基于CSSL的水稻芽期耐鹽性QTL定位

趙春芳，張善磊，趙慶勇，周麗慧，趙 凌，姚 姝，張亞東，王才林

(江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 糧食作物研究所，江蘇省優(yōu)質(zhì)水稻工程技術(shù)研究中心，國家水稻改良中心南京分中心，江蘇 南京 210014)

基于CSSL的水稻芽期耐鹽性QTL定位

趙春芳，張善磊，趙慶勇，周麗慧，趙 凌，姚 姝，張亞東，王才林

(江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 糧食作物研究所，江蘇省優(yōu)質(zhì)水稻工程技術(shù)研究中心，國家水稻改良中心南京分中心，江蘇 南京 210014)

水稻耐鹽遺傳位點(diǎn)的發(fā)掘可為其耐鹽遺傳機(jī)制的研究提供理論基礎(chǔ)，為耐鹽品種培育提供基因資源。利用一套以9311為背景親本導(dǎo)入了日本晴染色體片段的染色體片段置換系(CSSL)為試驗(yàn)材料，對芽期耐鹽性進(jìn)行快速鑒定，并分析了耐鹽QTLs。結(jié)果表明，9個(gè)CSSLs表現(xiàn)出顯著耐鹽性，經(jīng)過遺傳背景的高密度分子標(biāo)記檢測，利用代換作圖方法定位到4個(gè)芽期耐鹽相關(guān)QTLs，分別位于水稻第1，2，4和11號(hào)染色體上，命名為qSAT1、qSAT2、qSAT4和qSAT11，其中qSAT1在含4個(gè)重疊片段的CSSLs中被檢測到，其余3個(gè)QTLs均在含2個(gè)重疊置換片段的CSSLs中被檢測到，經(jīng)比較發(fā)現(xiàn)4個(gè)QTLs與已克隆水稻耐鹽基因均不在同一染色體區(qū)間，說明為新的耐鹽基因候選位點(diǎn)。結(jié)果對進(jìn)一步發(fā)掘和利用新的水稻耐鹽QTL具有重要意義。

水稻；芽期；耐鹽；QTL

鹽脅迫是農(nóng)作物生長發(fā)育及產(chǎn)量提高的重要限制因素之一。水稻為中度感鹽作物，在鹽堿地上生長受到抑制，當(dāng)土壤中可溶性鹽達(dá)到0.3%時(shí)即表現(xiàn)受害癥狀。因此，挖掘和利用耐鹽種質(zhì)資源，培育耐鹽水稻品種，對于高效利用鹽堿地、保障全國糧食安全具有重要意義。

水稻的耐鹽性為典型的數(shù)量性狀遺傳，受多基因協(xié)同控制并受到外界環(huán)境和發(fā)育時(shí)期的影響[1]，可以利用數(shù)量性狀的定位群體及其分子標(biāo)記連鎖圖譜，對耐鹽性狀進(jìn)行基因定位。關(guān)于水稻耐鹽性狀數(shù)量遺傳的研究已有很多報(bào)道，其中苗期耐鹽QTL定位的報(bào)道較多，已檢測到與幼苗存活天數(shù)、鹽害級別及莖干Na+/K+濃度等多種性狀的70多個(gè)QTLs[2]，位于第1，2，6和7號(hào)染色體上的較多，位于第10和11號(hào)染色體上的較少，但目前為止僅有少數(shù)耐鹽基因被克隆。SKC1是第一個(gè)被克隆的耐鹽基因，位于第1號(hào)染色體上，編碼細(xì)胞膜定位的Na+轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，在Na+循環(huán)中起重要作用。當(dāng)水稻處于高鹽環(huán)境時(shí)，莖稈會(huì)積累大量Na+，SKC1蛋白可將莖稈中過量Na+回運(yùn)至根系，從而減輕Na+毒害，增強(qiáng)水稻對高鹽環(huán)境的耐性[3]。另一個(gè)克隆的耐鹽基因DST位于第3號(hào)染色體上，是利用圖位克隆方法從耐鹽突變體中克隆到一個(gè)新型鋅指轉(zhuǎn)錄因子，對水稻耐鹽性及耐旱性具有負(fù)調(diào)控作用。該基因突變后導(dǎo)致過氧化氫代謝基因表達(dá)下降，使過氧化氫在保衛(wèi)細(xì)胞中的超積累，造成氣孔關(guān)閉，水分蒸發(fā)減少，從而表現(xiàn)出耐鹽或耐旱表型[4]。最新研究發(fā)現(xiàn)DST能夠與自身物理互作，同時(shí)與DCA1形成異源四聚體，這個(gè)轉(zhuǎn)錄復(fù)合物能夠調(diào)控編碼H2O2清除因子的Prx24基因的表達(dá)，從而正向調(diào)控氣孔孔徑大小和氣孔中H2O2含量，最終影響植株的脅迫耐受性，認(rèn)為抑制DCA1-DST功能互作能提高多種作物的耐鹽性和耐旱性[5]。HST1 (Os06g0183100)是最近報(bào)道的耐鹽基因，編碼一個(gè)B型反應(yīng)調(diào)節(jié)蛋白OsRR22，參與調(diào)節(jié)滲透或離子轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)基因的表達(dá)，其耐鹽程度強(qiáng)于SKC1基因，在日本品種的耐鹽性改良上具有很高的利用價(jià)值[6]。

盡管已經(jīng)定位了眾多耐鹽QTLs，克隆了幾個(gè)耐鹽基因，但是真正用于耐鹽品種培育上的基因資源尚少，一方面是由于攜帶耐鹽QTL的載體材料受遺傳背景的影響很大，定位到的QTL很難直接應(yīng)用于育種材料耐鹽性的遺傳改良；另一方面已克隆的耐鹽基因具有多效性，導(dǎo)入耐鹽基因的同時(shí)產(chǎn)生了不利的表型性狀。為了篩選更多的耐鹽基因資源，消除遺傳背景對水稻耐鹽QTL定位的影響，本研究利用一套以秈稻品種9311為受體、粳稻品種日本晴為供體的染色體片段置換系(Chromosome segment substitution line，CSSL)為試驗(yàn)材料，將處于萌發(fā)期的種子進(jìn)行芽期耐鹽處理，以幼芽成活率作為耐鹽檢測指標(biāo)，進(jìn)行了耐鹽株系簡單快速地篩選，并初步定位和分析了耐鹽QTL，以期獲得新的耐鹽遺傳位點(diǎn)。

1 材料和方法

1.1試驗(yàn)材料

本研究所用染色體片段置換系群體是以秈稻品種9311為受體親本，粳稻品種日本晴為供體親本，經(jīng)雜交、多代回交至BC4F1，而后利用水稻基因組上均勻分布的SSR標(biāo)記對BC4F1單株進(jìn)行基因型檢測，選擇含少量雜合片段的單株進(jìn)行種植，得到BC4F2群體，經(jīng)自交純合后獲得染色體片段置換系群體，該套置換系共包含119個(gè)株系[7]。根據(jù)物理圖譜[8]，日本晴置換片段覆蓋了水稻全基因組的83.98%，目前利用該群體已定位了重金屬及氮磷養(yǎng)分脅迫等多個(gè)重要性狀QTLs[9-11]，獲得了一批新的具有育種利用價(jià)值的遺傳位點(diǎn)。

1.2水稻芽期耐鹽性鑒定

將119個(gè)置換系及親本種子浸沒于自來水中，在30 ℃恒溫培養(yǎng)箱中萌發(fā)2 d至種子露白，而后催芽20 h至露出芽尖。親本及各置換系各挑選100粒露芽種子，放置于墊有濾紙的培養(yǎng)皿中，加入0.8%(m/V)的NaCl溶液至淹沒種子，蓋好培養(yǎng)皿蓋子，置于30 ℃光照培養(yǎng)箱內(nèi)進(jìn)行芽期鹽脅迫處理。鹽溶液處理10 d后，用蒸餾水沖洗種子，并于蒸餾水中再培養(yǎng)5 d，統(tǒng)計(jì)每皿中幼芽成活粒數(shù)，計(jì)算幼芽成活百分率。鹽脅迫處理設(shè)置3次生物學(xué)重復(fù)，每次生物學(xué)重復(fù)中每份材料設(shè)置3個(gè)重復(fù)，以3次生物學(xué)重復(fù)得到的幼芽成活率的平均值作為統(tǒng)計(jì)值。

1.3置換片段分析

根據(jù)該置換系的物理圖譜(含250個(gè)分子標(biāo)記)，對篩選到的耐鹽系中的置換片段進(jìn)行全基因組檢測，獲得其置換片段的分子生物學(xué)信息。置換片段的長度按Young和Tanksley[12]的方法進(jìn)行計(jì)算。在不考慮2個(gè)相鄰標(biāo)記間發(fā)生雙交換事件的情況下，當(dāng)相鄰標(biāo)記基因型均為供體親本基因型時(shí)，認(rèn)為這2個(gè)標(biāo)記之間的區(qū)段為供體置換片段。而后在每個(gè)置換片段兩端增加分子標(biāo)記進(jìn)行檢測，直至親本間多態(tài)性標(biāo)記表現(xiàn)為受體親本的純合基因型為止。最后，以置換片段末端標(biāo)記基因型與相鄰的受體純合基因型標(biāo)記之間的中點(diǎn)為該末端邊界點(diǎn)，兩末端邊界點(diǎn)之間的距離即置換片段長度。

1.4QTL定位

利用代換作圖方法進(jìn)行QTL定位[13]，如果在含有重疊置換片段的不同CSSL上均檢測到QTL，且遺傳效應(yīng)方向一致，則認(rèn)為QTL存在于各置換片段的重疊片段上；如果在一個(gè)CSSL中檢測到QTL，而在具有重疊置換片段的另一CSSL中未檢測到，則認(rèn)為QTL位于2個(gè)置換片段的非重疊區(qū)段上。QTL命名遵循McCouch等[14]制定的原則。

2 結(jié)果與分析

2.1親本及置換系芽期耐鹽的表型分析

通過對鹽脅迫處理后CSSL及親本種子的幼芽成活率統(tǒng)計(jì)分析，兩親本間存在極顯著差異(P<0.01)，親本9311的幼芽成活率為15.8%，甚至出現(xiàn)零幼芽成活的現(xiàn)象，而供體親本日本晴的幼芽成活率為76.2%，表現(xiàn)出較強(qiáng)的芽期耐鹽能力(圖1-A)。CSSL群體幼芽成活率集中在20%～60%，平均值為38.9%，變異范圍為5.1%～93.2%，表現(xiàn)為單峰連續(xù)分布和超親分離現(xiàn)象(圖1-B)。其中CSSL群體中有9個(gè)CSSLs的幼芽成活率在70%以上，表現(xiàn)出明顯的耐鹽性(圖1-A)，此部分置換系可作為攜帶耐鹽基因的材料進(jìn)行QTL分析。

A.親本及2個(gè)耐鹽置換系的表型；B.幼芽成活率在置換系群體中的頻率分布。A.Phenotype of parents and two CSSLs associated with salt tolerance；B. Frequency distribution of seedling survival rate in the CSSL population.

2.2耐鹽置換系的遺傳背景檢測

利用250個(gè)水稻基因組上均勻分布的多態(tài)SSR/STS標(biāo)記，以9311和日本晴為對照，對9個(gè)耐鹽CSSLs的遺傳背景進(jìn)行全基因組檢測。結(jié)果表明，9個(gè)CSSLs共含有13個(gè)置換片段，4個(gè)CSSLs(CSSL4、CSSL27、CSSL81和CSSL105)含有置換片段為2個(gè)，其余5個(gè)CSSLs(CSSL12、CSSL26、CSSL30、CSSL47和CSSL88)均為單片段置換系。圖2顯示了日本晴置換片段在水稻12條染色體上的分布。

黑框表示日本晴置換片段；雙線表示受體親本9311基因組。Black boxes indicate substituted segments of Nipponbare；Double lines indicate the genome of the recipient 9311.

2.3水稻芽期耐鹽QTL的代換作圖

通過對9個(gè)耐鹽CSSLs攜帶的置換片段分析，采用重疊片段的代換作圖法共檢測出4個(gè)QTLs：qSAT1、qSAT2、qSAT4和qSAT11，分別位于水稻第1，

A.qSAT1代換作圖；B.qSAT2代換作圖；C.qSAT4代換作圖；D.qSAT11代換作圖。A.Substitution mapping of qSAT1；B.Substitution mapping of qSAT2；C.Substitution mapping of qSAT4；D.Substitution mapping of qSAT11.

染色體右側(cè)為分子標(biāo)記名稱；左側(cè)數(shù)字表示物理距離(單位為Mb)。The molecular markers are in the right side of chromosomes and their corresponding physical distance are in the left side.

2，4，11染色體上。qSAT1在CSSL4、CSSL12、CSSL27和CSSL88中均被檢測到，表明其位于重疊置換片段上，即qSAT1被定位于第1染色體的RM1232～RM319，物理距離為7.2 Mb的區(qū)段內(nèi)(圖3-A)。qSAT2在CSSL26和CSSL30中被檢測到，而在與其有重疊關(guān)系的CSSL23中未被檢測到，表明其位于與CSSL26和CSSL30重疊而與CSSL23非重疊的片段上，即qSAT2被定位在第2染色體RM530～RM7286，物理距離為4.1 Mb的區(qū)段內(nèi)(圖3-B)。qSAT4在CSSL47和CSSL81中被檢測到，表明其位于兩者的重疊置換片段上，即qSAT4被定位在第4染色體RM6748～RM348，物理距離為3.5 Mb的區(qū)段內(nèi)(圖3-C)。qSAT11在CSSL27和CSSL105中被檢測到，而在與其有重疊關(guān)系的CSSL35中為被檢測到，表明其位于與CSSL27和CSSL105重疊而與CSSL35非重疊的片段上，即qSAT11被定位在第11染色體S11-10.51～S11-13.31，物理距離為5.4 Mb的區(qū)段內(nèi)(圖3-D)，值得注意的是，CSSL27同時(shí)攜帶了qSAT1和qSAT11，其耐鹽強(qiáng)度高于攜帶單個(gè)QTL的系。圖4綜合了4個(gè)芽期耐鹽QTLs在該置換系群體物理圖譜上的分布及物理位置。

3 討論

關(guān)于水稻對鹽脅迫生理生化反應(yīng)的研究，已有較多報(bào)道，一般來說，當(dāng)水稻受到高鹽脅迫時(shí)，攝取外界水分的能力受到抑制，細(xì)胞處于脫水狀態(tài)，從而導(dǎo)致生長發(fā)育延緩甚至死亡[15]。目前，水稻耐鹽性研究主要集中在苗期階段，而芽期、生殖期及成熟期相對較少[16-17]，其中苗期考察的性狀較多，主要有鹽脅迫下存活天數(shù)、鹽害級別和Na+、K+濃度等[18-20]。但是，芽期耐鹽是保障水稻全生育期耐鹽的先決條件，特別是在水稻栽培逐漸轉(zhuǎn)向直播種植的趨勢下，對水稻芽期耐鹽性的鑒定具有必要性。對于芽期耐鹽的衡量指標(biāo)，郭望模等[21]認(rèn)為鹽脅迫對水稻芽期的直接傷害是降低發(fā)芽率，可以用鹽處理后的發(fā)芽率作為芽期耐鹽檢測指標(biāo)。本研究統(tǒng)一選取已露芽的種子進(jìn)行連續(xù)10 d的鹽脅迫處理，一方面去除了發(fā)芽率和發(fā)芽勢的影響，另一方面長時(shí)間的鹽脅迫造成了幼芽死亡，因此選用幼芽成活率作為耐鹽指標(biāo)，相比以往的根長、苗高等測量指標(biāo)更簡單快捷。統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明，9311和日本晴兩親本的幼芽成活率分別為15.8%和76.2%，表現(xiàn)為鹽敏感和高度耐鹽。CSSL群體的耐鹽性呈現(xiàn)典型的正態(tài)分布，篩選到9個(gè)CSSLs的幼芽成活率在70%以上，說明以幼芽成活率作為芽期耐鹽指標(biāo)，適合對該置換系群體進(jìn)行芽期耐鹽性鑒定。

染色體片段置換系群體是在初級作圖群體基礎(chǔ)上通過雜交篩選到的次級分離群體，其遺傳背景接近于受體基因組，僅含有少量的供體親本的染色體片段，因而可以對控制目標(biāo)性狀的遺傳位點(diǎn)進(jìn)行簡單、準(zhǔn)確地定位，并便于對QTL進(jìn)一步確證及在標(biāo)記輔助選擇的育種利用。本研究通過對篩選到的9個(gè)芽期耐鹽CSSLs進(jìn)行遺傳背景檢測和代換作圖法檢測到4個(gè)QTLs，分別位于水稻第1，2，4，11染色體上，將其與以往定位結(jié)果進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)位于第1染色體RM1232～RM319區(qū)間上的qSAT1與汪斌等[22]定位的地上部Na+含量QTL具有相同的染色體區(qū)間；位于第2染色體的RM530～RM7286區(qū)間上的qSAT2與以往定位的幼苗存活天數(shù)、莖干中Na+、K+濃度等多個(gè)耐鹽性狀QTLs具有相同的位置[18，23]。其余2個(gè)耐鹽QTLs與以往的定位結(jié)果均不相同，為本研究鑒定的新QTLs。目前為止，水稻的耐鹽性QTL定位已經(jīng)進(jìn)行了大量的研究，但是不同實(shí)驗(yàn)室利用不同群體的定位結(jié)果重現(xiàn)率較低[19]，這可能是由于遺傳材料的親本、群體類型以及定位群體遺傳背景不同而影響了定位結(jié)果的準(zhǔn)確性；也可能是水稻芽期或苗期耐鹽性易受到鹽處理濃度及時(shí)間的影響，造成了性狀調(diào)查時(shí)偏差較大；當(dāng)然，耐鹽性與所處發(fā)育時(shí)期亦有直接關(guān)系。另外，以往檢測到的芽期或幼苗期耐鹽性狀QTLs的表型貢獻(xiàn)率都不大[1，19，24]，進(jìn)一步說明了這些QTL的準(zhǔn)確性和精確度較低，很難進(jìn)行育種利用。而本研究方法篩選到的材料具有極其明顯的芽期耐鹽性，特別是CSSL27因攜帶了2個(gè)耐鹽QTL而具有更高的耐鹽性，因此真實(shí)性較高，后續(xù)可以考慮配制分離群體進(jìn)行進(jìn)一步驗(yàn)證并對QTL進(jìn)行精細(xì)定位。本研究未鑒定到已克隆的水稻耐鹽基因OsSKC1、DST、HST1，可能主要是由于這些基因在兩親本9311和日本晴間沒有序列或基因表達(dá)差異的原因。

目前，科學(xué)家們對不同發(fā)育時(shí)期水稻耐鹽性的認(rèn)識(shí)存在較大爭議，一些研究者認(rèn)為水稻芽期、苗期及成熟期的耐鹽性具有一定的相關(guān)性[25-26]，而有些研究者認(rèn)為同一水稻品種的耐鹽能力在芽期和苗期表現(xiàn)不一致，兩者相關(guān)性很低[27-28]。本研究對置換系群體芽期階段的耐鹽性遺傳鑒定僅提供了初步數(shù)據(jù)，包括苗期、生殖期及成熟期在內(nèi)的全生育期耐鹽性鑒定更能增加該套置換系群體耐鹽性的真實(shí)性，特別是對本研究篩選到的高耐鹽品系的全生育期耐鹽性還需要進(jìn)行進(jìn)一步的探討。

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MappingofQTLsforBud-stageSalinityToleranceBasedonChromosomeSegmentSubstitutionLineinRice

ZHAO Chunfang，ZHANG Shanlei，ZHAO Qingyong，ZHOU Lihui，ZHAO Ling，YAO Shu，ZHANG Yadong，WANG Cailin

(Institute of Food Crops，Jiangsu Academy of Agricultural Sciences，Jiangsu High Quality Rice Research and Development Center，Nanjing Branch of Chinese National Center for Rice Improvement，Nanjing 210014，China)

The identification of salt tolerant genetic loci in rice can provide study basis for the molecular mechanism of salt tolerance，and gene resources for improving salt tolerant cultivars.A set of chromosome segment substitution lines (CSSLs) developed from two sequenced rice cultivars：theindicavariety 9311 as the recipient and thejaponicavariety Nipponbare as a donor were used to detect for salt tolerance in bud stage quickly，and to locate QTLs related to salt tolerance.9 CSSLs showed significant salt tolerance and 4 QTLs were mapped by genetic background detection based on high density molecular markers and the substitution mapping.These 4 QTLs located on rice chromosomes 1，2，4 and 11 chromosomes，designated asqSAT1，qSAT2，qSAT4 andqSAT11.qSAT1 was detected in 4 CSSLs containing over lapping fragments，while the other 3 QTLs were detected in 2 CSSLs.These QTLs were not included in the same chromosome interval as the cloned rice salt tolerance genes，and thus were described as new candidate gene loci associated with bud-stage salt tolerance.The results supplies important information for further exploration and utilization of new salt tolerant QTL in rice.

OryzasativaL.；Bud stage；Salt tolerance；QTL

2017-07-06

國家科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目(2015BAD01B02)；江蘇省重點(diǎn)研發(fā)項(xiàng)目(BE2016370)；現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項(xiàng)基金項(xiàng)目(CARS-01-62)

趙春芳(1981-)，女，山東聊城人，副研究員，博士，主要從事水稻遺傳育種研究。

王才林(1959-)，男，江蘇無錫人，研究員，博士，博士生導(dǎo)師，主要從事水稻遺傳育種研究。

S511.03

A

1000-7091(2017)05-0106-06

10.7668/hbnxb.2017.05.016