譜數(shù)據(jù)可以通過(guò)手工計(jì)算分析，也可以使用質(zhì)譜儀器上配制的軟件自動(dòng)分析。本實(shí)驗(yàn)中使用二級(jí)質(zhì)譜預(yù)測(cè)肽段E3-4的氨基酸序列，其二級(jí)質(zhì)譜圖如圖10所示。采用質(zhì)譜分析軟件 MassLynx 4.1對(duì)圖譜數(shù)據(jù)進(jìn)行解析，推測(cè)出E3-4的可能氨基酸組成為HPEY，即His-Pro-Glu-Tyr。在 NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）和生物活性肽數(shù)據(jù)庫(kù)（http://www.peptides.be/）中搜索，均未發(fā)現(xiàn)相同匹配，表明E3-4是一種新型的抗氧化肽。

圖9 組分E3-4的MS圖譜Fig．9 MS spectrum of Fraction E3-4

圖10 組分E3-4的MS/MS圖譜Fig．10 MS/MS spectrum of Fraction E3-4

2.7 鰱魚(yú)魚(yú)鱗膠原蛋白抗氧化肽作用機(jī)理的初步分析

蛋白肽的一級(jí)結(jié)構(gòu)和分子量大小，直接決定了其抗氧化活性的強(qiáng)弱[10-11]。本章從鰱魚(yú)魚(yú)鱗膠原蛋白肽中分離出的目標(biāo)抗氧化肽組成為四肽（His-Pro-Glu-Tyr），這進(jìn)一步驗(yàn)證了2-10個(gè)短肽比其母蛋白和多肽具有更強(qiáng)的抗氧化性質(zhì)[12]。早在20世紀(jì)70年代，就有研究發(fā)現(xiàn)含有芳香族氨基酸（Trp或Tyr）和含有Tyr、Pro或His的肽鏈具有較強(qiáng)的抗氧化活性[11,13]。從金槍魚(yú)蒸煮液酶解物[14]、泥鰍蛋白酶解物[15]、蜂王漿蛋白酶解物[13]中也分離鑒定出多種結(jié)構(gòu)中含有Tyr、Pro或 His的具有較強(qiáng)抗氧化活性的肽鏈。Chen等也發(fā)現(xiàn)采用Alcalase酶解馬鈴薯蛋白所得的抗氧化肽段中也多含有Tyr。而根據(jù)張苗的研究結(jié)果，Tyr在肽段中的具體位置對(duì)于活性肽潛在的抗氧化活性不是一個(gè)關(guān)鍵的影響因素[17]。但Saito等[18]認(rèn)為在C末端含有Trp或Tyr的三肽具有較強(qiáng)的自由基清除活性，本章的研究結(jié)果也對(duì)這一論點(diǎn)進(jìn)行了證實(shí)。

含有Tyr、Pro或His的肽鏈之所以具有較強(qiáng)的抗氧化活性，是因?yàn)榉枷阕灏被酺yr具有酚羥基結(jié)構(gòu)，具有提供質(zhì)子的作用，可以猝滅自由基[19]；同時(shí)肽鏈（His-Pro-Glu-Tyr）中與Tyr鄰近的Glu的羧酸根具有吸電子作用，可使Tyr 酚羥基上氧電子云密度減弱，從而更有利于質(zhì)子的釋放，增強(qiáng)了Tyr的質(zhì)子供體效應(yīng)；且由于Tyr苯環(huán)為共軛體系，也可使其去掉質(zhì)子后形成的自由基中間體趨于更穩(wěn)定[20]。 His對(duì)肽鏈的抗氧化活性同樣具有重要的作用，它含有的咪唑環(huán)可以提供質(zhì)子，起到螯合金屬離子和清除自由基作用[20-24]。此外，本章所得肽鏈（His-Pro-Glu-Tyr）中酸性氨基酸Glu和堿性氨基酸His還能分別通過(guò)側(cè)鏈的羰基和氨基螯合金屬離子，從而起到抗氧化作用[11]。另有研究報(bào)道，疏水性氨基酸殘基的存在能增強(qiáng)肽段的抗氧化能力[25]。本章分離純化出的抗氧化肽段（His-Pro-Glu-Tyr）中疏水性氨基酸占75%，因而具有良好的抗氧化活性。另一方面，雖然單個(gè)的氨基酸（如Tyr、Met、His、Lys、Trp）也具有一定的抗氧化性，但其活性卻遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于由其所組成的抗氧化肽，這也是生物活性肽的一個(gè)顯著特點(diǎn)，即整個(gè)肽的活性遠(yuǎn)大于其組成氨基酸的活性。因此，可以認(rèn)為抗氧化肽的強(qiáng)抗氧化性在于肽鏈內(nèi)部氨基酸間的相互作用，強(qiáng)化了酪氨酸和脯氨酸等作為質(zhì)子供體的能力，增強(qiáng)了與體內(nèi)自由基的相互作用[21,26-27]。

綜合分析，本章所獲得的新型抗氧化四肽（His-Pro-Glu-Tyr）的抗氧化活性是由Tyr提供質(zhì)子的能力、His螯合金屬離子能力、強(qiáng)疏水性能以及其自身結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性決定的。主要通過(guò)捕捉自由基反應(yīng)過(guò)程中的過(guò)氧化自由基，從而阻止或減弱自由基鏈反應(yīng)的進(jìn)行。此外，當(dāng)氫原子給予自由基后，其本身轉(zhuǎn)化為自由基中間體，而此中間體越穩(wěn)定越易形成，其前體就越易清除自由基，則抗氧化能力越強(qiáng)[21-22,28]。

3、結(jié)論

本文依次采用離子交換層析，凝膠層析和RP-HPLC對(duì)鰱魚(yú)魚(yú)鱗膠原蛋白酶解初肽進(jìn)行分離純化，得到組分單一的E3-4肽段，最后通過(guò)質(zhì)譜技術(shù)對(duì)該肽段的氨基酸序列進(jìn)行分析，并初步分析了其抗氧化作用機(jī)理。所得主要結(jié)論如下：

（1）采用DEAE-52陰離子交換樹(shù)脂對(duì)SCSCP進(jìn)行分離純化，收集到A、B、C、D、E五個(gè)組分，其中組分E對(duì)自由基的清除活性最強(qiáng)（P＜0.05），對(duì)DPPH·、O－·和·OH的清除率分別為83.83±0.58%、56.43±1.27%和65.47±0.75%。

（2）采用Sephadex G-15葡聚糖凝膠層析對(duì)組分E作進(jìn)一步的分離純化，收集到E1、E2和E3三個(gè)組分，其中組分E3的自由基清除活性最強(qiáng)（P＜0.05），對(duì)DPPH·、O－·和·OH的清除率分別為90.70±0.70%、75.72±2.25%和80.63±1.31%。

（3）E3組分經(jīng)RP-HPLC分離純化后，收集到9個(gè)組分，其中組分E3-4對(duì)自由基的清除活性最強(qiáng)（P＜0.05），對(duì)DPPH·、O－·和·OH的清除率分別為91.80±1.08%、79.23±4.10%和82.17±2.35%；組分E3-4經(jīng)分析型RP-HPLC鑒定為純度較高的單一組分。

（4）氨基酸分析表明，組分E3-4由Glu、His、Pro和Tyr組成，4種氨基酸的摩爾比為n(Glu):n(His):n(Pro):n(Tyr)=1:1:1:1。

（5）組分E3-4經(jīng)MALDI-TOF/TOF MS 和 TOF-MS/MS分析，其相對(duì)分子量為576.9，氨基酸序列為HPEY（His-Pro-Glu-Tyr），經(jīng)檢索，為一種新型抗氧化肽。

（6）經(jīng)分析，本章所獲得的新型抗氧化四肽HPEY（His-Pro-Glu-Tyr）的抗氧化活性是由Tyr提供質(zhì)子的能力、His螯合金屬離子能力、強(qiáng)疏水性能以及其自身結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性決定的。

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Structure Identification of Silver Carp Fish Scale Collagen Antioxidant Peptide

CHEN Ri-chun1，ZHENG Bao-dong2
（1 Fujian Saifu Food Inspection Institute Co.,Ltd；2 College of Food Science, Fujian Agriculture and Forestry University）

In order to identify silver carp fish scale structure of collagen antioxidant peptides, it continuously used the DEAE-52 anion exchange chromatography, Sephadex G-15 glucan gel chromatography and RP-HPLC for relative molecular weight of less than 1 ku antioxidant peptide (SCSCP) for separation and purification, and then by sds-page, mass spectrometry, Fourier infrared spectrum method such as antioxidant peptide identification. The result of the method separation and purification is that getting high purity antioxidant peptide. Its relative molecular weight is 576.9 and consists of Glu, His, Pro and Tyr, four kinds of amino acids of the molar ratio of n (Glu):n (His):n (Pro):n (Tyr) =1:1:1:1;Amino acid sequence of HPEY (His-Pro-Glu-Tyr). This is a new type of antioxidant peptides by retrieval.

Silver carp; Collagen protein; Antioxidant peptides; Structure identification