外源NO協(xié)同N-乙酰半胱氨酸對(duì)肥城桃果實(shí)線粒體抗氧化系統(tǒng)的調(diào)控作用

高 珊，王 泉，高吉?jiǎng)?，朱樹華

(山東農(nóng)業(yè)大學(xué) 化學(xué)與材料科學(xué)學(xué)院，山東 泰安 271018)

外源NO協(xié)同N-乙酰半胱氨酸對(duì)肥城桃果實(shí)線粒體抗氧化系統(tǒng)的調(diào)控作用

高 珊，王 泉，高吉?jiǎng)偅鞓淙A

(山東農(nóng)業(yè)大學(xué) 化學(xué)與材料科學(xué)學(xué)院，山東 泰安 271018)

探討外源NO和N-乙酰半胱氨酸對(duì)冷藏期間肥城桃果實(shí)線粒體抗氧化系統(tǒng)的影響。分別用15 μmol/L NO溶液，80 mmol/L N-乙酰半胱氨酸(N-acetyl-L-cysteine，NAC，活性氧清除劑)和15 μmol/L NO的混合溶液，5 μmol/L的c-PTIO(NO清除劑)溶液對(duì)肥城桃果實(shí)進(jìn)行浸果處理，測(cè)定果實(shí)冷藏期間線粒體呼吸、線粒體膜電勢(shì)、線粒體中丙二醛和活性氧含量及抗氧化酶活性的變化。15 μmol/L NO處理顯著降低了桃果實(shí)線粒體ROS的含量；80 mmol/L NAC-15 μmol/L NO處理桃果實(shí)線粒體ROS含量在第2周后顯著低于對(duì)照和其他處理；而5 μmol/L c-PTIO處理桃果實(shí)線粒體ROS含量顯著高于其他處理。在抗氧化酶(POD、SOD、CAT)活性測(cè)定中，15 μmol/L NO處理提高了桃果實(shí)線粒體中抗氧化酶的活性，高于對(duì)照和5 μmol/L c-PTIO處理；80 mmol/L NAC-15 μmol/L NO處理能夠提高SOD的活性，但對(duì)于POD和CAT的活性有抑制作用；而5 μmol/L c-PTIO處理抑制桃果實(shí)線粒體中抗氧化酶的活性。15 μmol/L NO處理降低了桃果實(shí)線粒體中MDA含量，除第2周均低于對(duì)照和其他處理外；80 mmol/L NAC-15 μmol/L NO處理桃果實(shí)線粒體MDA含量在第1周后顯著高于對(duì)照和其他處理；而5 μmol/L c-PTIO處理桃果實(shí)在第2，3周時(shí)線粒體中MDA含量高于對(duì)照和15 μmol/L NO處理。15 μmol/L NO處理能夠提高線粒體膜電勢(shì)，在第3周時(shí)到達(dá)最大值，是對(duì)照的1.2倍；80 mmol/L NAC-15 μmol/L NO處理桃線粒體膜電勢(shì)最高，高于對(duì)照和其他處理；而5 μmol/L c-PTIO處理降低了線粒體膜電勢(shì)，顯著低于對(duì)照和其他處理。15 μmol/L NO處理抑制了桃線粒體呼吸；80 mmol/L NAC-15 μmol/L NO處理使線粒體呼吸高峰提前1周；而5 μmol/L c-PTIO處理提高了線粒體呼吸高峰，耗氧量大于對(duì)照和其他處理。外源NO和NAC處理能夠提高桃果實(shí)線粒體抗氧化系統(tǒng)的抗氧化能力，延緩桃果實(shí)線粒體功能的下降。

桃；NO；N-乙酰半胱氨酸；線粒體；抗氧化系統(tǒng)

線粒體是真核細(xì)胞制造能量和有氧呼吸的主要場(chǎng)所，在能量轉(zhuǎn)化、氧化磷酸化、細(xì)胞代謝調(diào)控及細(xì)胞凋亡等方面發(fā)揮著重要作用[1-4]。線粒體內(nèi)含有大量的活性氧類(Reactive oxygen species，ROS)，對(duì)于氧化應(yīng)激、細(xì)胞凋亡等有重要作用。低溫等環(huán)境脅迫會(huì)引起線粒體ROS爆發(fā)，過(guò)量的ROS會(huì)使細(xì)胞面對(duì)氧化脅迫的危害，并導(dǎo)致酶失去活性、DNA損傷及脂質(zhì)過(guò)氧化等一系列危害細(xì)胞正常生理活動(dòng)的反應(yīng)，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞死亡[5-6]。桃果實(shí)是典型的溫敏型果實(shí)，對(duì)于低溫敏感，冷藏期間易發(fā)生冷害，從而限制了桃產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。因此，研究采后桃果實(shí)線粒體的抗氧化系統(tǒng)，對(duì)延長(zhǎng)果實(shí)儲(chǔ)藏期，提高桃的商業(yè)價(jià)值具有重大作用。桃果實(shí)采后貯藏一直是人們研究的重點(diǎn)，前人已經(jīng)研究1-甲基環(huán)丙烯[7]、γ-氨基丁酸[8]、聚乙烯毗絡(luò)烷酮[9]等物質(zhì)能夠延長(zhǎng)桃果實(shí)采后貯藏時(shí)間，桃果實(shí)采后貯藏受溫度影響[10]，低溫下貯藏對(duì)桃果實(shí)有冷害影響，且5 ℃下桃果實(shí)受冷害最嚴(yán)重[11]。采后果實(shí)貯藏過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生大量的ROS[12]，ROS作為生物中重要的信號(hào)分子，參與蛋白巰基氧化特異性傳導(dǎo)[13]，還在肺組織細(xì)胞線粒體凋亡至肺纖維化中發(fā)揮重要作用[14]，在生物代謝中受到嚴(yán)格控制[15]，過(guò)量的ROS能夠抑制果實(shí)和線粒體中氧化損傷，而引起果實(shí)衰老。ROS的產(chǎn)生與線粒體膜電勢(shì)和細(xì)胞呼吸鏈有關(guān)[16]。線粒體是細(xì)胞呼吸作用產(chǎn)生ATP的場(chǎng)所，是細(xì)胞內(nèi)ROS的主要來(lái)源。NO是一種極不穩(wěn)定的生物自由基，在動(dòng)物體內(nèi)的生理功能、信號(hào)傳遞、細(xì)胞凋亡及酶調(diào)節(jié)等都具有重要作用[17]，還能調(diào)控線粒體中氧的消耗和ROS的生成[18]并且能提高抗氧化酶活性來(lái)減少果實(shí)中ROS的含量[19]，保護(hù)李果實(shí)線粒體膜的氧化損傷[20]，抑制小麥種子在高鹽下的線粒體氧化損傷[21]，并且對(duì)采后果實(shí)貯藏品質(zhì)具有重要的調(diào)節(jié)作用[22]。N-乙酰半胱氨酸(N-acetyl-L-cysteine，NAC)作為抗氧化劑，具有抗氧化作用，并對(duì)已有的自由基有清理作用，是阻斷細(xì)胞凋亡的過(guò)程[23]。動(dòng)物組織中NAC在調(diào)控細(xì)胞代謝、調(diào)節(jié)免疫功能、抑制炎癥反應(yīng)、預(yù)防基因損傷等方面都發(fā)揮著重要作用[24-25]。最近研究發(fā)現(xiàn)，NO能夠抑制李果實(shí)存儲(chǔ)期間的呼吸速率和ROS的產(chǎn)生[20]，并且能夠延長(zhǎng)桃果實(shí)采后的貯藏期[26]。而NAC能夠抑制小鼠骨髓干細(xì)胞ROS的產(chǎn)生和改善大鼠細(xì)胞氧化應(yīng)激來(lái)預(yù)防大鼠后囊和核區(qū)白內(nèi)障的發(fā)生[27-28]。但是現(xiàn)在的研究對(duì)5 ℃下NO處理對(duì)桃果實(shí)線粒體抗氧化系統(tǒng)的影響，NO和NAC應(yīng)用于植物抗氧化方面都少有報(bào)道。本研究以肥城大紅袍桃為試材，采后經(jīng)15 μmol/L NO溶液、80 mmol/L N-乙酰半胱氨酸(N-acetyl-L-cysteine，NAC，活性氧清除劑)和15 μmol/L NO的混合溶液、5 μmol/L的c-PTIO(NO清除劑)溶液浸果處理，測(cè)定果實(shí)冷藏期間線粒體呼吸、線粒體膜電勢(shì)、線粒體中丙二醛和活性氧含量及抗氧化酶活性的變化，進(jìn)而探討NO和NAC處理對(duì)桃果實(shí)線粒體抗氧化系統(tǒng)的影響和作用機(jī)理，旨在為NO和NAC應(yīng)用于肥城桃儲(chǔ)藏保鮮提供試驗(yàn)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1試驗(yàn)材料

試驗(yàn)所用肥城桃品種為大紅袍，于2014年9月采摘于桃基地，采摘后即刻運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室。選擇大小相似、長(zhǎng)勢(shì)良好、無(wú)病蟲害且無(wú)機(jī)械損傷的八成熟桃果實(shí)進(jìn)行處理。

將肥城桃在0 ℃環(huán)境中預(yù)冷存儲(chǔ)24 h，分別用15 μmol/L NO溶液(處理Ⅰ)、80 mmol/L NAC(預(yù)試驗(yàn)最適濃度)和15 μmol/L NO的混合溶液(處理Ⅱ)、5 μmol/L c-PTIO(NO清除劑)溶液(處理Ⅲ)，以雙蒸水溶液為對(duì)照，浸泡30 min，晾干果實(shí)表面殘留水分后于5 ℃貯藏，每7 d取樣1次，所取樣品于-80 ℃超低溫冰箱存儲(chǔ)備用。每種處理用桃30個(gè)，各設(shè)3個(gè)重復(fù)。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1 線粒體的提取 參考Braidot等[29]和Millar等[30]的方法，稱取桃果實(shí)8 g，將其研磨成粉末狀，加入16 mL的 25 mmol/L Mops-KOH(pH值7.8，含10 mmol/L麥黃酮，8 mmol/L L-半胱氨酸，0.1% PVP40，1 mmol/L EGTA，0.4 mol/L甘露醇，0.1% BSA)，用紗布過(guò)濾，在4 ℃下離心(6 000 r/min，5 min)，取上清液，在4 ℃下離心(12 000 r/min，30 min)，棄上清液。用0.5 mL的10 mmol/L Mops-KOH(pH值7.2，含1 mmol/L EGTA，0.4 mol/L甘露醇，0.1% BSA)，重懸浮沉淀，得到線粒體的粗提溶液。重復(fù)提取3次。

1.2.2 線粒體的純化 用蔗糖密度梯度離心法純化線粒體粗提液[31]。配置2種濃度的蔗糖溶液(0.6，1.4 mol/L蔗糖，0.1% BSA，1 mmol/L EGTA，10 mmol/L Mops-KOH(pH值7.2))，在離心管中加入6 mL 0.6 mol/L蔗糖溶液，將1.4 mol/L蔗糖溶液注射到下層，將線粒體的粗提液，緩緩地鋪在0.6 mol/L 蔗糖溶液的上層，4 ℃下離心(12 000 r/min，60 min)，抽取0.6 mol/L與1.4 mol/L 2層蔗糖溶液之間的溶液，4 ℃下離心(12 000 r/min，30 min)，棄上清液，沉淀即為純化后的線粒體，冰浴中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 線粒體蛋白濃度的測(cè)定 用1 mL Tris-HCl緩沖液(50 mmol/L，pH值8.5)重懸浮純化的線粒體?？捡R斯亮藍(lán)法[32]測(cè)蛋白含量，以牛血清蛋白為標(biāo)準(zhǔn)，計(jì)算蛋白含量。

1.2.4 線粒體中ROS含量的測(cè)定 參考Degli[33]和Jambunathan[34]的方法。用1 mL Tris-HCl緩沖液(100 mmol/L，pH值8.5)重懸浮純化的線粒體，取100 μL線粒體溶液(空白參比為Tris-HCl緩沖液)，加入900 μL Tris-HCl緩沖液(10 mmol/L，pH值7.2)和10 μL 2 mmol/L 2′，7′-二氯熒光素乙二酸鹽(DCF-DA)溶液，室溫黑暗中孵育0.5 h，用熒光分光光度計(jì)檢測(cè)其熒光強(qiáng)度(最大激發(fā)波長(zhǎng) 485 nm，最大發(fā)射波 530 nm，狹縫 5 nm)。線粒體中ROS含量結(jié)果以單位濃度蛋白的相對(duì)熒光強(qiáng)度(a.u)表示((a.u)/mg)。

1.2.5 線粒體中SOD、POD、CAT活性的測(cè)定 用1.0 mL Tris-HCl緩沖液(10 mmol/L，pH值7.2)重懸浮純化的線粒體。具體步驟參考購(gòu)自南京建成生物工程研究所的總超氧化物歧化酶(T-SOD)測(cè)試盒、過(guò)氧化物酶測(cè)試盒、過(guò)氧化氫酶測(cè)試盒說(shuō)明書。SOD以每毫克線粒體蛋白在1 mL反應(yīng)液中SOD抑制率達(dá)50%時(shí)所對(duì)應(yīng)的SOD量為一個(gè)SOD活力單位(U)，SOD活力表示為U/mg；POD以每毫克線粒體蛋白每分鐘催化1 μg底物的酶量定義為一個(gè)酶活力單位(U)，POD活力表示為U/mg；CAT以每mg線粒體蛋白每秒分解1 μmol的H2O2的量為一個(gè)活力單位(U)，CAT的活性表示為U/mg。

利用粉晶X射線衍射儀ShimadzuXRD-6100進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)前先將煤樣研磨成粉末狀，在CuKa輻射、電壓20kV、電流30mA、掃描速度3°/mm、掃描范圍5°～80°的條件下進(jìn)行物相分析。

1.2.6 線粒體中MDA含量的測(cè)定 參照趙世杰等[35]的方法。用1.5 mL Tris-HCl緩沖液(10 mmol/L，pH值7.2)重懸浮純化的線粒體，取1.0 mL線粒體溶液(空白參比為Tris-HCl緩沖液)，加入1.0 mL 0.6%硫代巴比妥酸(TBA)溶液，沸水浴15 min，冷卻至室溫后離心(12 000 r/min，1 min)，取上清液，分別測(cè)定波長(zhǎng)450，532，600 nm處的吸光度。根據(jù)CMDA(μmol) =6.45(D532-D600)-0.56 D450，計(jì)算MDA濃度，并根據(jù)蛋白濃度計(jì)算線粒體中MDA含量，以μmol/g表示。

1.2.7 線粒體膜電勢(shì)的測(cè)定 參照Baracca等[36]的方法。用1.0 mL HEPES-HCl緩沖液(10 mmol/L，pH值7.4)重懸浮純化的線粒體，取0.2 mL線粒體溶液，加入1 mL的10 mmol/L HEPES-HCl(pH值7.4，含2 mmol/L MgCl2，100 μmol/L K-EGTA，4 mmol/L KH2PO4，250 mmol/L蔗糖)，25 ℃孵育5 min，加入1 μL Rh123溶液(2 μg/mL)，立即檢測(cè)4 min內(nèi)熒光強(qiáng)度變化(最大激發(fā)波長(zhǎng)503 nm，最大發(fā)射波長(zhǎng)576 nm)。線粒體膜電勢(shì)以Rh123熒光淬滅速率與線粒體的蛋白濃度的比值表示為(ΔF/Fi)/(s·mg)。

1.2.8 線粒體呼吸的測(cè)定 參照潘儼等[37]和Hu等[38]的方法。用1.0 mL Tris-HCl緩沖液(10 mmol/L，pH值7.2)重懸浮純化的線粒體，取0.2 mL線粒體溶液，加入1.8 mL Tris-HCl緩沖液(10 mmol/L，pH值7.2)，室溫下用Oxygraph Plus液相氧電極測(cè)定線粒體耗氧速率。線粒體呼吸以單位蛋白濃度在單位時(shí)間內(nèi)的耗氧量表示(nmol/(min·mg))。

1.2.9 NAC對(duì)離體線粒體抗氧化系統(tǒng)的影響 將對(duì)照桃果實(shí)線粒體純化，用80 mmol/L NAC溶液處理20 min，以不作處理為對(duì)照，檢測(cè)各項(xiàng)生理指標(biāo)。

1.3數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

所有樣品平行測(cè)定3次，數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差表示，用Origin 8.5作圖，用Excel 2013軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析(ANOVA)，用 SPSS 進(jìn)行差異顯著性分析(P<0.05)。

2 結(jié)果與分析

2.1NO對(duì)線粒體活性氧含量的影響

如圖1所示，5 ℃ 15 μmol/L NO處理降低了桃果實(shí)線粒體活性氧的含量，尤其在第1周時(shí)，ROS含量是對(duì)照的50%，是5 μmol/Lc-PTIO處理的43%。80 mmol/L NAC-15 μmol/L 驗(yàn)室NO處理降低了線粒體活性氧的含量，維持一個(gè)較低的水平，在2周后顯著低于對(duì)照和其他處理(P<0.05)，第3周時(shí)ROS含量最低是對(duì)照的35%，是15 μmol/L NO處理的38%。而5 μmol/L c-PTIO處理桃果實(shí)線粒體ROS含量顯著高于對(duì)照和其他處理(P<0.05)。

a、b、c、d.相同時(shí)間不同處理之間差異性分析(P<0.05)。圖2-6同。Lower letters indicate significant differences among treatment at the same week (P<0.05). The same as Fig.2-6.

2.2NO對(duì)SOD、POD和CAT活性的影響

如圖2所示，15 μmol/L NO處理提高了桃果實(shí)線粒體SOD活性，第2周時(shí)SOD的活性達(dá)到最大值，是5 μmol/L c-PTIO處理的1.2倍，此后15 μmol/L NO處理線粒體SOD活性高于對(duì)照和5 μmol/L c-PTIO處理。80 mmol/L NAC-15 μmol/L NO處理提高了線粒體SOD的活性，除第3周其他貯藏期間均顯著高于對(duì)照和15 μmol/L NO處理(P<0.05)，尤其在第2周時(shí)SOD的活性是對(duì)照的1.2倍。而5 μmol/L c-PTIO處理降低了線粒體SOD的活性，除第3周外，均低于對(duì)照和其他處理。

隨桃果實(shí)貯藏時(shí)間的增加，POD活性呈降低趨勢(shì)。而15 μmol/L NO處理提高了桃果實(shí)線粒體POD活性，尤其在第1周時(shí)POD的活性是對(duì)照的1.5倍，除第2周時(shí)15 μmol/L NO處理略低于對(duì)照，POD活性均高于對(duì)照和其他處理外。80 mmol/L NAC-15 μmol/L NO處理和對(duì)照的POD活性除第3周外無(wú)顯著差異，均低于15 μmol/L NO處理。而5 μmol/L c-PTIO處理POD活性除第3周外，均低于對(duì)照和其他處理。

15 μmol/L NO處理提高了桃果實(shí)線粒體CAT活性，而在第1周時(shí)，CAT活性最低，是對(duì)照的1.3倍，是5 μmol/L c-PTIO處理的2.6倍。80 mmol/L NAC- 15 μmol/L NO處理顯著降低了桃果實(shí)線粒體CAT活性(P<0.05)，第2周CAT活性較小，僅為對(duì)照的45%,第2 周后CAT活性升高，但低于對(duì)照和15 μmol/L NO處理。而5 μmol/L c-PTIO處理降低了線粒體CAT的活性，低于對(duì)照和15 μmol/L NO處理。

圖2 不同處理冷藏桃果實(shí)線粒體中抗氧化酶活性變化Fig.2 Changes in the activities of mitochondrial antioxidant enzymes of peaches with different treatments during cold storage

2.3NO對(duì)線粒體內(nèi)MDA含量的影響

如圖3所示，整個(gè)貯藏期間，15 μmol/L NO處理桃果實(shí)線粒體中丙二醛的含量維持在較低水平，除第2周，15 μmol/L NO處理丙二醛含量均低于對(duì)照和其他處理。80 mmol/L NAC-15 μmol/L NO處理桃線粒體MDA含量在第1周后顯著提高，高于對(duì)照和其他處理(P<0.05)。而5 μmol/L c-PTIO處理桃果實(shí)線粒體MDA含量在第2～3周高于對(duì)照和15 μmol/L NO處理。

圖3 不同處理冷藏桃果實(shí)線粒體中MDA含量變化Fig.3 Changes in mitochondrial MDA content of peaches with different treatments during cold storage

2.4NO對(duì)線粒體膜電勢(shì)的影響

線粒體膜電勢(shì)是生物膜兩側(cè)離子濃度不同所產(chǎn)生的跨膜電位差，是反映線粒體功能完整性和評(píng)價(jià)線粒體功能的敏感指標(biāo)[39]。如圖4所示，隨著貯藏時(shí)間增加，線粒體膜電勢(shì)呈逐漸降低的趨勢(shì)。15 μmol/L NO處理提高了線粒體膜電勢(shì)，尤其第3周時(shí)是對(duì)照的1.2倍，整個(gè)貯藏期間膜電勢(shì)高于對(duì)照和5 μmol/L c-PTIO處理。80 mmol/L NAC-15 μmol/L NO處理提高了線粒體膜電勢(shì)，顯著高于對(duì)照和其他處理(P<0.05)，能夠維持采后果實(shí)貯藏中較高線粒體膜電勢(shì)。而5 μmol/L c-PTIO處理降低了線粒體膜電勢(shì)，顯著低于對(duì)照和其他處理(P<0.05)。

圖4 不同處理冷藏桃果實(shí)線粒體膜電勢(shì)的變化Fig.4 Changes in mitochondrial membrane potential of peaches with different treatments during cold storage

2.5NO對(duì)線粒體呼吸的影響

如圖5所示，對(duì)照和15 μmol/L NO處理桃果實(shí)線粒體在第3周出現(xiàn)呼吸高峰，耗氧量分別為95.43，75.42 nmol/(min·mg)，15 μmol/L NO處理桃果實(shí)線粒體的呼吸高峰明顯低于對(duì)照的呼吸高峰。5 μmol/L c-PTIO處理和80 mmol/L NAC-15 μmol/L NO處理桃果實(shí)線粒體呼吸高峰在第2周出現(xiàn)，比對(duì)照提前1周。5 μmol/L c-PTIO處理呼吸高峰高于對(duì)照和其他處理。

圖5 不同處理冷藏桃果實(shí)線粒體耗氧量的變化Fig.5 Changes in mitochondrial oxygen consumption of peaches with different treatments during cold storage

2.6NAC對(duì)離體線粒體生理指標(biāo)的影響

如圖6所示，80 mmol/L NAC處理離體線粒體內(nèi)ROS含量顯著低于對(duì)照(P<0.05)，僅為對(duì)照的59.7%；SOD活性是對(duì)照的1.3倍；POD活性和CAT活性顯著低于對(duì)照(P<0.05)，分別為對(duì)照的38.2%和54.7%；MDA含量是對(duì)照的31.6%；線粒體耗氧量略低于對(duì)照，是對(duì)照的94.9%；線粒體膜電勢(shì)是對(duì)照的1.1倍。

3 討論與結(jié)論

線粒體是植物ROS的重要來(lái)源和作用靶點(diǎn)。正常生理狀態(tài)下，植物細(xì)胞中僅含有少量的ROS并發(fā)揮重要的生理作用，但是細(xì)胞衰老會(huì)產(chǎn)生大量的ROS[12]，過(guò)量的ROS可能直接破壞線粒體膜的脂質(zhì)和蛋白，增加線粒體膜的氧化損傷，使線粒體中MDA含量提高，降低線粒體膜電勢(shì)[40]，而線粒體膜電勢(shì)的降低會(huì)使活性氧進(jìn)一步增多，引發(fā)惡性循環(huán)，從而破壞果實(shí)線粒體的抗氧化系統(tǒng)，導(dǎo)致細(xì)胞死亡。因此，保持ROS產(chǎn)生和清除之間的平衡對(duì)于細(xì)胞正常代謝具有積極作用。植物線粒體呼吸是產(chǎn)生ROS的主要方式[41]。本試驗(yàn)中，5 ℃ 15 μmol/L NO處理能夠降低線粒體中MDA的含量，減緩了線粒體膜電勢(shì)的降低速率，降低了線粒體的耗氧量。外源NO能夠抑制線粒體膜脂過(guò)氧化，從而維持線粒體膜電位的穩(wěn)定，保持線粒體膜功能和結(jié)構(gòu)的完整性，同時(shí)抑制線粒體的呼吸，減少ROS的產(chǎn)生，維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定。前人在李果實(shí)線粒體膜研究中有相似結(jié)論[20]。前人已經(jīng)研究NAC能延緩?fù)酶渭?xì)胞細(xì)胞凋亡[42]，并且能影響線粒體中的能量代謝[43]。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，80 mmol/L NAC-15 μmol/L NO處理能夠減緩膜電勢(shì)的降低速率，維持線粒體膜電勢(shì)的穩(wěn)定性，但是提高桃線粒體內(nèi)的MDA含量和呼吸高峰，與NAC處理離體線粒體結(jié)果不同，可能是NO和NAC的協(xié)同處理一定程度上提高了線粒體呼吸，從而導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)ROS的增加，破壞了線粒體外環(huán)境的穩(wěn)定，從而使線粒體膜脂過(guò)氧化，線粒體中MDA含量增加。

圖6 NAC處理對(duì)離體線粒體的影響Fig.6 Effects of NAC on in intro mitochondria

在植物體內(nèi)ROS的清除是由酶促和非酶促抗氧化系統(tǒng)共同完成的[44-45]，其中，SOD、POD和CAT等抗氧化酶可以清除植物組織中過(guò)量的ROS，從而維持線粒體內(nèi)環(huán)境的相對(duì)平衡。前人研究表明，適宜濃度的外源NO可以抑制采后番茄[46]、獼猴桃[47]等果實(shí)中活性氧的累積，并保持果實(shí)中較高的SOD、POD、CAT的活性。在本研究中，15 μmol/L NO處理顯著降低了線粒體內(nèi)ROS含量，有效提高了線粒體SOD、POD、CAT抗氧化酶的活性，與前人研究結(jié)果一致[20]。前人已經(jīng)證實(shí)NAC能夠抑制動(dòng)物細(xì)胞的死亡和對(duì)小鼠肝臟細(xì)胞氧化脅迫起保護(hù)作用[48-49]。在本試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，80 mmol/L NAC-15 μmol/L NO處理能夠降低果實(shí)線粒體中ROS的含量，提高SOD的活性，在NAC處理離體線粒體中也得到相似結(jié)果。這與前人在大鼠肝線粒體損傷中得到結(jié)論相似[50]。NO和NAC處理顯著降低了離體線粒體ROS含量并提高了線粒體SOD活性，從而促進(jìn)了超氧陰離子自由基向H2O2的轉(zhuǎn)化。但NO和NAC處理降低了離體線粒體POD和CAT的活性，可能是因?yàn)镹AC能透過(guò)線粒體膜，在線粒體內(nèi)脫去乙酰基，形成L-半胱氨酸并大量合成谷胱甘肽，這些谷胱甘肽作為還原劑通過(guò)非酶促途徑與H2O2反應(yīng)，從而減少了POD和CAT的底物，表現(xiàn)出較低的POD和CAT活性。此外，NO還可以與ROS直接反應(yīng)并相互調(diào)節(jié)[51]，從而降低過(guò)量ROS對(duì)線粒體的傷害，維持線粒體的抗氧性。

本試驗(yàn)初步探討了外源NO和NAC處理對(duì)采后桃線粒體抗氧化系統(tǒng)的影響。由于NO和NAC在生物抗氧化性研究中發(fā)揮越來(lái)越重要的作用，而且細(xì)胞內(nèi)很多生理生化反應(yīng)依賴于線粒體，因此，對(duì)NO和NAC維持線粒體抗氧化系統(tǒng)的確切機(jī)理及線粒體正常的生理功能值得深入研究。

NO和NAC處理能夠通過(guò)顯著降低線粒體中ROS含量、提高抗氧化酶SOD的活性，降低線粒體中膜電勢(shì)的降低速率，保持較高的膜電勢(shì)，維持線粒體內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定來(lái)提高線粒體抗氧化系統(tǒng)的抗氧化能力。從而提高桃的貯藏時(shí)間。

5 ℃ 15 μmol/L NO處理能夠提高桃線粒體中SOD、POD和CAT的活性，有效減少了線粒體中ROS的含量，抑制線粒體的呼吸速率，從而降低了ROS對(duì)線粒體的傷害；減緩線粒體中膜電勢(shì)的降低速率，維持較高膜電勢(shì)，保持線粒體膜功能和結(jié)構(gòu)的完整性，維持線粒體內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定，提高線粒體抗氧化系統(tǒng)的抗氧化能力。

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RegulationbyExogenousNitricOxideandN-acetyl-L-cysteineonMitochondrialAntioxidantSysteminFeichengPeaches

GAO Shan,WANG Quan，GAO Jigang，ZHU Shuhua

(College of Chemistry and Material Science，Shandong Agricultural University，Tai′an 271018，China)

To study the regulation by exogenous nitric oxide (NO) and N-acetyl-L-cysteine(NAC)on mitochondrial antioxidative system of Feicheng peaches during cold storage. Feicheng peaches were dipped in 15 μmol/L NO，80 mmol/L N-acetyl-L-cysteine (NAC，reactive oxygen species scavenger) plus 15 μmol/L NO，and 5 μmol/L c-PTIO (NO scavenger) solution，respectively. The changes in mitochondrial respiration，mitochondrial membrane potential，the contents of malonaldehyde (MDA) and reactive oxygen species (ROS) and the activities of antioxidant enzymes were detected. Treatment with 15 μmol/L NO significantly decreased mitochondrial ROS content. Especially at the 1st week，mitochondrial ROS content in peaches treated with 15 μmol/L NO was only 50% of the control. Mitochondrial ROS content in peaches treated with 80 mmol/L NAC-15 μmol/L NO was significantly lower than that of the control and other treatments after 2 weeks，while treatment with 5 μmol/L c-PTIO increased the content of mitochondrial ROS. The activities of antioxidative enzymes (POD，SOD and CAT) in mitochondria of peaches treated with 15 μmol/L NO was higher than that of the control and treatment with 5 μmol/L c-PTIO. Treatment with 80 mmol/L NAC-15 μmol/L NO increased the activity of mitochondrial SOD and decreased the activities of mitochondrial POD and CAT. Treatment with 5 μmol/L c-PTIO decreased the activities of antioxidative enzymes in mitochondria. Mitochondrial MDA content in peaches treated with 15 μmol/L NO was lower than that of the control and other treatments during the storage except for the second week. However，mitochondrial MDA content in peaches treated with 80 mmol/L NAC-15 μmol/L NO was significantly higher than that of the control and other treatments after 1 week. Mitochondrial MDA content in peaches treated with 5 μmol/L c-PTIO was higher than that of the control and treatment with 15 μmol/L NO in the second and third week. Mitochondrial membrane potential was improved by treatment with 15 μmol/L NO，reached the maximum，which was 1.2 times as high as that of the control，at 3 weeks. Mitochondrial membrane potential of peaches treated with 80 mmol/L NAC-15 μmol/L NO was higher than that of the control and other treatments. However，treatment with 5 μmol/L c-PTIO decreased mitochondrial membrane potential. The mitochondrial respiration of peaches was inhibited by treatment with 15 μmol/L NO. Mitochondrial respiration peak of peaches treated with 80 mmol/L NAC-15 μmol/L NO appeared 1 week earlier than the control. Treatment with 5 μmol/L c-PTIO maintained high respiration of mitochondria. Exogenous nitric oxide and N-acetyl-L-cysteine could improve the antioxidant capacity of mitochondrial antioxidant system of peaches during storage，and delay the decrease of mitochondrial function.

Peach (Prunuspersica); Nitric oxide; N-acetyl-L-cysteine；Mitochondria；Antioxidant system

2017-06-03

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31270723)

高 珊(1990-)，女，山東濰坊人，在讀碩士，主要從事化學(xué)生物分析研究。

朱樹華(1978-)，男，山東泰安人，教授，博士，主要從事化學(xué)生物學(xué)研究。

S662.1

A

1000-7091(2017)05-0163-08

10.7668/hbnxb.2017.05.025