sEHi對頸動脈狹窄患者內(nèi)皮祖細(xì)胞增殖及PI3K/Akt信號通路的影響

嚴(yán)靜 陳俊 艾志兵 周崗 丁立 何國厚

442000 湖北省十堰市湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬太和醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科

sEHi對頸動脈狹窄患者內(nèi)皮祖細(xì)胞增殖及PI3K/Akt信號通路的影響

嚴(yán)靜 陳俊 艾志兵 周崗 丁立 何國厚

目的探討可溶性環(huán)氧化物水解酶抑制劑 (sEHi) AUDA 調(diào)控頸動脈狹窄(CS)患者外周血內(nèi)皮祖細(xì)胞(EPCs)增殖的分子機(jī)制。方法從CS患者外周血分離、培養(yǎng)內(nèi)皮祖細(xì)胞，收集培養(yǎng)至第7 d的細(xì)胞，分為未處理組、AUDA組、PI3K抑制劑(LY294002)組和AUDA+ LY294002組，取無頸動脈狹窄患者的EPCs作為對照組，MTT法檢測EPCs的增殖能力，Western blot法檢測EPCs Akt磷酸化的水平。結(jié)果對照組EPCs增殖能力較未處理組增強(qiáng)，AUDA組較未處理組、AUDA+ LY294002組、LY294002組EPCs增殖能力增強(qiáng)，未處理組、AUDA+ LY294002組較LY294002組內(nèi)皮祖細(xì)胞增殖能力增強(qiáng)；Western blot結(jié)果顯示AUDA可以促進(jìn)EPCs P-Akt蛋白的表達(dá)，而LY294002可以抑制上述作用。結(jié)論AUDA可能通過活化PI3K /Akt信號通路來促進(jìn)內(nèi)皮祖細(xì)胞的增殖。

可溶性環(huán)氧化物水解酶抑制劑 頸動脈狹窄 內(nèi)皮祖細(xì)胞 PI3K/Akt信號通路

頸動脈狹窄是缺血性腦病的常見病因之一，其中嚴(yán)重狹窄還可能因血流動力學(xué)機(jī)制而引起低灌注性腦卒中。頸動脈狹窄的主要發(fā)病機(jī)理是動脈粥樣硬化，現(xiàn)逐漸明確動脈壁內(nèi)皮損傷是動脈粥樣硬化的始動因素之一，因此受損血管內(nèi)皮細(xì)胞的修復(fù)以及再生是延緩動脈粥樣硬化的重要治療靶點(diǎn)[1]。內(nèi)皮祖細(xì)胞(endothelial progenitor cells,EPCs)是一類起源于骨髓、循環(huán)至外周血，能夠分化增殖為成熟血管內(nèi)皮細(xì)胞的祖細(xì)胞。EPCs參與血管新生及損傷后內(nèi)皮修復(fù)等過程，在維持內(nèi)皮環(huán)境穩(wěn)定中起著重要作用。循環(huán)EPCs可作為儲存庫，隨時替換功能失調(diào)的內(nèi)皮細(xì)胞，從而在動脈粥樣硬化形成的最早期階段起保護(hù)作用[2]。已有研究表明，循環(huán)EPCs水平與心血管風(fēng)險(xiǎn)因子總數(shù)呈負(fù)相關(guān)，在一定程度上可以預(yù)測心腦血管不良事件發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)[3-5]。

環(huán)氧二十碳三烯酸( epoxyeicosatrienoic acids，EETs) 是由細(xì)胞色素 P450代謝花生四烯酸衍生的脂質(zhì)化合物，是一類近幾年備受重視的具有強(qiáng)大生物活性的內(nèi)生性脂質(zhì)環(huán)氧化合物，其中EETs改善血管功能的機(jī)制主要包括促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞增殖、調(diào)節(jié)血管緊張度和促進(jìn)血管生成等[6-8]。但是EETs在細(xì)胞內(nèi)半衰期短，經(jīng)可溶性環(huán)氧化物水解酶( soluble epoxide hydrolase，sEH)催化成弱生物活性的二羥基衍生物。通過可溶性環(huán)氧化物水解酶抑制劑( soluble epoxidehydrolase inhibition，sEHi) 是增加細(xì)胞內(nèi)EETs濃度和效用的有效途徑，AUDA[12-( 3-adamantan-1-y1-ureido ) -dodecanoic acid]是新合成的 sEHi[9]。Li等發(fā)現(xiàn)EETs通過誘導(dǎo)PI3K/Akt依賴性轉(zhuǎn)錄程序來促進(jìn)造血干細(xì)胞的增殖[10]。許丹焰學(xué)者團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)sEHi通過PI3K/Akt信號通路正向調(diào)節(jié)冠心病患者EPCs的黏附及成血管功能[11-13]。PI3K/Akt信號通路同樣是調(diào)控EPCs增殖與凋亡等生理過程的最重要的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路之一[2]，因而本研究主要探討AUDA對EPCs增殖的影響及其分子機(jī)制。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選擇2015～2016年間在湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬太和醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科住院經(jīng)全腦血管造影檢查確診有頸動脈狹窄的患者40例為頸動脈狹窄組 ( CS 組)，以同期在本院年齡、性別匹配的無頸動脈狹窄者30例作為對照組。有下列病史者予以排除:急、慢性肝腎疾病、慢性消耗性疾病及感染性疾病、冠心病、心臟瓣膜病、惡性腫瘤、外周血管病、自身免疫性疾病、血液系統(tǒng)疾病、重大手術(shù)或嚴(yán)重外傷等。

1.2 材料與試劑

EGM-2培養(yǎng)基購自Lonza公司，人纖維連接蛋白購自Millipore公司，胰蛋白酶和胎牛血清購自Gibco公司，LY294002 MTT試劑盒、AUDA、FITC標(biāo)記的荊豆凝集素I(FITC-UEA-I)購自Sigma公司，Dil標(biāo)記的乙?；兔芏戎鞍?Dil-Ac-LDL)購自Molecular Probe公司，F(xiàn)ITC-CD34、PE-CD133購自eBioscience公司，Akt、P-Akt抗體購自CST公司，β-Actin抗體購自Abmart公司，人淋巴細(xì)胞分離液購自天津?yàn)蠊尽?/p>

1.3 EPCs細(xì)胞分離、培養(yǎng)和鑒定

所有入組對象行全腦血管造影術(shù)前在嚴(yán)格無菌條件下經(jīng)鞘管從股動脈抽取動脈血30 mL，肝素抗凝，采用密度梯度離心法分離單個核細(xì)胞。人纖維連接蛋白預(yù)包被24孔細(xì)胞培養(yǎng)板，將單個核細(xì)胞接種在培養(yǎng)板中，置37 ℃，5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清的EGM-2完全培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞至第4 d換液，以后隔日換液培養(yǎng)至第7 d，細(xì)胞與FITC-UEA-I和Dil-Ac-LDL孵育后于激光共聚焦顯微鏡下進(jìn)行鑒定，F(xiàn)ITC-UEA-I和Dil-AcLDL雙染色陽性細(xì)胞為早期EPCs。用流式細(xì)胞儀鑒定細(xì)胞表型CD34、CD133 的表達(dá)。

1.4 EPCs實(shí)驗(yàn)分組

實(shí)驗(yàn)分為對照組、頸動脈狹窄組(未處理組、AUDA組、AUDA+LY294002組、LY294002組)，其中AUDA為10 μmol/L、LY294002為10 μmol/L。

1.5 AUDA對EPCs增殖功能的影響

取出培養(yǎng)7 d的內(nèi)皮祖細(xì)胞，制成單細(xì)胞懸液，將細(xì)胞密度調(diào)整至1×104個/mL；按照每孔100 μL(1×103個)接種到包被有人纖維連接蛋白96孔培養(yǎng)板培養(yǎng)8 h，加AUDA干預(yù)24 h，LY294002在加AUDA前作用2 h，每一標(biāo)本做4個復(fù)孔，設(shè)空白對照，將96孔培養(yǎng)板移入37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)24 h后每孔加入MTT溶液(5 mg/mL)10 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，每孔加入Formanzan溶解液培養(yǎng)4 h，用酶標(biāo)儀于490 nm處檢測OD值。

1.6 Western Blot檢測相關(guān)蛋白表達(dá)水平

將ECPs以2×105個/mL接種于6孔板，當(dāng)細(xì)胞融合達(dá)65%時加入藥物干預(yù)，48 h后收集細(xì)胞并提取蛋白，BCA法進(jìn)行蛋白定量；經(jīng)過電泳、轉(zhuǎn)膜后取下硝酸纖維膜，脫脂牛奶封閉1 h后以特異性一抗孵育，4 ℃過夜，洗膜后二抗室溫孵育1 h，進(jìn)行化學(xué)發(fā)光反應(yīng)并顯影、定影。將圖片掃描后用 Image J 圖像分析軟件進(jìn)行蛋白灰度分析。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 研究對象臨床資料比較

2組研究對象的年齡、性別、吸煙、飲酒、高血壓病史、甘油三酯、總膽固醇、高密度脂蛋白、低密度脂蛋白水平比較無明顯差異(P>0.05)(表1)。

表1 2組研究對象一般情況比較

2.2 外周血EPCs 光鏡下形態(tài)學(xué)特征

剛分離的外周血單個核細(xì)胞呈圓形，折光好，懸浮于培養(yǎng)液中(圖1);培養(yǎng)至第4 d，可見細(xì)胞貼壁長，由圓形逐漸變?yōu)槎趟笮?圖1); 培養(yǎng)至第7 d可見大量長梭形細(xì)胞，并呈“集落”樣生長，即早期 EPCs(圖1)。

2.3 雙染法鑒定EPCs

從外周血分離單個核細(xì)胞培養(yǎng)至第7 d，貼壁細(xì)胞與FITC-UEA-I和Dil-Ac-LDL孵育后使用激光共聚焦顯微鏡對EPCs 進(jìn)行鑒定，結(jié)合FITC-UEA-I的細(xì)胞發(fā)綠色熒光，攝取Dil-Ac-LDL的細(xì)胞發(fā)紅色熒光，雙染色陽性的細(xì)胞為在分化EPCs(圖2)。

2.4 流式細(xì)胞儀鑒定EPCs 表型

外周血EPCs同時表達(dá)特異性抗原 CD34、CD133，其陽性率分別為 78.0、76.9% (圖3)。

圖1 光鏡下EPCs形態(tài)學(xué)特征(×200倍) A為剛分離出來的單個核細(xì)胞；B為培養(yǎng)4d的EPCs；C為培養(yǎng)7d的EPCs

圖2 激光共聚焦鏡下的EPCs形態(tài)學(xué)特征(×200倍) A為DAPI染色；B為FITC?UEA?1染色；C為Dil?Ac?LDL雙染色

圖3 EPCs流式細(xì)胞術(shù)檢測

2.5 AUDA及LY294002作用后對EPCs增殖功能的影響

與對照組相比，未處理組CS患者EPCs吸光度值較低(P<0.05)。與未處理組相比，AUDA單獨(dú)給藥后可以增加吸光度值(P<0.05)，預(yù)先使用LY294002作用2 h后可明顯抑制AUDA的上述作用(P<0.05)，未處理組與AUDA+LY294002組OD值未見明顯差異(P>0.05)，單獨(dú)使用LY294002后EPCs吸光度值最低(圖4)。

圖4 AUDA及LY294002作用后對內(nèi)皮祖細(xì)胞增殖功能的影響

2.6 AUDA對內(nèi)皮祖細(xì)胞P-Akt表達(dá)的影響

與對照組相比,未處理組CS患者早期 EPCs Akt的磷酸化水平下降(P<0.05)。與未處理組相比，AUDA作用后EPCs Akt的磷酸化水平升高(P<0.05)，預(yù)先使用LY294002作用EPCs 2 h后AUDA對 EPCs Akt磷酸化的促進(jìn)作用消失(P<0.05)，未處理組與AUDA+LY294002組Akt磷酸化程度未見明顯差異(P>0.05)(圖5)。

3 討 論

腦血管病是我國致死、致殘率較高的疾病，其中頸動脈狹窄是缺血性腦血管病的常見發(fā)病原因，但是目前治療頸動脈狹窄的方法在適應(yīng)癥及治療效果上均有一定的局限性[14]。近年來，EPCs因其具有參與動脈內(nèi)皮損傷后修復(fù)以及促進(jìn)成人新生血管的生成能力，而成為眾多學(xué)者研究的熱點(diǎn)。根據(jù)體外培養(yǎng)時間的長短可分為早期和晚期EPCs，培養(yǎng)5～7 d的是早期EPCs，培養(yǎng)2～3周為晚期EPCs。EPCs參與血管生成的機(jī)制包括以旁分泌及分化為成熟內(nèi)皮細(xì)胞的方式參與血管的動態(tài)維持和生理性重建[15]。諸多研究表明EPCs在延緩動脈粥樣硬化的形成、發(fā)展以及促進(jìn)梗死周圍區(qū)域新生血管的生成過程中發(fā)揮重要作用[16]。Bitterli等學(xué)者對外周血管疾病的研究中發(fā)現(xiàn)EPCs數(shù)量和功能在內(nèi)皮功能完整性的維護(hù)中占據(jù)中心地位，并直接影響外周動脈血管中的動脈粥樣硬化的程度[17-18]。在對SD大鼠大腦中動脈閉塞模型的研究中發(fā)現(xiàn)經(jīng)頸內(nèi)動脈輸入自體外周血源性EPCs通過增加梗死區(qū)新生毛細(xì)血管的密度來減少腦梗死的面積和神經(jīng)功能缺損的程度[19]。增加EPCs的數(shù)目是減少血管疾病和功能失調(diào)的重要機(jī)制之一，因此目前研究主要側(cè)重于調(diào)節(jié)內(nèi)皮祖細(xì)胞功能、增殖及凋亡的途徑。有研究表明腫瘤壞死因子、脂多糖通過下調(diào)PI3K/Akt 信號通路來減少EPCs的數(shù)量；雌激素、他汀類藥物則通過上調(diào)PI3K/Akt 信號通路來促進(jìn)EPCs的增殖[2]。

圖5 Westernblot檢測P?Akt/Akt表達(dá)水平 A為對照組；B為未處理組；C為AUDA+LY294002組；D為AUDA組；E為LY294002組

PI3K/Akt 信號通路是細(xì)胞內(nèi)重要的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路之一，可以通過影響下游效應(yīng)分子的活化狀態(tài)，參與細(xì)胞內(nèi)很多重要的生物學(xué)過程的調(diào)控，發(fā)揮著抑制細(xì)胞凋亡、促進(jìn)增殖的作用。Akt是 PI3K 信號傳導(dǎo)通路中一個重要的下游靶激酶。PI3K 活化產(chǎn)生 PIP3 使 Akt 轉(zhuǎn)位到細(xì)胞膜，通過催化Akt的Ser473 和(或)Thr308 位點(diǎn)磷酸化而激活，引起信號通路的級聯(lián)反應(yīng)[20]。

AUDA作為新一代的sEHi能夠有效地抑制sEH 將EETs分解為低活性的二羥基衍生物[8]。EETs保護(hù)心腦血管作用的機(jī)制包括降低血壓、促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞增殖、促進(jìn)血管生成、減少炎癥反應(yīng)和維持血漿高密度脂蛋白的濃度等[21-22]。其中促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞增殖的機(jī)制涉及到促進(jìn)PI3K/AKt依賴的叉頭轉(zhuǎn)錄因子磷酸化，從而下調(diào)下游促凋亡蛋白的表達(dá)[23]。既往研究表明在動脈粥樣硬化患者中ox-LDL通過減少EPCs AKt的磷酸化、eNOS蛋白的表達(dá)以及促進(jìn)LOX-1蛋白的表達(dá)來使EPCs的功能減弱、數(shù)量減少[2]。本研究結(jié)果顯示CS患者未處理組外周血早期 EPCs較對照組外周血早期EPCs增殖能力減弱，而AUDA單獨(dú)給藥后可以使CS患者EPCs增殖能力增強(qiáng)，但是在給予PI3K抑制劑LY294002以后未再觀察到AUDA對EPCs增殖能力的促進(jìn)作用。通過Western blot的實(shí)驗(yàn)結(jié)果得到未處理組EPCs表達(dá)的Akt的磷酸化水平較對照組低，AUDA組Akt的磷酸化水平升高，同樣在給予LY294002以后抵消了AUDA的促Akt磷酸化作用。

綜上所述，本研究認(rèn)為AUDA可能部分通過活化PI3K /AKT信號通路，促進(jìn)內(nèi)皮祖細(xì)胞增殖，但是否有其他信號通路參與以及 Akt激活后的下游信號通路的分子機(jī)制,還需進(jìn)一步研究。

[1] Alagoz Neslihan,Acar Atlgan,Acar Türkan,et al.Relationship between carotid stenosis and infarct volume in ischemic stroke patients[J].Med Sci Monit,2016,22:4954-4959.

[2] Du FY,Zhou J,Gong R,et al.Endothelial progenitor cells in atherosclerosis[J].Front Biosci (Landmark Ed),2012,17:2327-2349.

[3] He GH,Zhang HM,Zhang XD,et al.The comparison of EPC count and function in the situation of vascular repair at early and late stage[J].J Thromb Thrombolysis,2013,36(3):271-276.

[4] Yoder MC.Human endothelial progenitor cells[J].Cold Spring Harb Perspect Med,2012,2(7):92-96.

[5] Aragona Oriana,Imbalzano Egidio,Mamone Federica,et al.Endothelial progenitor cells for diagnosis and prognosis in cardiovascular disease[J].Stem Cells Int,2016(9):8043792.

[6] Panigrahy Dipak,Kalish T,Huang Sui,et al.Epoxyeicosanoids promote organ and tissue regeneration[J].Proc Natl Acad Sci U S A,2013,110(33):13528-13533.

[7] Qiu Hong,Li Ning,Liu Yan,et al.Soluble epoxide hydrolase inhibitors and heart failure[J].Cardiovasc Ther,2011,29(2):99-111.

[8] Zhang Juan,Liu Sheng,Lu Hua.Therapeutic effects of the soluble epoxide hydrolase (sEH) inhibitor AUDA on atherosclerotic diseases[J].Pharmazie,2015,70(1):24-28.

[9] Rezaee Zavareh Elham,Hedayati Mahdi,Hoghooghi Rad Laleh,et al.Design,synthesis and biological evaluation of 4-benzamidobenzoic Acid hydrazide derivatives as novel soluble epoxide hydrolase inhibitors[J].Iranian Journal of Pharmaceutical Research,2014,13(Suppl):51-59.

[10] Li Pulin,Lahvic L,Binder Vera,et al.Epoxyeicosatrienoic acids enhance embryonic haematopoiesis and adult marrow engraftment[J].Nature,2015,523(7561):468-471.

[11] Xu DY,Chen C,Jiang Y,et al.Effect of soluble epoxide hydrolase inhibitor on the function of endothelial progenitor cells in patients with coronary heart disease [J].Zhong nan Da Xue Xue Bao Yi Xue ban,2010,35(7):685-692.

[12] Xu DY,Davis BB,Wang ZH,et al.A potent soluble epoxide hydrolase inhibitor,t-AUCB,acts through PPARγ to modulate the function of endothelial progenitor cells from patients with acute myocardial infarction[J].Int J Cardiol,2013,167(4):1298-1304.

[13] Deng min,Li ping,Xu yan,et al.Aerobic exercise-based rehabilitation affects the activities of progenitor endothelial cells through EETs pathway[J].Med Hypotheses,2015,85(6):1037-1038.

[14] Demaerschalk M,Howard George,Brott G.Carotid stenosis:to revascularize,or not to revascularize:that is the question[J].Neurology,2012,78(4):294.

[15] Minhajat Rahmawati,Nilasari Dina,Bakri Syakib.The role of endothelial progenitor cell in cardiovascular disease risk factors[J].Acta Med Indones,2015,47(4):340-347.

[16] Gong X,Shao L,Fu YM,et al.Effects of olmesartan on endothelial progenitor cell mobilization and function in carotid atherosclerosis[J].Med Sci Monit,2015,21:1189-1193.

[17] Bitterli Lukas,Afan Samuel,Bühler Stephan,et al.Endothelial progenitor cells as a biological marker of peripheral artery disease[J].Vasc Med,2016,21(1):3-11.

[18] Fadini Paolo,Coracina Anna,Baesso Ilenia,et al.Peripheral blood CD34+KDR+ endothelial progenitor cells are determinants of subclinical atherosclerosis in a middle-aged general population[J].Stroke,2006,37(9):2277-2282.

[19] Chen YL,Tsai TH,Wallace CG,et al.Intra-carotid arterial administration of autologous peripheral blood-derived endothelial progenitor cells improves acute ischemic stroke neurological outcomes in rats[J].Int J Cardiol,2015,201:668-683.

[20] Yu S,Cui Wei.Proliferation,survival and metabolism:the role of PI3K/AKT/mTOR signalling in pluripotency and cell fate determination[J].Development,2016,143(17):3050-3060.

[21] Roche Clothilde,Besnier Marie,Cassel Roméo,et al.Soluble epoxide hydrolase inhibition improves coronary endothelial function and prevents the development of cardiac alterations in obese insulin-resistant mice[J].Am J Physiol Heart Circ Physiol,2015,308(9):H1020-H1029.

[22] Shen Li,Peng Hongchun,Peng Ran,et al.Inhibition of soluble epoxide hydrolase in mice promotes reverse cholesterol transport and regression of atherosclerosis[J].Atherosclerosis,2015,239(2):557-565.

[23] Askari Ara,Thomson J,Edin L,et al.Roles of the epoxygenase CYP2J2 in the endothelium[J].Prostaglandins Other Lipid Mediat,2013,107:56-63.

TheeffectofsolubleepoxidehydrolaseinhibitoronproliferationandPI3K/Aktsignalingpathwayinendothelialprogenitorcellsfrompatientswithcarotidstenosis

YanJing,ChenJun,AiZhibing,etal.

DepartmentofNeurology,TaiheHospitalAffiliatedtoHubeiUniversityofMedicine,Shiyan442000

ObjectiveTo investigate the molecular mechanism of the soluble epoxide hydrolase inhibitor (sEHi) 12-(3-adamantan-1-y1-ureido)-dodecagon acid (AUDA) in regulating the proliferation of endothelial progenitor cells (EPCs) in patients with carotid artery stenosis (CS).MethodsEPCs were isolated and cultured from the peripheral blood of CS patients,cells were collected after 7 days of culture in vitro,and all of them were divided into Untreated group,AUDA group,PI3K inhibitor LY294002 group and AUDA+ LY294002 group.The proliferation of EPCs was determined by MTT,while the expression of phosphorylated Akt in EPCs was measured by Western blot.EPCs from people without carotid artery stenosis were also cultured as the controls.ResultsThe proliferation of EPCs was stronger in the AUDA group than that in the untreated group,LY294002 group and AUDA+ LY294002 group,and the proliferation of EPCs was stronger in the untreated group and AUDA+ LY294002 group than that in the LY294002 group.Moreover，AUDA treatment increased phosphorylation of Akt,LY294002 which also blocked these effects.ConclusionThe results of the present study suggested that AUDA promoted EPCs proliferation was related to the PI3K/Akt pathway.

Soluble epoxide hydrolase inhibitor Carotid Stenosis Endothelial progenitor cell PI3K /Akt signaling pathway

R543.5

A

1007-0478(2017)05-0402-05

10.3969/j.issn.1007-0478.2017.05.005

(2016-12-30收稿)