腦血疏口服液對大鼠腦缺血再灌注損傷后血腦屏障的影響

蔣鋒 袁婕 崔小麗 王曉輝 程仙送 王莉 山媛

710061 西安，陜西省人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)一科

腦血疏口服液對大鼠腦缺血再灌注損傷后血腦屏障的影響

蔣鋒 袁婕 崔小麗 王曉輝 程仙送 王莉 山媛

目的探討腦血疏口服液對大鼠腦缺血再灌注損傷后血腦屏障的影響。方法將120只SD大鼠隨機分為3組：假手術(shù)組、對照組，腦血疏組；采用線栓法建立大鼠左側(cè)大腦中動脈閉塞再灌注模型，缺血2 h后拔出線栓，恢復(fù)灌注24 h；采用Longa FZ 5級評分法進行大鼠神經(jīng)功能缺損評分；TTC染色計算腦梗死體積百分比；運用干-濕重法測腦含水率； 通過伊文思藍(lán)( EB) 含量反映血腦屏障的損傷程度；免疫組化檢測基質(zhì)金屬蛋白酶-9(MMP-9)的表達(dá)水平。結(jié)果(1)假手術(shù)組大鼠在神經(jīng)功能缺損評分、腦梗死體積、腦含水率均低于對照組(P<0.01)；腦組織中EB含量和MMP-9表達(dá)水平較對照組低(P<0.01)；(2)腦血疏組大鼠的神經(jīng)功能缺損評分較低、腦梗死體積較小，腦水腫程度較輕；EB含量和MMP-9表達(dá)水平均較對照組明顯減少(P<0.01)。結(jié)論腦血疏口服液對大鼠腦缺血再灌注損傷后血腦屏障具有保護作用，其機制可能是通過抑制MMP-9的表達(dá)。

腦缺血再灌注損傷 腦血疏口服液 血腦屏障 基質(zhì)金屬蛋白酶-9

腦缺血再灌注損傷指腦組織缺血一定時間后再恢復(fù)血液灌注，腦組織細(xì)胞損傷反而進一步加重。血腦屏障的破壞是引起缺血再灌注損傷的重要原因，可導(dǎo)致腦水腫、腦出血等，目前認(rèn)為存在多種因素，包括自由基的損傷、鈣離子超載、炎性浸潤等機制[1-3]?；|(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinasess,MMP)的激活是引起腦缺血再灌注損傷和血腦屏障受損的重要機制之一，主要包括MMP-9和MMP-2的表達(dá)，在腦缺血再灌注早期及時抑制MMP的表達(dá)，對減少血腦屏障的損害至關(guān)重要。腦血疏口服液是我國中醫(yī)研究院研發(fā)的國家級中藥新藥(國藥準(zhǔn)字Z20070059)，由黃芪、水蛭、石菖蒲、牛膝、牡丹皮、大黃、川芎組成，具有益氣、活血、化瘀的功效[4]。本研究通過建立大鼠局灶性腦缺血再灌注模型，探討腦血疏口服液對血腦屏障的影響及檢測MMP-9的表達(dá)水平。

1 資料與方法

1.1 動物分組及給藥方式

采用健康雄性SD大鼠120只，體重250～300 g (由西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院動物中心提供)，晝夜循環(huán)光照，自由食水；適應(yīng)性飼養(yǎng)3 d后隨機分為3組，每組各40只：假手術(shù)組、對照組、腦血疏組。在動物模型建立前7 d開始腦血疏組每日灌服腦血疏口服液，每1次/8 h(1 mL/kg)，其余2組給予等量鹽水灌服。

1.2 動物模型制作

大腦中動脈閉塞再灌注(MCAO/R)模型制作采用改良的Longa法，即解剖分離暴露頸部血管，采用線栓法短時間栓塞左側(cè)大腦中動脈，2 h后拔出栓線，恢復(fù)缺血腦區(qū)的血液灌注24 h，建立MCAO/R模型。假手術(shù)組只解剖分離暴露頸部血管，不插入栓線。

1.3 大鼠神經(jīng)神經(jīng)功能缺損評分

參考Longa FZ 5級評分法對大鼠神經(jīng)功能缺損癥狀進行評分，0分：無神經(jīng)功能缺損癥狀；1分：提尾時對側(cè)前肢不能完全伸直；2分：向病灶對側(cè)轉(zhuǎn)圈征象；3分：向病灶對側(cè)傾倒；4分：不能自發(fā)行走及意識喪失。

1.4 TTC染色、腦梗死體積計算

每組隨機選10只大鼠，10%水合氯醛深度麻醉后斷頭處死，完整取出鼠腦，將腦組織切片，行TTC染色，后將腦片轉(zhuǎn)至100 g/L甲醛液中，冰箱冷藏固定24 h；取出后數(shù)碼相機照相，將染色輸入計算機，利用圖像處理軟件Image-Pro Plus 6.0分別計算出各個腦片缺血側(cè)的總體積和梗死區(qū)域的體積，再求出梗死區(qū)域占大腦半球總體積的百分比作為腦梗死體積并記錄。

1.5 腦組織含水量測定

采用干濕重法測定腦組織含水率，每組10只大鼠麻醉斷頭取腦，分離出缺血側(cè)大腦組織，電子天平稱濕重后放100 ℃烤箱烤至恒重。腦組織含水量=(濕重-干重)/濕重×100%。

1.6 血腦屏障通透性檢測

采用伊文思藍(lán)(EB)追蹤法評估血腦屏障損傷通透性。每組選10只大鼠，在處死前經(jīng)大鼠尾靜脈注2%的EB(4 mL/kg)，大鼠皮膚、球結(jié)膜等變藍(lán)表示注入成功；經(jīng)心臟灌注0.9%的肝素生理鹽水100 mL，快速斷頭取腦，按1 mL/100 mg腦組織加入甲酰胺溶液中，64 ℃恒溫箱中孵育24 h，1000 r/mim離心5 min，測630 nm 處的光密度值。

1.7 免疫組化檢測MMP-9表達(dá)水平

每組隨機選10只大鼠，10%的水合氯醛腹腔注射麻醉，迅速剪開胸腔，暴露心臟，經(jīng)升主動脈插管后先用200 mL的生理鹽水快速沖洗，然后用4 ℃4%多聚甲醛500 mL(先快后慢)繼續(xù)灌注內(nèi)固定至少1.5 h；斷頭取腦，4%多聚甲醛固定，包埋成蠟片，進行免疫組化染色后每只動物隨機選取3張腦片，單只組織切片隨機選取5個不重復(fù)視野，在400倍鏡下觀察腦組織中MMP-9陽性細(xì)胞數(shù)。

1.8 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠神經(jīng)神經(jīng)功能缺損評分

大鼠處死時間點前評分，除假手術(shù)組，其他2組均出現(xiàn)了不同程度的神經(jīng)功能缺損癥狀。腦血疏組大鼠神經(jīng)功能缺損評分均低于對照組(P<0.01)(表1)。

表1 各組大鼠神經(jīng)功能缺損評分,分)

注：與假手術(shù)組比較，#P<0.01；與對照組比較，*P<0.01

2.2 各組大鼠腦梗死體積

由TTC染色可見，假手術(shù)組腦片全部呈紅色，對照組和腦血疏組大鼠缺血側(cè)大腦半球可見明顯的白色梗死灶，且腦血疏組梗死體積明顯小于對照組(P<0.01)(表2，圖1)。

2.3 各組大鼠腦組織含水量比較

對照組和腦血疏組腦組織含水量較假手術(shù)組明顯增多(P<0.01)；與對照組比較，腦血疏組的腦組織含水量明顯減少(P<0.01)(表3)。

表2 各組大鼠腦梗死體積,%)

注：與假手術(shù)組比較，#P<0.01；與對照組比較，*P<0.01

圖1 各組大鼠腦梗死病灶(TTC染色)

2.4 各組大鼠血腦屏障通透性比較

與假手術(shù)組比較，對照組的血腦屏障通透性明顯增高(P<0.01)，而腦血疏組的血腦屏障通透性較對照組顯著降低(P<0.01)(表3)。

2.5 各組大鼠腦組織中MMP-9表達(dá)水平的比較

在假手術(shù)中組腦組織中可見很少數(shù)MMP-9陽性細(xì)胞表達(dá)，而對照組和腦血疏組表達(dá)明顯增多(P<0.01)，腦血疏組陽性細(xì)胞數(shù)較對照組明顯減少(P<0.01)(表3)。

表3 各組大鼠腦組織中含水量、EB含量、MMP-9陽性細(xì)胞數(shù))

注：與假手術(shù)組比較，#P<0.01；與對照組比較，*P<0.01

3 討 論

腦卒中具有較高發(fā)病率、致殘率、病死率等特點。腦卒中分為缺血性腦卒中和出血性腦卒中，其中缺血性腦卒中約占總?cè)藬?shù)的80%[5]，主要由于局部血流供應(yīng)障礙，導(dǎo)致腦組織缺血缺氧，出現(xiàn)細(xì)胞毒性水腫，進而血管源性水腫，最后導(dǎo)致腦組織壞死，如及時開通閉塞的血管可挽救部分缺血半暗帶。改善缺血腦組織的血供為治療重點，但缺血腦組織再灌注后引起的缺血再灌注損傷常為治療的難點，減輕缺血再灌注損傷程度直接影響患者臨床癥狀及預(yù)后的改善。導(dǎo)致缺血再灌注的損傷機制復(fù)雜，存在多種因素[6-7]。血腦屏障(BBB)存在于腦組織與和血液之間，在維持腦組織內(nèi)環(huán)境平衡及保障腦細(xì)胞發(fā)揮正常功能中至關(guān)重要。目前大量研究證實，腦缺血再灌注后血腦屏障遭到嚴(yán)重?fù)p害，致使其通透性增加，大量的有害物進入腦組織，引起腦組織內(nèi)環(huán)境紊亂，導(dǎo)致腦水腫，加重腦細(xì)胞的損傷[8]。MMP-9是一種鋅依賴蛋白水解酶，可以降解多種細(xì)胞外基質(zhì)成份，MMP-9的激活可引起血腦屏障的損害，引起顱內(nèi)滲透壓平衡改變，導(dǎo)致腦水腫，它還可促進炎性因子的釋放，進一步加重腦損害[9]。有研究認(rèn)為，腦缺血再灌注損傷是由于中性粒細(xì)胞高度表達(dá)了MMP-9以及髓過氧化物酶(MPO)，產(chǎn)生大量氧自由基，破壞了細(xì)胞膜，而繼發(fā)腦水腫[10]。通常在腦缺血后2 h MMP-9的表達(dá)增強，在48h到達(dá)高峰，后逐漸恢復(fù)至正常水平[11]，所以常將MMP-9的表達(dá)水平作為評價血腦屏障早期損害程度的檢測指標(biāo)[12]。有研究發(fā)現(xiàn)，將大鼠的MMP-9的基因敲掉后可明顯減輕血腦屏障損害和腦水腫程度，有學(xué)者認(rèn)為MMP-9阻斷劑可能對早期腦水腫進行預(yù)防和治療[13]。本研究發(fā)現(xiàn)，假手術(shù)組僅有少量MMP-9表達(dá)，血腦屏障未受到破壞，無梗死灶形成和神經(jīng)功能缺損癥狀，而對照組的MMP-9的表達(dá)顯著增多，血腦屏障的通透性增加，腦水腫程度加重，腦梗死體積和神經(jīng)功能缺損癥狀明顯，也說明了在腦缺血再灌注早期MMP-9表達(dá)增強，血腦屏障受到嚴(yán)重?fù)p害。

在治療腦缺血再灌注損傷時減輕血腦屏障受損程度是藥物選擇的關(guān)鍵。腦血疏口服液中多種中藥成分具有改善腦微循環(huán)障礙，延長血栓形成時間及出血和凝血時間，抑制血小板聚集，改善腦血管痙攣、抗自由基、減輕腦水腫及保護腦細(xì)胞等多種作用。目前臨床主要應(yīng)用于腦出血的早期治療中，療效也得到證實。結(jié)合腦血疏口服液中藥組成及功效，發(fā)現(xiàn)其在急性腦梗死中的治療作用，但具體機制尚不清楚。艾鑫等[14]報道了腦血疏口服液通過抗自由基損傷對大鼠急性腦梗死具有神經(jīng)保護作用。臨床也發(fā)現(xiàn)其聯(lián)合依達(dá)拉奉治療急性期腦梗死也取得良好的效果[15]以及可減輕急性腦梗死患者炎癥反應(yīng)而改善神經(jīng)功能缺損癥狀[16]。本研究結(jié)果顯示，與對照組比較，腦血疏組大鼠的神經(jīng)功能缺損癥狀較輕，梗死體積較小，血腦屏障損害程度及腦水腫減輕，MMP-9的表達(dá)顯著減少，說明腦血疏口服液可抑制腦缺血時MMP-9的表達(dá)，降低血腦屏障通透性，減輕腦水腫。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)腦血疏口服液在腦缺血中具有神經(jīng)保護作用，可用于急性腦梗死的臨床治療，為臨床用藥提供依據(jù)。

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TheeffectsofNaoxueshuoralliquidonblood-brainbarrieraftercerebralischemia-reperfusioninjuryinrats

JiangFeng,YuanJie,CuiXiaoli,etal.

NeurologyDepartmentⅠofShanxiProvincePeople’sHospital,xi’an710061

ObjectiveTo investigate the effects of Naoxuechu oral liquid on blood - brain barrier after cerebral ischemia-reperfusion injury in rats.Methods120 SD rats were randomly divided among three groups:sham-operation group,control group and Naoxueshu group.The middle cerebral artery occlusion reperfusion model was established by thread embolism method.After 2 hours of ischemia,the suture was pulled out and the perfusion was resumed for 24h.The neurological deficit was assessed by Longa FZ 5-score while TTC staining was utilized to calculate the percentage of cerebral infarct volume.The dry-wet weight method was used to measure the water content of the brain and the level of the blood-brain barrier was reflected by Evans blue (EB) content.The expression of matrix metalloproteinase-9 (MMP-9) was considered by immunohistochemistry.ResultsCompared with the control group,the neurological deficit score,cerebral infarct volume and cerebral edema were significantly lower in the sham-operation group (P<0.01),and the EB content and MMP-9 expression in the brain tissue were less.The difference was significant (P<0.01).Compared with the control group,the scores of neurological deficits,cerebral infarction volume and cerebral edema were lower in Naoxueshu group.The content of EB and the expression of MMP-9 was significantly lower than those in the control group.There was considerable statistical difference (P<0.01).ConclusionNaoxueshu oral Liquid has the protective effect on the blood-brain barrier after cerebral ischemia reperfusion injury in rats.The mechanism might be through inhibition of MMP-9 expression.

Cerebral ischemia Naoxueshu oral liquid Blood-brain barrier MMP-9

R743.33

A

1007-0478(2017)05-0423-04

10.3969/j.issn.1007-0478.2017.05.010

(2016-12-07收稿)