甜菜雙向電泳體系條件的優(yōu)化

張 輝，白 晨，王華忠，張惠忠，李曉東，付增娟，趙尚敏，鄂圓圓，張自強(qiáng)，王 良

(1.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院，北京 100081；2.內(nèi)蒙古自治區(qū)農(nóng)牧業(yè)科學(xué)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010031；3.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院 甜菜研究所，黑龍江 哈爾濱 150080)

甜菜雙向電泳體系條件的優(yōu)化

張 輝1，2，白 晨2，王華忠3，張惠忠2，李曉東2，付增娟2，趙尚敏2，鄂圓圓2，張自強(qiáng)2，王 良2

(1.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院，北京 100081；2.內(nèi)蒙古自治區(qū)農(nóng)牧業(yè)科學(xué)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010031；3.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院 甜菜研究所，黑龍江 哈爾濱 150080)

為了獲得甜菜葉片雙向電泳中蛋白質(zhì)最佳提取方法，建立甜菜葉片蛋白質(zhì)雙向電泳最佳的雙向電泳體系。以甜菜葉片為材料，通過比較分析，研究甜菜葉片總蛋白提取方法、IPG膠條pH 值及其對(duì)應(yīng)上樣量等因素對(duì)甜菜葉片蛋白質(zhì)雙向電泳結(jié)果的影響。結(jié)果表明：酚提取法、TCA/丙酮提取法和可溶性蛋白提取法3種蛋白提取方法中TCA/丙酮法提取效果較好，pH值4～7與pH值5～8的雙向蛋白電泳比較發(fā)現(xiàn)：pH值4～7膠條蛋白點(diǎn)清晰且在圖譜上的蛋白點(diǎn)分布均勻，無蛋白點(diǎn)集中現(xiàn)象，更適合甜菜葉片的蛋白質(zhì)組分析。采用7 cm 線性固相 IPG 膠條進(jìn)行雙向電泳，150 μg上樣量蛋白點(diǎn)明顯增多，雙向電泳效果更好，pH值4～7的17 cm膠條300 μg上樣量膠點(diǎn)更多更清晰，試驗(yàn)結(jié)果為甜菜蛋白質(zhì)組學(xué)的研究提供了最佳的試驗(yàn)方法。

甜菜；蛋白質(zhì)提取方法；雙向電泳；體系優(yōu)化

甜菜是二年生作物，重要的糖料作物之一，主要分布在黑龍江、內(nèi)蒙古和新疆3個(gè)地區(qū)。國(guó)家將糧、棉、油、糖作為重要的戰(zhàn)略儲(chǔ)備物資，糖料也是關(guān)系國(guó)計(jì)民生的重要物資。蛋白質(zhì)組學(xué)(Proteomics)一詞，源于蛋白質(zhì)(Protein)與基因組(Genome)2個(gè)詞的雜合，意指“一種基因組所表達(dá)的全套蛋白質(zhì)”，即包括一種細(xì)胞乃至一種生物所表達(dá)的全部蛋白質(zhì)。隨著蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)體系的不斷發(fā)展、不斷完善，植物蛋白質(zhì)組學(xué)快速發(fā)展。甜菜作為重要的糖料作物之一，開展甜菜蛋白質(zhì)組學(xué)研究對(duì)研究相關(guān)的抗逆、高產(chǎn)、含糖具有重要意義。國(guó)內(nèi)報(bào)道了對(duì)甜菜M14品系花器官進(jìn)行了特異性表達(dá)蛋白質(zhì)的研究[1]。開展了對(duì)甜菜葉片應(yīng)答干旱脅迫處理進(jìn)行的差異蛋白質(zhì)組學(xué)分析[2]。對(duì)甜菜塊根膨大過程的蛋白質(zhì)組變化也進(jìn)行了相關(guān)研究[3]。此外，對(duì)甜菜細(xì)胞質(zhì)雄性不育系與保持系花期差異蛋白表達(dá)開展了研究[4]。范慧艷[5]在已有的研究基礎(chǔ)上，對(duì)BNYVV侵染系統(tǒng)寄主煙草和甜菜的生物學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)和蛋白組學(xué)特點(diǎn)進(jìn)行比較分析研究。國(guó)外甜菜蛋白組學(xué)研究則在芽勢(shì)變化[6]、抗旱性[7]、抗鹽性[8]、育性[9]等方面有報(bào)道。但目前關(guān)于甜菜蛋白質(zhì)組學(xué)的報(bào)道相對(duì)于其他作物還是較少，與甜菜雙向電泳技術(shù)的不成熟有一定的關(guān)系。因此，本研究針對(duì)甜菜葉片總蛋白的提取方法，線性固相pH梯度(Immobilized pH gradient，IPG)膠條pH值、上樣量等進(jìn)行研究，建立了一套甜菜葉片蛋白質(zhì)雙向電泳技術(shù)方法，為甜菜蛋白質(zhì)組研究提供理論依據(jù)和參考。

1 材料和方法

1.1供試材料與處理

試驗(yàn)材料為內(nèi)蒙古農(nóng)牧業(yè)科學(xué)院自育材料HB-1，于2014年6月20日播種，在內(nèi)蒙古農(nóng)牧業(yè)科學(xué)院自然條件下進(jìn)行盆栽試驗(yàn)，將種子播種于直徑20 cm、高25 cm的塑料盆內(nèi)，每盆裝3 kg土，定苗10株，盆栽每隔3 d澆一次自來水，每次250 mL。待真葉展開后6～8片葉時(shí)進(jìn)行葉片取樣，儲(chǔ)存于-80 ℃冰箱中備用。

1.2總蛋白提取方法

采用以下3種方法進(jìn)行，TCA/丙酮提取法[10]、酚提取法[11]、可溶性蛋白提取雙乙法[12]。

1.3蛋白質(zhì)濃度測(cè)定體系

從濃縮后的蛋白干粉中取15 mg，向其中加入150 μL的蛋白裂解液復(fù)融。濃縮后的蛋白干粉很難溶解，可通過反復(fù)凍融的方法促進(jìn)蛋白溶解。直到看不見蛋白顆粒為止。從上清液中取1 μL，稀釋100 倍，用于測(cè)定蛋白含量。采用Bradford法定量蛋白[13]。

1.4雙向電泳條件的設(shè)定

選用不同pH值范圍的IPG膠條進(jìn)行對(duì)比，調(diào)整上樣量比較雙向電泳的清晰度，確定最佳的pH值范圍及上樣量，不同膠條長(zhǎng)度的雙向電泳比較。7 cm膠條和17 cm固相IPG膠條等電聚焦反應(yīng)程序的設(shè)定如表1，2。

表1 7 cm固相IPG膠條第一向等電聚焦程序Tab.1 The first isoelectric focusing procedure of 7 cm solid phase IPG adhesive strip

表2 17 cm固相IPG膠條第一向等電聚焦程序Tab.2 The first isoelectric focusing procedure of 17 cm solid phase IPG adhesive strip

1.5雙向凝膠電泳及凝膠染色

第一向等電聚焦采用水化上樣的方法；第二向SDS-PAGE凝膠電泳采用12%SDS-PAGE凝膠垂直板電泳；凝膠染色采用經(jīng)典考馬斯亮藍(lán)染色。

2 結(jié)果與分析

2.1不同蛋白提取方法的比較

2.1.1 蛋白質(zhì)檢測(cè) 蛋白質(zhì)提取后采用Bradford法定量蛋白，取6支試管，編號(hào)后，按表3加入試劑，圖1曲線計(jì)算提取蛋白的含量。將3種蛋白質(zhì)提取方法提取的濃度適中的蛋白質(zhì)進(jìn)行垂直聚丙烯酰胺凝膠電泳。圖2為3種提取方法的垂直聚丙烯酰胺凝膠電泳圖。由圖2可知，3種蛋白質(zhì)提取方法在上樣量均為15 μL的情況下，TCA/丙酮提取方法電泳后的蛋白質(zhì)條帶最為清晰，酚提取法較之顏色稍淺，可溶性蛋白提取法條帶最淺。相比較TCA/丙酮提取方法效果更好。

表3 繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線所加試劑劑量Tab.3 The dosage needed for drawing standard curve

圖1 根據(jù)表3所做的標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 The standard curve drawing according to Tab.3

圖2 三種蛋白提取方法的聚丙烯酰胺凝膠電泳比較Fig.2 Comparison of three protein extraction methods by polyacrylamide gel electrophoresis

2.1.2 不同蛋白質(zhì)提取方法比較 在上樣量均100 μg、等電聚焦條件相同的情況下，比較了酚提取法、TCA/丙酮法和可溶性蛋白提取法3種方法。提取到的蛋白的雙向電泳結(jié)果如圖3顯示：在pH值3～10的膠面上，用可溶性蛋白提取法提取的蛋白質(zhì)2-DE圖譜，蛋白點(diǎn)較模糊，分辨率低，有橫紋干擾；酚提取法所得的2-DE膠圖譜蛋白點(diǎn)較清晰，凝膠背景也較為干凈，橫豎條紋干擾較少；相比較下，TCA/丙酮法的蛋白點(diǎn)最為清晰，背景最干凈。

2.2雙向電泳體系條件優(yōu)化

2.2.1 7 cm固相IPG膠條條件優(yōu)化 pH值3～10 的7 cm線性固相 IPG 膠條，上樣量分別為50，100 μg，對(duì)提取的蛋白進(jìn)行雙向電泳。電泳結(jié)果顯示(圖4)：100 μg上樣量蛋白點(diǎn)更多且圖像更清晰，但是背景加深，條紋變明顯。pH值4～7與pH值5～8的100 μg上樣量雙向蛋白電泳比較發(fā)現(xiàn)(圖5)：pH值4～7膠條蛋白點(diǎn)較清晰且在圖譜上分布較均勻，有少量蛋白點(diǎn)集中現(xiàn)象，更適合甜菜葉片的蛋白質(zhì)組分析。對(duì)pH值4～7的7 cm線性固相 IPG 膠條上樣量分別為100，150 μg進(jìn)行雙向電泳。pH值4～7膠條不同上樣量比較發(fā)現(xiàn)(圖6)：與100 μg上樣量相比，150 μg上樣量圖譜的蛋白點(diǎn)數(shù)量較多，點(diǎn)更加清晰。因此，該樣品7 cm線性IPG 膠條上樣量150 μg較適合雙向電泳分析。

圖3 三種提取法蛋白質(zhì)雙向電泳后效果圖Fig.3 Comparison of three protein extraction methods by protein two-dimensional electrophoresis

圖4 pH值3～10的7 cm膠條不同上樣量比較情況Fig.4 Comparison of different sample sizes of 7 cm strips from pH 3-10

圖5 7 cm膠條相同上樣量不同pH值范圍比較Fig.5 Comparison of 7 cm strip with same sample size between different pH range

圖6 7 cm膠條相同pH值范圍不同比較上樣量Fig.6 Comparison of 7 cm strip with same pH range but different sample size

2.2.2 17 cm固相IPG膠條條件優(yōu)化 由7 cm膠條檢測(cè)pH值4～7的膠條膠點(diǎn)分布更均勻，因此17 cm膠條檢測(cè)上樣量即可。上樣量分別上樣200，250，300 μg。比較17 cm膠條和7 cm膠條雙向電泳后的凝膠電泳圖可知17 cm膠條的蛋白質(zhì)膠點(diǎn)在膠面上分散更均勻。圖7比較可知上樣量200 μg膠點(diǎn)最少，而且顏色最淺，跟上樣量過少不能完全平鋪有關(guān)。250 μg較之膠點(diǎn)更清晰，而300 μg較250 μg膠點(diǎn)更加清晰。因此，17 cm膠條pH值4～7的最佳上樣量是300 μg。

圖7 pH 4～7的17 cm 線性固相 IPG 膠條不同上樣量雙向電泳結(jié)果Fig.7 The gel picture of two-dimensional electrophoresis with different sample volume using pH 4-7 17 cm IPG strip

3 結(jié)論與討論

本研究確定了甜菜葉片蛋白質(zhì)雙向電泳最佳的提取方法，優(yōu)化了一向等電聚焦的條件，建立了甜菜葉片蛋白質(zhì)雙向電泳技術(shù)體系。為甜菜蛋白組學(xué)的研究提供了理論依據(jù)和參考。不同蛋白的提取方法直接影響了蛋白質(zhì)的提取效果，而且不同作物之間的蛋白質(zhì)的提取方法不同提取的蛋白質(zhì)效果也不盡相同。許多作物都對(duì)蛋白質(zhì)的提取方法及雙向電泳體系的優(yōu)化做了大量研究如棉花[14]、水稻[15]、大豆[16]、甘藍(lán)型油菜[17]、甜瓜[18]、油菜[19]等。研究結(jié)果表明，不同作物之間最佳的提取方法不盡相同。本研究選取了3種蛋白質(zhì)提取方法進(jìn)行比較研究，其中TCA/丙酮提取法獲得蛋白純度最高，濃度適中，更適合甜菜葉片蛋白質(zhì)的提取。其次是酚提取法，效果最差的是可溶性蛋白提取法。在雙向電泳條件優(yōu)化過程中本研究對(duì)IPG膠條的pH值、水化上樣量進(jìn)行了比較分析，發(fā)現(xiàn)雙向電泳結(jié)果凝膠染色后蛋白質(zhì)更多地集中在pH值4～7的區(qū)域，7 cm的IPG膠條水化上樣量150 μg蛋白質(zhì)膠點(diǎn)更加清晰，17 cm的IPG膠條水化上樣量300 μg蛋白膠點(diǎn)更加清晰。蛋白質(zhì)組學(xué)方法在近年來發(fā)展迅速，衍生了多種分析方法[20-21]。通過蛋白質(zhì)組學(xué)的研究更能清楚地研究某些特定的表達(dá)變化，因此蛋白組學(xué)研究具有重要的意義。甜菜蛋白組學(xué)開展相對(duì)較少，與甜菜雙向電泳體系不成熟有關(guān)，因此研究其中的試驗(yàn)方法和優(yōu)化條件也有重要的指導(dǎo)意義，為甜菜蛋白組學(xué)研究提供一定的理論依據(jù)和參考。

[1] 曹洪祥. 甜菜M14品系花器官特異表達(dá)蛋白質(zhì)的研究[D]. 哈爾濱：黑龍江大學(xué)，2009.

[2] 李國(guó)龍，吳海霞，孫亞卿，等. 甜菜葉片應(yīng)答干旱脅迫的差異蛋白質(zhì)組學(xué)分析[J]. 作物雜志，2015(5)：63-68.

[3] 王雪峰. 基于iTRAQ技術(shù)對(duì)甜菜塊根膨大蛋白質(zhì)組學(xué)的研究[D]. 呼和浩特：內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)，2016.

[4] 牛 佳. 甜菜細(xì)胞質(zhì)雄性不育系及其保持系花期蛋白差異表達(dá)分析[D]. 哈爾濱：哈爾濱工業(yè)大學(xué)，2013.

[5] 范慧艷. 甜菜壞死黃脈病毒侵染本生煙和大果甜菜的生物學(xué)，轉(zhuǎn)錄組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)研究[D]. 北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)，2014.

[6] Catusse J，Meinhard J，Job C，et al. Proteomics reveals potential biomarkers of seed vigor in sugarbeet[J]. Proteomics，2011，11(9)：1569-1580.

[7] Hajheidari M，Abdollahian-Noghabi M，Askari H，et al. Proteome analysis of sugar beet leaves under drought stress[J]. Proteomics，2005，5(4)：950-960.

[8] Yu B.Quantitative proteomics and phosphor proteomics of sugar beet monosomic addition line M14 in response to salt stress[J].J Proteomics，2016，143：286-297.

[9] Wesolowski W.Analysis of the mitochondrial proteome in cytoplasmic male-sterile and male-fertile beets[J].J Proteomics，2015,119：61-74.

[10] Damerval C，Vienne D D，Zivy M，et al. Technical improvement in two-dimensional electrophoresis increase the level of genetic variation detected in wheat-seedling protein[J]. Electrophoresis，1986，7(1)：53-54.

[11] Sarma A D，Oehrle N W，Emerich D W. Plant protein isolation and stabilization for enhanced resolution of two-dimensional polyacrylamide gel electrophoresis[J]. Analytical Biochemistry，2008，379(2)：192-195.

[12] 石海波，王云生，馮 勇，等. 玉米籽粒蛋白質(zhì)雙向電泳技術(shù)體系的優(yōu)化[J]. 華北農(nóng)學(xué)報(bào)，2015，30(1)：171-176.

[13] Bradford M M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding[J]. Analytical Biochemistry，1976，72：248-254.

[14] 韓吉春，崔海峰，時(shí)鵬濤，等. 棉花葉片雙向電泳體系的研究[J]. 棉花學(xué)報(bào)，2012，24(1)：27-34.

[15] 秦利征，趙全志，李俊周. 水稻根系蛋白質(zhì)提取方法的改良[J]. 分子植物育種，2013，11(4)：588-594.

[16] 鄭天慧，宋 波. 大豆花瓣蛋白雙向電泳分析技術(shù)體系的優(yōu)化[J]. 哈爾濱師范大學(xué)自然科學(xué)學(xué)報(bào)，2010，26(6)：75-80.

[17] 舒佳賓，文 李，官春云. 甘藍(lán)型油菜葉片蛋白質(zhì)雙向電泳體系優(yōu)化[J]. 作物研究，2012，26(4)：350-354.

[18] 鐘 俐，馬成梅. 甜瓜葉片中Rubisco的去除及雙向電泳體系的優(yōu)化[J]. 植物生理學(xué)報(bào)，2012，48(3)：303-309.

[19] 檀龍顏. 油菜種子萌發(fā)響應(yīng)脅迫的生理學(xué)與蛋白質(zhì)組學(xué)研究[D]. 哈爾濱：東北林業(yè)大學(xué)，2014.

[20] 陳劍成，沈少炎，蔡月琴，等. 凹葉厚樸葉片蛋白提取及雙向電泳體系的優(yōu)化[J]. 北方農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2017，45(2)：11-16.

[21] 尹 穩(wěn)，伏 旭，李 平. 蛋白質(zhì)組學(xué)的應(yīng)用研究進(jìn)展[J]. 生物技術(shù)通報(bào)，2014，31(1)：32-38.

OptimizationofTwoDimensionalElectrophoresisSystemofSugarBeet

ZHANG Hui1，2，BAI Chen2，WANG Huazhong3，ZHANG Huizhong2，LI Xiaodong2，F(xiàn)U Zengjuan2，ZHAO Shangmin2，E Yuanyuan2，ZHANG Ziqiang2，WANG Liang2

(1.Chinese Academy of Agricultural Sciences，Beijing 100081，China；2.Inner Mongolia Academy of Agricultural and Animal Husbandry Sciences，Huhhot 010031，China；3.Institute of Sugar Beet Research of Chinese Academy of Agricultural Sciences，Harbin 150080，China)

In order to obtain the best extraction method of protein in two-dimensional electrophoresis of beet leaves and establish the best two-dimensional electrophoresis system. It took beet leaves as material. To study the effects of the extraction methods of total protein，the pH value of IPG strip，and the corresponding amount of sample on the results of two-dimensional electrophoresis of sugar beet leaves through comparative analysis.The results showed that TCA/acetone extraction method was better than the phenol extraction method and soluble protein extraction method. Comparing IPG strip of pH 4-7 with pH 5-8 in two-dimensional electrophoresis：Protein spots with pH 4-7 were clear and distributed uniform in the spectra，no protein concentrated.It was more suitable for proteomics analysis of sugar beet leaves.Using the 7 cm linear phase IPG strip，protein spots with 150 μg sample volume increased obviously and was better. Using the 17 cm strip of pH 4-7 with 300 μg sample volume protein spots were more clear.The study provided the theoretical basis and reference for the study of sugar beet proteomics.

Sugar beet；Protein extraction method；Two-dimensional electrophoresis；System optimization

2017-07-25

內(nèi)蒙古自治區(qū)自然科學(xué)基金項(xiàng)目(2016MS0374)

張 輝(1985-)，男，河北滄縣人，助理研究員，在讀博士，主要從事甜菜遺傳育種研究。

白 晨(1959-)，男，內(nèi)蒙古呼和浩特人，研究員，碩士生導(dǎo)師，主要從事甜菜遺傳育種及分子育種研究。 王華忠(1957-)，男，遼寧西豐人，研究員，博士，博士生導(dǎo)師，主要從事甜菜遺傳育種與種質(zhì)資源創(chuàng)新研究。

S566.3

A

1000-7091(2017)05-0112-05

10.7668/hbnxb.2017.05.017