microRNA-100在急性髓細(xì)胞白血病中的預(yù)后評(píng)估價(jià)值研究

趙明哲 胡慧仙 張素麗 駱超 章敬成

microRNA-100在急性髓細(xì)胞白血病中的預(yù)后評(píng)估價(jià)值研究

趙明哲 胡慧仙 張素麗 駱超 章敬成

目的探討骨髓細(xì)胞microRNA-100表達(dá)水平對(duì)急性髓細(xì)胞白血病（AML）患者的預(yù)后評(píng)估價(jià)值。方法 選取核型正常AML（CN-AML）患者154例，采用熒光定量RT-PCR法檢測骨髓細(xì)胞microRNA-100的表達(dá)水平，將數(shù)值大于等于中位數(shù)者歸為高表達(dá)組，低于中位數(shù)者歸為低表達(dá)組。比較microRNA-100高表達(dá)組與低表達(dá)組患者的臨床特征，包括性別、年齡、FAB分型、Hb、WBC、PLT、原始細(xì)胞比例、FLT3-ITD基因突變、NPM1基因突變、化療后完全緩解情況等。隨訪48個(gè)月，觀察并比較兩組患者總生存、無事件生存率。結(jié)果 與高表達(dá)組患者比較，低表達(dá)組患者的FAB分型M4、M5型比例較高（P＜0.05），Hb水平較低（P＜0.05），原始細(xì)胞比例較低（P＜0.05）。兩組患者性別、年齡、WBC、PLT、FLT3-ITD基因突變、NPM1基因突變、化療后完全緩解情況比較均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05）。microRNA-100低表達(dá)組患者總生存率、無事件生存率均低于高表達(dá)組患者（均P＜0.05）。結(jié)論 microRNA-100低表達(dá)或是AML患者預(yù)后差的評(píng)估指標(biāo)。

microRNA-100 急性髓細(xì)胞白血病 預(yù)后

急性髓細(xì)胞白血?。ˋML）是一種異質(zhì)性的血液系統(tǒng)腫瘤，主要表現(xiàn)為不同的分子特征和臨床預(yù)后[1]。隨著分子生物學(xué)的發(fā)展和基因測序技術(shù)的提高，許多與AML預(yù)后相關(guān)的生物標(biāo)志物被發(fā)現(xiàn)，如FLT3-ITD、NPM1、CEBPA基因突變等[1-2]。microRNA是一種非編碼的小分子RNA，其主要功能是在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控靶基因的表達(dá)，現(xiàn)已經(jīng)發(fā)現(xiàn)許多microRNA對(duì)細(xì)胞的增殖、分化、凋亡及轉(zhuǎn)移起著十分重要的作用。對(duì)血液系統(tǒng)腫瘤研究發(fā)現(xiàn)，microRNA-15/16可通過靶向抑制慢性粒細(xì)胞白血病患者Bcl-2基因的表達(dá)而參與疾病發(fā)生、發(fā)展，microRNA-181家族對(duì)AML患者預(yù)后有評(píng)估作用[3]。最近，一項(xiàng)對(duì)實(shí)體腫瘤的Meta分析提示microRNA-100的低表達(dá)與患者的預(yù)后差密切相關(guān)[4]。本研究通過檢測AML患者骨髓細(xì)胞中microRNA-100的表達(dá)水平，分析不同表達(dá)水平患者的臨床特征，探討該指標(biāo)對(duì)患者預(yù)后評(píng)估的價(jià)值，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 對(duì)象和方法

1.1 對(duì)象 選取2008至2016年本院收治的核型正常AML（CN-AML）患者 154 例，年齡 17～77 歲，中位年齡41歲。患者均采用IA方案化療（伊達(dá)比星8～10mg/m2，d1～3，阿糖胞苷 100mg，d1～7），鞏固治療采用3～4 個(gè)療程的中劑量阿糖胞苷（2g/m3，2 次 /d，d1～3），患者均未進(jìn)行骨髓移植。染色體核型采用R帶顯示法檢測，至少20個(gè)核型正常視為核型正常患者。采用PCR直接測序法對(duì)患者的骨髓細(xì)胞進(jìn)行FLT3-ITD、NPM1基因突變篩查，相關(guān)的引物和方法參考文獻(xiàn)[5]。本研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，患者知情同意并簽署知情同意書。

1.2 熒光定量RT-PCR法檢測microRNA-100的表達(dá)于2016年在本院中心實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。治療開始前采集患者的骨髓細(xì)胞，經(jīng)淋巴細(xì)胞分離液分離提取出單個(gè)核細(xì)胞，按照RNAiso Plus試劑盒說明書（日本Takara公司）操作，抽提出RNA，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，-80℃保存用于后續(xù)分析。RT-PCR反應(yīng)按照All-in-oneTMmiRNAqRTPCR Detection試劑盒（美國Gene Copoeia公司）進(jìn)行操作，采用20μl PCR反應(yīng)體系：逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)產(chǎn)物2μl，SYBR Premix Ex Taq 12.5μl，上游及下游引物各 1μl，雙蒸水（ddH2O）補(bǔ)足體系。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性30s，95℃5s，退火溫度60℃30s，所有產(chǎn)物均40個(gè)循環(huán)。每個(gè)樣本重復(fù)3次。內(nèi)參選用U6，ΔCt=microRNA-100的Ct值-U6的Ct值。ΔΔCt=待測樣品ΔCt-參照樣本ΔCt，按2-ΔΔCt值進(jìn)行microRNA-100的表達(dá)水平相對(duì)定量。U6的引物序列：5′-TGCGGGTGCTCGCTTCGGCAGC-3′。microRNA-100的引物序列：5′-AACCCGTAGATCCGAACTTGTG-3′。

1.3 觀察指標(biāo) 根據(jù)microRNA-100的表達(dá)水平，將數(shù)值大于等于中位數(shù)的患者歸為高表達(dá)組，低于中位數(shù)者歸為低表達(dá)組。比較microRNA-100高表達(dá)組與低表達(dá)組患者的臨床特征，包括性別、年齡、FAB分型、Hb、WBC、PLT、原始細(xì)胞比例、FLT3-ITD基因突變、NPM1基因突變、化療后完全緩解情況等。隨訪48個(gè)月，分別觀察并比較兩組患者總生存、無事件生存率。

1.4 隨訪 患者治療后每半年電話隨訪1次，隨訪48個(gè)月，觀察患者總生存、無事件生存率?？偵嫫诘亩x是指從患者確診CN-AML開始至因任何原因死亡的時(shí)間。無事件生存期的定義是指從患者確診CN-AML開始至疾病經(jīng)治療后無復(fù)發(fā)及其任何原因引起死亡。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件；計(jì)量資料以M（P25,P75）表示，兩組比較采用Wilcoxon秩和檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以頻數(shù)和構(gòu)成比表示，兩組比較采用χ2檢驗(yàn)；采用Kaplan-Meier法估計(jì)兩組患者的生存率并繪制生存曲線，兩組患者生存率的比較采用log-rank檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 microRNA-100高表達(dá)組與低表達(dá)組患者臨床特征比較 154例CN-AML患者microRNA-100的表達(dá)水平4.00～13.75，中位數(shù)為9.96，高表達(dá)組與低表達(dá)組患者各77例。兩組患者臨床特征比較見表1。

表1 microRNA-100高表達(dá)組與低表達(dá)組患者臨床特征比較

由表1可見，與高表達(dá)組患者比較，低表達(dá)組患者的 FAB 分型 M4、M5型比例較高（P＜0.05），Hb水平較低（P＜0.05），原始細(xì)胞比例較低（P＜0.05）。兩組患者性別、年齡、WBC、PLT、FLT3-ITD 基因突變、NPM1基因突變、化療后完全緩解情況比較均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P ＞0.05）。

2.2 microRNA-100高表達(dá)組與低表達(dá)組患者臨床預(yù)后比較 分別以總生存、無事件生存為終點(diǎn)繪制microRNA-100高表達(dá)組與低表達(dá)組患者生存曲線，見圖1（插頁）。

由圖1可見，microRNA-100低表達(dá)組患者總生存率、無事件生存率均低于高表達(dá)組患者（均P＜0.05）。

圖1 microRNA-100高表達(dá)組與低表達(dá)組患者生存曲線（a：總生存率；b：無事件生存率）

3 討論

microRNA在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程中起重要作用，許多microRNA不僅可作為治療的靶點(diǎn)，還可作為檢測診療的生物標(biāo)志物[3]。目前，在實(shí)體瘤中，臨床已經(jīng)深入研究microRNA-100在腫瘤中發(fā)生、發(fā)展的作用，結(jié)果提示microRNA-100起著抑癌基因的作用[4]。過表達(dá)microRNA-100后，可抑制多個(gè)癌基因的表達(dá)，如在食管癌中，microRNA-100過表達(dá)后可直接抑制mTOR和FGFRs的表達(dá)，進(jìn)而抑制腫瘤的增殖[6]；microRNA-100還可以抑制Wnt信號(hào)通路，抑制乳腺癌的轉(zhuǎn)移[7]；在肺癌中，microRNA-100可以抑制HOXA1癌基因的表達(dá)[8]。最近一項(xiàng)Meta分析結(jié)果表明，microRNA-100低表達(dá)的患者預(yù)后差[4]。與實(shí)體腫瘤相比，microRNA-100在血液系統(tǒng)腫瘤中的研究較少。

本研究探討骨髓細(xì)胞microRNA-100表達(dá)水平對(duì)AML患者的預(yù)后評(píng)估價(jià)值。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與microRNA-100高表達(dá)組患者比較，低表達(dá)組患者的FAB分型M4、M5型比例較高，Hb水平較低，原始細(xì)胞比例較低。兩組患者性別、年齡、WBC、PLT、FLT3-ITD 基因突變、NPM1 基因突變、化療后完全緩解情況比較均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。microRNA-100低表達(dá)組患者總生存率、無事件生存率均低于高表達(dá)組患者。這說明，microRNA-100的低表達(dá)與患者貧血相關(guān)，但具體機(jī)制目前并不清楚。microRNA-100低表達(dá)患者FAB分型M4、M5型比例較高，可能的解釋是 microRNA-100可抑制 FGFRs、HOXA1、Wnt信號(hào)通路等癌基因，進(jìn)而賦予了M4、M5型容易髓外轉(zhuǎn)移的惡性表型。在AML患者中，和實(shí)體瘤一樣，microRNA-100低表達(dá)者預(yù)后差。

本研究存在一些不足之處，如本研究是單中心研究；沒有檢查其他的高頻基因突變，如TET2、IDH1/2基因突變等；沒有采用細(xì)胞或動(dòng)物模型，在體外驗(yàn)證microRNA-100低表達(dá)提示AML患者預(yù)后差的生物學(xué)機(jī)制。但是，本研究發(fā)現(xiàn)microRNA-100低表達(dá)與CN-AML患者預(yù)后差有關(guān)。該結(jié)論有助于臨床醫(yī)師對(duì)CN-AML患者進(jìn)行危險(xiǎn)度分層，同時(shí)為研究AML的靶向治療藥物提供靶點(diǎn)。

綜上所述，本研究結(jié)果顯示骨髓細(xì)胞microRNA-100表達(dá)水平可預(yù)測AML患者預(yù)后，microRNA-100低表達(dá)或是AML患者預(yù)后差的評(píng)估指標(biāo)。

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Value of miR-100 expression in prognosis of patients with cytogenetically normalacute myeloid leukemia

ZHAO Mingzhe,HU Huixian,ZHANG Suli,et al.Department of Hematology,Jinhua Municipal Central Hospital (Jinhua Hospital of Zhejiang University),Jinhua 321000,China

ObjectiveTo assess the prognostic value of miR-100 expression in patients with cytogenetically normal acute myeloid leukemia(CN-AML).Methods miR-100 expression was detected by real-time quantitative PCR in bone marrow blasts from 154 patients with CN-AML.Patients with miR-100 expression level higher than the median were defined as high expression group.The age,sex,white cells counts(WBC),hemoglobin,platelet counts(PLT)and therapeutic response were compared between high and low expression groups.The overall survival(OS)and event free survival(EFS)were analyzed after 48 months of follow-up. Results Patients with low miR-100 expression had lower hemoglobin and lower percentage of blasts,but higher frequency of FAB M4/5 subtypes.There were no significant differences in age,sex,WBC and PLT,FLT3-ITD and NPM1 gene mutations and complete remission rate between high and low expression groups.Patients with low miR-100 expression had poorer OS and EFS than those with high expression. Conclusion miR-100 expression may be used as a prognostic biomarker for patients with CN-AML.

microRNA-100 Acute myeloid leukemia Prognosis

10.12056/j.issn.1006-2785.2017.39.19.2017-629

321000 金華市中心醫(yī)院（浙江大學(xué)金華醫(yī)院）血液科

趙明哲，E-mail：zhaomingzhe111@126.com

2017-03-22）

（本文編輯：李媚）