芬戈莫德調(diào)控小膠質(zhì)細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化對少突膠質(zhì)前體細(xì)胞的影響

李瑾 樊文慧 楊園 潘鄧記

·論 著·

國家自然科學(xué)基金項目(NSFC) 81571206資助

430030 武漢，華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科

芬戈莫德調(diào)控小膠質(zhì)細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化對少突膠質(zhì)前體細(xì)胞的影響

李瑾 樊文慧 楊園 潘鄧記

目的研究芬戈莫德(FTY720)對原代培養(yǎng)的小膠質(zhì)細(xì)胞表型的影響及干預(yù)后的小膠質(zhì)細(xì)胞對少突膠質(zhì)前體細(xì)胞分化成熟的影響。方法體外培養(yǎng)原代小膠質(zhì)細(xì)胞及少突膠質(zhì)前體細(xì)胞(OPCs)，采用RT-PCR法檢測FTY720干預(yù)后小膠質(zhì)細(xì)胞M1及M2型指標(biāo)的變化；ELISA法檢測小膠質(zhì)細(xì)胞上清TNF-α、TGF-β、IL-1β、IL-13分泌量的變化；將干預(yù)后的小膠質(zhì)細(xì)胞上清液加入純化后的少突膠質(zhì)前體細(xì)胞中采用Olig2與MBP共染免疫熒光染色方法觀察FTY720對少突膠質(zhì)前體細(xì)胞分化成熟的影響。結(jié)果向M2型轉(zhuǎn)化；FTY720干預(yù)后的小膠質(zhì)細(xì)胞促進(jìn)少突膠質(zhì)前體細(xì)胞的分化成熟。結(jié)論FTY720通過促進(jìn)小膠質(zhì)細(xì)胞向M2型轉(zhuǎn)化，從而促進(jìn)少突膠質(zhì)前體細(xì)胞的分化。

FTY720 小膠質(zhì)細(xì)胞 表型轉(zhuǎn)化 少突膠質(zhì)前體細(xì)胞

小膠質(zhì)細(xì)胞是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中定居的巨噬細(xì)胞，是對抗損傷的第一道防線[1-2]。小膠質(zhì)細(xì)胞在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中調(diào)節(jié)免疫和炎癥反應(yīng)。對各種微環(huán)境信號小膠質(zhì)細(xì)胞可以表達(dá)特定的功能反應(yīng)程序，存在兩種極化狀態(tài)[3-4]，即經(jīng)典(促炎，M1)型及替代(抗炎，M2)型, 參與組織的修復(fù)或損傷過程[5-7]。小膠質(zhì)細(xì)胞表型主要呈現(xiàn)為各種細(xì)胞表面受體的表達(dá)及特定功能的可溶性細(xì)胞因子等及釋放：在LPS和IFN-γ的刺激下小膠質(zhì)細(xì)胞可以極化M1型小膠質(zhì)細(xì)胞(促炎型、經(jīng)典激活型)，而在IL-4刺激下小膠質(zhì)細(xì)胞可以極化為M2型小膠質(zhì)細(xì)胞(抗炎型、替代激活型)。M1型小膠質(zhì)細(xì)胞可以分泌各種炎性因子如IL-1b,IL-6,TNF-a,CCL2,及 CXCL10，還可以分泌 ROS, NO和基質(zhì)金屬蛋白酶-9、基質(zhì)金屬蛋白酶-3[8-12]。M1型小膠質(zhì)細(xì)胞的功能是抗原提呈作用并殺傷細(xì)胞內(nèi)的病原體以維持環(huán)境穩(wěn)態(tài)[13]。M2型小膠質(zhì)細(xì)胞表現(xiàn)為Arginase-1,Ym1,IGF-1,CD206等表達(dá)水平增高，主要抑制炎癥反應(yīng)和發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用[14-15]。

芬戈莫德(Fingolimod,FTY720)作為一種口服的免疫抑制劑，被美國食品和藥物管理局批準(zhǔn)作為多發(fā)性硬化的一線治療藥物[16]；在多發(fā)性硬化動物模型中通過促進(jìn)少突膠質(zhì)細(xì)胞生長、成熟及髓鞘再生而發(fā)生保護(hù)作用[17]。最近研究表明，F(xiàn)TY720在腦血管疾病中也可以發(fā)揮抗炎和神經(jīng)保護(hù)作用[18-19]。本研究通過體外培養(yǎng)原代小膠質(zhì)細(xì)胞及少突膠質(zhì)前體細(xì)胞(OPCs)，探討FTY720對小膠質(zhì)細(xì)胞表型的調(diào)控，進(jìn)而觀察不同表型的小膠質(zhì)細(xì)胞對少突膠質(zhì)前體細(xì)胞分化成熟的影響，并探討FTY720發(fā)揮中樞神經(jīng)損傷后髓鞘修復(fù)的可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 出生0～3 d的SPF級C57乳鼠，從華中科技大學(xué)附屬同濟(jì)醫(yī)學(xué)院動物實驗中心獲得。

1.2 主要試劑 FTY720(美國Cayman生物公司)，LPS、T3(Sigma公司)，IL-4、IFN-γ，Human PDGF-AA，Mouse-FGF-Basic、Mouse-CNTF(Peorotech公司)，N2 supplement(100×)，B27supplement (50×)(GIBCO公司)，DMEM/F12細(xì)胞培養(yǎng)基，DMEM/F12高糖培養(yǎng)基(Hyclone公司)，胎牛血清(四季青公司)，多聚 L- 賴氨酸(PLL，Sigma 公司),兔抗小鼠Olig2多克隆抗體(Millipore 公司)，兔抗 Iba-1 單克隆抗體(wako 公司)，大鼠抗 MBP 單克隆抗體小鼠(Millipore 公司)，IL-1β，TNF-α，TGF-β ELISA檢測試劑盒(深圳達(dá)科為公司)，小鼠IL-13 ELISA檢測試劑盒購自(Abcam公司)，Trizol Reagent(Invitrogen 公司)，逆轉(zhuǎn)錄 kit、SYBR gene PCR Master Mix (TOYOBO公司)，引物GAPDH(武漢谷歌生物公司)。

1.3 Real-time PCR引物見表1

1.4 方法

1.4.1 混合膠質(zhì)細(xì)胞原代培養(yǎng) 根據(jù)文獻(xiàn)[24-25]方法改進(jìn)，原代培養(yǎng)小鼠小膠質(zhì)細(xì)胞及少突膠質(zhì)前體細(xì)胞。取出生0～3 d的C57乳鼠，在無菌條件下取出小鼠全腦，去腦膜和血管，PBS液沖洗后留大腦半球及中腦，保留胼胝體，放入預(yù)先已加入2 mL PBS液中，剪碎后加入2 mL 0.25%的胰酶，在37 ℃條件下消化15 min，用含20%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基終止消化，終止消化后用200目鋼絲篩網(wǎng)過濾細(xì)胞懸液，800 r/min 4 ℃離心過濾后的細(xì)胞懸液8 min，棄去上清后用含20%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基重懸沉淀的細(xì)胞，按照106密度將細(xì)胞懸液接種于T75細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，95% O2、5% CO2的37 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)，每3～4 d換液1次(更換為含20%胎牛血清DMEM/高糖培養(yǎng)基)，當(dāng)細(xì)胞100%匯合后進(jìn)行下面的分離純化步驟。

1.4.2 小膠質(zhì)細(xì)胞及少突膠質(zhì)前體細(xì)胞的分離純化 原代培養(yǎng)的混合膠質(zhì)細(xì)胞長滿后擰緊瓶蓋，放到恒溫水平搖床上振搖純化小膠質(zhì)細(xì)胞，37 ℃下250 r/min震搖1.5 h,取振搖后的細(xì)胞上清4 ℃ 800 r/min離心8 min,棄上清，用含20%胎牛血清的DMEM/高糖培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，接種于6孔培養(yǎng)板或鋪有蓋玻片(多聚賴氨酸包被)24孔板中，用于下游實驗。分離后的小膠質(zhì)細(xì)胞使用Iba1(1∶200)抗體進(jìn)行免疫熒光法檢測純度。按上述方式純化小膠質(zhì)細(xì)胞后更換培養(yǎng)基，繼續(xù)37 ℃恒溫?fù)u床振搖(180 r/min,18 h)，然后按照差速貼壁方法去除多余的星形膠質(zhì)細(xì)胞及小膠質(zhì)細(xì)胞，后將懸浮細(xì)胞800 r/min 4 ℃離心8 min,棄上清，用OPCs培養(yǎng)基重懸細(xì)胞沉淀，細(xì)胞按2×105密度接種于鋪有用多聚賴氨酸包被過的蓋玻片的24孔板中，分離后的OPCs細(xì)胞使用Olig2(1∶200)抗體進(jìn)行免疫熒光法檢測純度。純化3 d后的OPCs細(xì)胞更換為分化培養(yǎng)基及干預(yù)培養(yǎng)基，誘導(dǎo)分化3 d，收集細(xì)胞爬片用于免疫熒光染色。

表1 Real-time PCR引物

1.4.3 小膠質(zhì)細(xì)胞及少突膠質(zhì)前體細(xì)胞的干預(yù) (a)純化后的小膠質(zhì)細(xì)胞種植于6孔板中24 h后按如下分組進(jìn)行干預(yù)：未刺激組(M0組)，LPS+IFNγ組(M1組)，LPS plus IFNγ+FTY720組,IL-4組(M2組)，干預(yù)24 h后收集細(xì)胞及細(xì)胞上清用于下游實驗;(b)純化3 d后的OPCs細(xì)胞用干預(yù)后的小膠質(zhì)細(xì)胞上清(MG培養(yǎng)基)和OPCs分化培養(yǎng)基(比例為1∶1)培養(yǎng)3 d,分組如下：OPCs分化培養(yǎng)基組；M0小膠質(zhì)細(xì)胞上清液+OPCs分化培養(yǎng)基；M1小膠質(zhì)細(xì)胞上清液+OPCs分化培養(yǎng)基；M1+FTY720小膠質(zhì)細(xì)胞上清液+OPCs分化培養(yǎng)基；M1小膠質(zhì)細(xì)胞上清液+單獨(dú)預(yù)處理后的FTY720培養(yǎng)基+OPCs分化培養(yǎng)基；M2小膠質(zhì)細(xì)胞上清液+OPCs分化培養(yǎng)基,OPCs細(xì)胞干預(yù)3 d后收集細(xì)胞爬片用于免疫熒光染色。

1.4.4 免疫熒光染色 干預(yù)后的小膠質(zhì)細(xì)胞及OPCs細(xì)胞，按以前的方法[26],棄去上清，以4%多聚甲醛固定15 min后用0.25%Triton X-100破膜液室溫破膜15 min，再用封閉液(PBS含1%BSA，0．1%Triton)室溫下封閉60 min，加入兔抗小鼠Iba1抗體(1∶200)、兔抗小鼠Olig2抗體(1∶200)、大鼠抗小鼠MBP抗體(1∶200)4 ℃孵育過夜，用PBS洗3遍，每遍10 min，之后以相應(yīng)的二抗(Cy3 標(biāo)記的山羊抗兔 IgG、Cy3 標(biāo)記的山羊抗大鼠 IgG、FITC 標(biāo)記的驢抗兔 IgG 1∶200)室溫下避光孵育1 h，PBS洗3遍，每遍10 min；DAPI染色10 min，PBS洗3遍，每遍10 min；甘油封片，熒光倒置顯微鏡下觀察。

1.4.5 RT-PCR 小膠質(zhì)細(xì)胞干預(yù)24 h后棄去培養(yǎng)基，按照先前的方法[27]用Trizol 溶液裂解細(xì)胞提取RNA。提取出的RNA按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書方法將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA,然后將逆轉(zhuǎn)錄出的cDNA用實時熒光定量試劑盒檢測 mRNA的表達(dá)水平，以三磷酸甘油醛脫氫酶(GADlPH)作為內(nèi)參對照。反應(yīng)參數(shù)：94 ℃預(yù)變性10 min;(94 ℃變性45 S，56 ℃退火30 s,72 ℃延伸30 s)×35個循環(huán)：72 ℃延伸10 min。每個樣本設(shè)置3個復(fù)孔，CT值代表熒光實時定量PCR的水平，△CT =CT(目的基因)-CT(內(nèi)參基因)，ΔΔCT=ΔCT(實驗組)-△CT(對照組)。根據(jù)公式可以算出各組細(xì)胞中目的基因表達(dá)/對照組細(xì)胞中目的基因表達(dá)=2-ΔΔCT[28]。

1.4.6 ELISA 小膠質(zhì)細(xì)胞干預(yù)24 h后收集細(xì)胞上清液，按照試劑盒說明書檢測上清液中炎性因子TNF-α、TGF-β、IL-13、IL-1β的表達(dá)水平，顯色后在酶標(biāo)儀450 nm處測吸光度值，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算表達(dá)水平。

1.4.7 統(tǒng)計學(xué)處理法

采用實驗數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤(Mean±SEM)表示,SPSS19.0進(jìn)行單因素方差分析及 t檢驗，組間比較用 SNK 法。以P<0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 小膠質(zhì)細(xì)胞及少突膠質(zhì)前體細(xì)胞的鑒定

采用Iba1與DAPI免疫熒光共染法鑒定小膠質(zhì)細(xì)胞的純度顯示小膠質(zhì)細(xì)胞的純度可達(dá)99%；Olig2與DAPI免疫熒光共染法鑒定OPCs的純度顯示OPCs的純度可達(dá)95%(圖1)。

圖1 免疫熒光雙標(biāo)染色技術(shù)鑒定小膠質(zhì)細(xì)胞及OPCs的純度 A為Iba1與DAPI共染鑒定小膠質(zhì)細(xì)胞純度；B為Olig2與DAPI共染鑒定OPCs純度

2.2 FTY720在體外細(xì)胞實驗中對小膠質(zhì)細(xì)胞表型的影響

通過RT-PCR檢測顯示：LPS+IFNγ+FTY720干預(yù)較LPS+IFNγ刺激組的M1型小膠質(zhì)細(xì)胞生物學(xué)標(biāo)志物iNOS，CD86，TNF-α,CD32及IL-1β 的mRNA表達(dá)水平低，LPS+IFNγ+FTY720干預(yù)較LPS+IFNγ刺激組M2型小膠質(zhì)細(xì)胞生物學(xué)標(biāo)志物Arg 1,CD206,YM,IL-10，TGF-β 的mRNA表達(dá)水平高；與IL-4組比較，這2組的M1型小膠質(zhì)細(xì)胞生物學(xué)標(biāo)志物mRNA表達(dá)水平都較之要高，而M2型小膠質(zhì)細(xì)胞生物學(xué)標(biāo)志物的mRNA表達(dá)水平較之要低(P<0.05或P<0.01)(表2)。

表2 在體外細(xì)胞實驗中 FTY720干預(yù)后小膠質(zhì)細(xì)胞細(xì)胞表型的變化(Mean±SEM，pg/mL)

注：與LPS+IFN-γ組比較，*P<0.05，▲P<0.01

2.3 FTY720在體外細(xì)胞實驗中對小膠質(zhì)細(xì)胞上清液炎性因子表達(dá)水平的影響

LPS+IFNγ+FTY720干預(yù)較LPS+IFNγ刺激組的炎性細(xì)胞因子TNF-α，IL-1β表達(dá)水平顯著降低，炎性細(xì)胞因子TGF-β，IL-13表達(dá)水平顯著增高(P<0.05或P<0.01)(表3)。

2.4 小膠質(zhì)細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化對少突膠質(zhì)細(xì)胞前體細(xì)胞分化成熟的影響

M1(LPS+IFN-γ)+FTY720干預(yù)后的小膠質(zhì)細(xì)胞條件培養(yǎng)基后的0PCs分化較用M1型小膠質(zhì)細(xì)胞條件培養(yǎng)基干預(yù)的OPCs分化增多，提示FTY720通過促進(jìn)M1型小膠質(zhì)細(xì)胞向M2型小膠質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化而促進(jìn)OPCs的分化(圖2，表4)。

圖2 在體外細(xì)胞實驗中FTY720干預(yù)后的小膠質(zhì)細(xì)胞對OPCs分化成熟的影響(MBP與Olig2免疫熒光雙標(biāo)染色)

表3 在體外細(xì)胞實驗中 FTY720干預(yù)后小膠質(zhì)細(xì)胞上清釋放的炎性因子表達(dá)水平的改變(Mean±SEM，pg/mL)

注：與LPS+IFN-γ組比較，*P<0.01，▲P<0.01，#P<0.05

表4 在體外細(xì)胞實驗中 FTY720干預(yù)后的小膠質(zhì)細(xì)胞對OPCs分化成熟的影響(Mean±SEM，%)

注：與Control組比較，*P<0.01；與LPS+IFN-γ組比較，▲P<0.01

3 討 論

神經(jīng)炎癥被認(rèn)為是慢性腦灌注不足動物模型中白質(zhì)損傷的關(guān)鍵病理生理學(xué)[22]，小膠質(zhì)細(xì)胞在腦白質(zhì)損傷中是一把雙刃劍，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中調(diào)節(jié)免疫和炎癥反應(yīng)。小膠質(zhì)細(xì)胞存在兩種極化狀態(tài)[3-4],即經(jīng)典(促炎，M1)型及替代(抗炎，M2)型，通過產(chǎn)生促炎/抗炎因子而發(fā)揮神經(jīng)損傷/保護(hù)作用。

有研究表明芬戈莫德(FTY720)通過防止淋巴細(xì)胞從淋巴結(jié)中排出而減少循環(huán)淋巴細(xì)胞的數(shù)量，并且可能有助于防止淋巴細(xì)胞早期浸潤到腦中以及抑制小膠質(zhì)細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的局部活化。

本研究通過體外培養(yǎng)原代小膠質(zhì)細(xì)胞和少突膠質(zhì)前體細(xì)胞(OPCs)，再通過LPS+IFN-γ刺激純化后的小膠質(zhì)細(xì)胞促使小膠質(zhì)細(xì)胞活化為經(jīng)典的M1型，用FTY720干預(yù)后通過RT-PCR技術(shù)檢測小膠質(zhì)細(xì)胞表型標(biāo)記物顯示FTY720干預(yù)后小膠質(zhì)細(xì)胞的M1型標(biāo)志物減少而M2型標(biāo)志物增多，表明FTY720促使小膠質(zhì)細(xì)胞向M2型轉(zhuǎn)化。采用ELISA法檢測小膠質(zhì)細(xì)胞上清液中的炎性因子的表達(dá)水平，結(jié)果顯示FTY720干預(yù)后炎性因子TNF-α，IL-1β的分泌減少，而TGF-β,IL-13的分泌增多。說明FTY720可以減少炎性因子的釋放,增多抗炎性因子的釋放，減輕了神經(jīng)炎癥反應(yīng)。將小膠質(zhì)細(xì)胞上清液加到純化后的少突膠質(zhì)前體細(xì)胞(OPCs)中干預(yù)3 d后采用免疫熒光染色方法探討FTY720干預(yù)后小膠質(zhì)細(xì)胞對OPCs的影響，結(jié)果顯示FTY720干預(yù)后的小膠質(zhì)細(xì)胞上清液促進(jìn)OPCs的分化成熟，從而減輕腦白質(zhì)的損傷。以上研究結(jié)果表明小膠質(zhì)細(xì)胞的表型轉(zhuǎn)化對少突膠質(zhì)前體細(xì)胞(OPCs)的分化成熟有影響。但是關(guān)于影響小膠質(zhì)細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化進(jìn)而影響少突膠質(zhì)細(xì)胞的機(jī)制尚不清晰，所以還需要進(jìn)一步實驗探討。

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TheeffectofFingolimod-mediatedmicroglialpolarizationonoligodendrocyteprecursorcells

LiJin,FanWenhui,YangYuan,etal.

DepartmentofNeurology,TongjiHospital,TongjiMedicalCollege,HuazhongUniversityofScienceandTechnology,Wuhan430030

ObjectiveTo investigate the effect of S1P receptor agonist Fingolimod (FTY720) on microglial polarization and the effect of FTY720-mediated microglia polarization on maturation of oligodendrocyte precursor cells.MethodsRT-PCR was used to examine the polarization of microglia in vitro. ELISA was used to detect the supernatant of microglial cells in order to measure the levels of TNF-α, TGF-β, IL-1β and IL-13. The supernatant of microglial cells was added to the purified oligodendrocyte precursor cells, and then the differentiation of oligodendrocyte precursor cells was detected by immunofluorescence staining.ResultsFTY720 promoted the microglia toward M2 polarization, promotes differentiation of oligodendrocyte.ConclusionFTY720 promoted the differentiation of oligodendrocyte precursor cells by promoting the microglia toward M2 polarization.

FTY720 Microglial polarization Oligodendrocyte precursor cells

R742

A

1007-0478(2017)05-0383-06

10.3969/j.issn.1007-0478.2017.05.001

(2017-02-05收稿)