甘肅地區(qū)漢族和回族腦出血患者α-內(nèi)收蛋白基因rs4963多態(tài)性分析

范紅燕 司江華 彭小蘭 嚴雯 謝守嬪 范彩霞

蘭州市衛(wèi)生科技發(fā)展計劃項目(LZWSKY2014-2-01)

730050 蘭州市第一人民醫(yī)院干部病房(范紅燕)，神經(jīng)內(nèi)科[司江華(通信作者) 彭小蘭 嚴雯 謝守嬪 范彩霞]

甘肅地區(qū)漢族和回族腦出血患者α-內(nèi)收蛋白基因rs4963多態(tài)性分析

范紅燕 司江華 彭小蘭 嚴雯 謝守嬪 范彩霞

目的分析甘肅地區(qū)漢族和回族腦出血患者α-內(nèi)收蛋白基因rs4963多態(tài)性的分布情況。方法對甘肅地區(qū)漢族和回族腦出血患者各176例應用血液基因組DNA提取試劑盒方法檢測α-內(nèi)收蛋白基因rs4963多態(tài)性，比較rs4963多態(tài)性的分布差異。結果漢族組和回族組α-內(nèi)收蛋白基因rs4963基因型分布、等位基因頻率均無明顯差異(P>0.05)；按性別分層后漢族組與回族組基因型分布和等位基因頻率仍均無明顯差異(P>0.05)。結論α-內(nèi)收蛋白基因rs4963多態(tài)性在甘肅地區(qū)漢族和回族腦出血人群中無民族差異。

腦出血 α-內(nèi)收蛋白基因 甘肅地區(qū) 漢族 回族

種族是遺傳學研究中不可忽略的因素，不同種族人群具有不同的遺傳背景，基因多態(tài)性的差異造成了對疾病易感性的差異。甘肅是少數(shù)民族聚集較多的省份，尤其是回族。社會、飲食、自然等因素使甘肅回族形成遺傳學上相對隔離的人群，成為非常珍貴的遺傳資源。腦出血(intracerebral hemorrhage,ICH)是一種多因素疾病，受遺傳和環(huán)境因素共同作用的影響[1-4]，嚴重威脅人類的生命健康。α-內(nèi)收蛋白基因(ADD1基因)是目前研究較多的鈉離子轉運調(diào)控基因，多聚焦于其與高血壓病的相關性[5-6]。ADD1基因rs4963作為該基因的一個標簽單核苷酸多態(tài)性(tag SNP)，已被證實與癌癥等疾病相關[7-8]，但其與ICH 的關聯(lián)尚不明確。鑒于人類基因多態(tài)性在不同地區(qū)和種族間的差異，本研究旨在探討甘肅地區(qū)世居回族和漢族ICH患者ADD1基因rs4963多態(tài)性的分布情況。

1 對象與方法

1.1 研究對象

在知情同意的基礎上選取2013年1月～2015年12月在蘭州市第一人民醫(yī)院、蘭州大學第一醫(yī)院、蘭州軍區(qū)蘭州總醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科就診的漢族和回族ICH患者(各176例)的臨床資料及外周血標本。入組研究對象祖籍均為中國甘肅地區(qū)(居住3代以上)，3代內(nèi)無族外通婚、彼此間無直接血緣關系，性別、年齡匹配，無腦血管疾病家族史，無其他遺傳疾病。所有病例均經(jīng)頭顱CT和/或MR確診(參照第四屆全國腦血管病學術會議診斷標準[7])。排除標準：①混合型腦血管病(梗死后出血或出血后梗死)病例；②外傷、動脈炎、腫瘤、動靜脈畸形、動脈瘤或藥物引起的腦出血病例；③嚴重肝腎功能障礙、甲狀腺疾病、自身免疫疾病、血液病、妊娠。2組間年齡和性別均無明顯差異(P>0.05)。

1.2 主要試劑與儀器

實時熒光定量聚合酶鏈反應儀(德國Roche 公司)、AU2700 型生化檢測儀(美國Beckman公司)、DNA 提取試劑盒(北京康為世紀生物有限公司)、引物合成(美國 Invitrogen 公司)及相關配套試劑。

1.3 SNP選取、DNA提取和單核苷酸多態(tài)性檢測

通過國際人類基因組計劃(The International Hap Map Project)數(shù)據(jù)庫(http://hapmap.ncbi.nlm.nih.gov/cgi -perl/gbrowse/hapmap24_B36/)中tag SNP data 選項，進行檢索獲取ADD1 基因tag SNP。配置如下：選擇中國漢族人群(CHB)，Pairwise Methods 選擇為 Tagger Pairwise*，R Square cut off設為0.8，最小等位基因頻率設為0.1；索 ADD1基因獲得 tag SNP rs4963；提取DNA樣本濃度稀釋到10 ng/μL，進行熒光聚合酶鏈反應(PCR)擴增。鎂離子濃度 2 mmol/L，特異性長引物短引物比為1∶1，PCR總反應體系12.5 μL；不同tag SNP，實驗前均需摸索特異性長引物和短引物的合適比例，進而確保獲取準確的分型；為使產(chǎn)物的 Tm 值差異更易區(qū)分，在其 5′-端添加富含 GC 的尾巴，通常在3′-末端為 G/C 堿基的特異性引物上加入 14 bp 的長尾巴(5′-GCGGGCAGGGCGGC-3′)，而在 3′-末端為 A/T 堿基的特異性引物上添加 8 bp 的短尾巴(5′-GATTACCG-3′)，分別命名為長引物、短引物；上游長引物序列為5′-gcgggcagggcggc GAGAGGAAGCAGAAGGGCTG-3'，短引物序列為5′-gattaccg GAGAGGAAGCAGAAGGGCTC-3′，下游引物序列為5′-GTGCCCAGGACCACAAGCAC-3′；PCR反應體系為10×PCR 緩沖液(10×PCR buffer)1.25 μL、SYBR GreenⅠ染色劑(4×)0.625 μL、二甲基亞砜(DMSO，10%)1.25 μL、三磷酸脫氧核苷(d NTP，2.5 mmol/L)2 μL、ASP-長引物(ASP-long primer，10 μmol/L)0.25 μL、ASP-短引物(ASP-short primer，10 μmol/L)0.25 μL、共同引物(Common primer)0.25 μL、DNA 模板1 μL、Taq gold 酶(5 U/μL)0.06 μL，添加超純水(dd H2O)至12.5 μL；PCR 擴增程序為①95 ℃預變性15 min；②95 ℃變性20 s，引物Tm值復性45 s，72 ℃延伸30 s，總計 35個循環(huán)；③72 ℃延伸7 min，4 ℃保存。進入熔解曲線分析程序：95 ℃5 s，60 ℃1 min，以0.11 ℃/s 的速度將溫度上升至90 ℃，連續(xù)采集熒光信號，后40 ℃冷卻，溶解曲線數(shù)據(jù)由Roche公司提供的軟件進行聚類分析；根據(jù)tag SNP rs4963特異性引物的設計，結合熔解曲線峰形分型，峰值在前的熔解曲線所對應的基因型為短引物3’-末端相應堿基的純合子，峰值在后為長引物 3’-末端相應堿基的純合子，具有2個峰值的溶解曲線為該tag SNPrs4963 的雜合子基因型。

1.4 統(tǒng)計學處理

2 結 果

2.1 H-W遺傳平衡檢驗 ADD1基因rs4963基因型分布符合遺傳平衡定律(P>0.05)?；刈褰M和漢族組ADD1基因rs4963的基因型分布、等位基因頻率均無明顯差異(χ2分別為0.93和0.71，P>0.05)(表1)。

2.2 按性別分層后回族組和漢族組的基因型分布及等位基因頻率的比較 不同性別中ADD1基因的基因型分布仍符合遺傳平衡定律(P>0.05)，回族組與漢族組的基因型分布 (男χ2=4.46，P=0.09；女χ2=2.83，P=0.17)均無明顯差異；回族組與漢族組的等位基因頻率(男χ2=0.63，P=0.54；女χ2=3.04，P=0.09)也均無明顯差異(表2)。

表1 ADD1基因rs4963基因型分布及等位基因頻率的比較

表2 性別分層后ADD1基因rs4963基因型分布和等位基因頻率的比較

3 討 論

遺傳學研究認為，不同種族人群具有不同的遺傳學特征，而環(huán)境與遺傳因素相互作用可影響人體對某些疾病的易感性。甘肅是一個多民族聚集地，回族是僅次于漢族的第二大民族，具有較高的ICH發(fā)病風險。這種高風險考慮除受人群封閉居住、不良生活飲食習慣和生活狀況影響外，還考慮回族和漢族可能存在ICH的易感基因。

內(nèi)收蛋白是1986年Gardner等在紅細胞中發(fā)現(xiàn)的一種細胞膜骨架蛋白，參與細胞膜骨架網(wǎng)狀結構的構建及維持、細胞膜離子轉運、細胞信號轉導等多項生理功能。內(nèi)收蛋白由α亞基和β亞基或α亞基和γ亞基構成的異源二聚體，3 種亞基分別由 ADD1、ADD2、ADD3 3 種基因編碼。目前關于ADD1基因與高血壓病的關系的研究較多，但結論卻不一致，而高血壓病是腦出血最重要的危險因素。有2項研究報道發(fā)現(xiàn)ADD1基因Gly460Trp多態(tài)性與原發(fā)性高血壓病無相關性，且這2項研究均包含1個薈萃分析，分析結果仍為陰性，按人種的亞組分析后也未發(fā)現(xiàn)相關性，推測其原因有可能是未能收入當前所有的關于ADD1基因Gly460Trp多態(tài)性與高血壓病的關聯(lián)研究[5,8]。龔敏莉等[9]進行了一項大規(guī)模的社區(qū)抽樣研究，涉及2040例受試者，對照組和病例組各1020例，結果顯示ADD1基因rs4963多態(tài)性與高血壓病無相關性。日本學者Watanabe[10]對正常血壓的日本人群進行了12年的隨訪研究，發(fā)現(xiàn)Gly460Trp與高血壓病的發(fā)生相關，且經(jīng)過logistic多元回歸校正后發(fā)現(xiàn)Gly460Trp仍能獨立預測高血壓病的進展風險。

本研究結果顯示，ADD1基因rs4963多態(tài)性在甘肅地區(qū)回族、漢族的ICH患者中的分布差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，表明ADD1基因rs4963多態(tài)性可能在漢族和回族ICH發(fā)病中無顯著區(qū)別。進一步以性別為分層因素分析rs4963基因位點在回族、漢族ICH患者中的分布，結果仍然為陰性。但是本研究具有局限性，因為遺傳學研究需要大量研究樣本，每一種疾病可能有很多基因相互作用，故而每個基因所起的作用相對較小，所以在驗證某個基因與疾病的關系時很難得到統(tǒng)計學差異；也有可能與樣本量不足或樣本量所含信息量不足有關。此外，還有環(huán)境因素的影響。所以，下一步繼續(xù)擴大樣本量，并且針對多個基因位點進行聯(lián)合分析，并充分考慮環(huán)境因素的影響，才能進一步明確腦出血的遺傳學病因。

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TheanalysisofADD1geners4963polymorphismsbetweenHanzuandHuizupopulationswithcerebralhemorrhageinGansu

FanHongyan*,SiJianghua,PengXiaolan,etal.

*DepartmentofGerontology,TheFirstPeople’sHospitalofLanzhouCity,Lanzhou730050

ObjectiveTo investigate the genetic polymorphisms in the ADD1 gene rs4963 (C/G) polymorphisms in patients with cerebral hemorrhage(CH) from Han nationality and Hui minority populations in Gansu province,China.MethodsA total of 352 subjects (176 Hanzu and 176 Huizu patients)were collected from Gansu residents.The DNA was extracted by blood genomic DNA extraction kit,and the tag SNP rs4963 polymorphisms of ADD1 gene was detected by Tm -shift genotyping method for all subjects.ResultsThe results showed the genotype and allele frequency of rs4963 were not significantly different between Hanzu and Huizu CH patients(P>0.05).The stratification analysis of gender indicated that the genotype and allele frequency of rs4963 were not significantly different between Hanzu and Huizu CH patients(P>0.05).ConclusionThe genetic polymorphisms in ADD1 gene rs4963 were not significantly different between Hanzu and Huizu CH patients in Gansu Province,China.

Cerebral hemorrhage ADD1 gene Gansu Hanzu Huizu

R743.34

A

1007-0478(2017)05-0436-03

10.3969/j.issn.1007-0478.2017.05.013

(2016-12-30收稿)