低溫脅迫下杜鵑雜交后代優(yōu)良株系的轉(zhuǎn)錄組分析

吳月燕，明 萌，2，何靜雯，2，盧 丹，沈梓力，邱 甜，吳燕燕，謝曉鴻

(1.浙江萬(wàn)里學(xué)院 生物與環(huán)境學(xué)院，浙江 寧波 315100；2.上海海洋大學(xué) 水產(chǎn)與生命學(xué)院，上海 201306)

低溫脅迫下杜鵑雜交后代優(yōu)良株系的轉(zhuǎn)錄組分析

吳月燕1，明 萌1，2，何靜雯1，2，盧 丹1，沈梓力1，邱 甜1，吳燕燕1，謝曉鴻1

(1.浙江萬(wàn)里學(xué)院 生物與環(huán)境學(xué)院，浙江 寧波 315100；2.上海海洋大學(xué) 水產(chǎn)與生命學(xué)院，上海 201306)

為探索杜鵑抗寒的分子機(jī)制，篩選抗寒相關(guān)基因，利用人工模擬低溫，以杜鵑雜交后代優(yōu)良株系繁景-6 ℃(T)處理和25 ℃(CK)對(duì)照為試驗(yàn)材料，進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序和數(shù)據(jù)從頭組裝及生物信息學(xué)分析，通過(guò)組裝得到 Unigenes序列122 654個(gè)，功能注釋結(jié)果顯示，有大量Unigenes可以注釋到基因本體(GO)和蛋白質(zhì)直系同源數(shù)據(jù)庫(kù)(COG) 等數(shù)據(jù)庫(kù)上，部分Unigenes無(wú)匹配信息，可能為杜鵑特有的基因序列。按GO功能分類，繁景杜鵑中的 Unigenes分為細(xì)胞組分、分子功能以及生物學(xué)過(guò)程3類，包括51個(gè)分支，其中有大量的Unigenes與代謝進(jìn)程、催化活性和細(xì)胞進(jìn)程相關(guān)。上調(diào)差異表達(dá)基因有6 347個(gè)，下調(diào)差異表達(dá)基因4 482個(gè)。通過(guò)對(duì)轉(zhuǎn)錄結(jié)果中差異表達(dá)顯著的4個(gè)轉(zhuǎn)錄因子家族中的24個(gè)基因，其中，上調(diào)12個(gè)，下調(diào)12個(gè)，在低溫脅迫下的表達(dá)水平驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)其與轉(zhuǎn)錄結(jié)果基本一致，證明該轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)可靠。

杜鵑；低溫脅迫；轉(zhuǎn)錄組；抗寒基因

杜鵑花(Rhododendron)，是杜鵑花科(Ericaceae)杜鵑花屬(RhododendronL.)多種植物的總稱，又稱山躑躅、山石榴、映山紅，是常綠或落葉灌木[1-2]，為浙江省重要的綠化植物。但由于受氣候條件等影響，只能用品種較單一，花色較為單調(diào)，花期大多在4-5月中下旬較為耐寒的杜鵑品種。以毛鵑春如意為母本、毛鵑琉球紅為父本進(jìn)行雜交育種，獲得246株雜交后代，篩選后得到一雜交后代的優(yōu)良株系，暫命名為繁景，其花期為4月上旬，略早于大部分浙江省綠化杜鵑品種，花4～6朵簇生于枝端，花朵豐富，花色為深粉紅色，花色較為少見(jiàn)。但是，大多數(shù)年份，浙江部分地區(qū)年極端低溫為-2～-5 ℃，部分品種杜鵑會(huì)出現(xiàn)凍害現(xiàn)象。因此，繁景杜鵑抗寒性的研究，對(duì)其栽培和生產(chǎn)具有重要的理論指導(dǎo)意義。

目前，對(duì)于杜鵑耐寒的研究報(bào)道比較少，主要研究在低溫脅迫下葉片的相對(duì)電導(dǎo)率、丙二醛(MDA)含量、過(guò)氧化物酶(POD)活性等生理指標(biāo)的變化情況[3-7]，還沒(méi)有相應(yīng)杜鵑轉(zhuǎn)錄組測(cè)序等方面的研究報(bào)道。轉(zhuǎn)錄組測(cè)序是指生物在特定環(huán)境和狀態(tài)下總RNA的變化情況，是連接基因組遺傳信息與生物功能蛋白質(zhì)組的紐帶[8]，對(duì)于缺乏基因組信息的物種，采用轉(zhuǎn)錄組測(cè)序可獲得大量的數(shù)據(jù)信息，有助于挖掘重要功能基因和植物優(yōu)良性狀研究的開(kāi)展，因此，對(duì)杜鵑轉(zhuǎn)錄組的測(cè)序研究具有重要的意義。本試驗(yàn)以一年生繁景植株為材料，通過(guò)對(duì)低溫脅迫下繁景杜鵑轉(zhuǎn)錄組的分析，為該杜鵑雜交后代優(yōu)良株系，作為綠化材料在浙江以及環(huán)境相似地區(qū)的推廣、新品種的選育和栽培模式提供理論依據(jù)，為杜鵑的分子育種及品種改良提供了一定的理論基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1試驗(yàn)材料

供試杜鵑(Rhododendronsp.)材料來(lái)源于寧波市北侖區(qū)柴橋鎮(zhèn)杜鵑花基地。試驗(yàn)于2015年12月-2016年5月在浙江萬(wàn)里學(xué)院實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。試驗(yàn)隨機(jī)選擇了36株生長(zhǎng)健壯、形態(tài)大小基本一致的繁景杜鵑。通過(guò)之前生理指標(biāo)檢測(cè)及對(duì)超微結(jié)構(gòu)的觀察，確定測(cè)序條件和時(shí)間點(diǎn)，繁景杜鵑耐受的最低溫度為-6 ℃，且在-6 ℃處理24 h后各項(xiàng)生理指標(biāo)達(dá)到最大值，因此以-6 ℃低溫為處理(T)，以25 ℃處理為對(duì)照(CK)，處理24 h，每個(gè)處理6株，共設(shè)3組生物學(xué)重復(fù)。2016年1月12-14日，放入低溫生化培養(yǎng)箱進(jìn)行人工低溫處理，生化培養(yǎng)箱內(nèi)處理與對(duì)照除溫度不同，光照和水分等環(huán)境因素保持一致，空氣相對(duì)濕度為70%～80%[9]，光照為216 μmol/(m2·s)，光周期12 h/12 h (晝/夜)，處理24 h后進(jìn)行采樣。每次采樣隨機(jī)選取數(shù)片頂端葉片，置于超低溫冰箱中備用。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1 RNA的質(zhì)量檢測(cè) 按OMEGA試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行杜鵑總RNA的提取。濃度檢測(cè)方法：用NanoDrop分光光度計(jì)測(cè)定所抽提RNA樣品的A260、A280值，計(jì)算樣品濃度；樣品完整性檢測(cè)方法：1.0%變性瓊脂糖凝膠電泳定性檢測(cè)。

1.2.2 All-unigenes的統(tǒng)計(jì)與組裝 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序由杭州晶佰生物科技有限公司完成，每個(gè)測(cè)序樣品重復(fù)一次，經(jīng)測(cè)序質(zhì)量控制，各樣品堿基準(zhǔn)確Q20的百分比均大于98%，GC含量不超過(guò)50%，測(cè)序數(shù)據(jù)可用于組裝。

1.2.3 All-unigenes的功能注釋 通過(guò)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序平臺(tái)，對(duì)不同樣品的Unigenes進(jìn)行差異表達(dá)基因分析，并將差異表達(dá)基因與GO、COG、KEGG、COG等數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，整理出對(duì)應(yīng)基因的功能、通路和富集情況等。

1.2.4 低溫脅迫下基因的表達(dá) 根據(jù)|log2ratio|≥1，F(xiàn)DR≤0.001基因在樣品間的篩選標(biāo)準(zhǔn)，分別找出在不同樣本間表達(dá)量上調(diào)高和表達(dá)量下調(diào)高的基因，基因的表達(dá)量代表低溫脅迫下的基因表達(dá)差異。

1.2.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析 定量檢測(cè)利用STBR試劑盒，選擇差異表達(dá)顯著的4個(gè)轉(zhuǎn)錄因子ALDH、ERF、MYB和bHLH家族中的24個(gè)轉(zhuǎn)錄因子(上調(diào)和下調(diào)各12個(gè))和內(nèi)參基因EF-1-α(GenBank Accession為L(zhǎng)N829627.1)，用Primer Premier 5軟件設(shè)計(jì)引物，如表1所示，進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析。用2-ΔΔCT算法計(jì)算待測(cè)基因的相對(duì)表達(dá)量[10]。每組樣品3個(gè)生物學(xué)重復(fù)，每個(gè)反應(yīng)各設(shè)一組空白對(duì)照(cDNA模板空白)。

2 結(jié)果與分析

2.1繁景杜鵑葉片處理和對(duì)照的表型變化

觀測(cè)CK與T的36株繁景杜鵑，隨機(jī)摘取若干片頂端葉片，如圖1所示，在低溫處理下，葉片的顏色加深，并出現(xiàn)輕微的褶皺。

2.2RNA的質(zhì)量檢測(cè)

按OMEGA試劑盒說(shuō)明書提取總RNA，用Nano Drop核酸蛋白儀測(cè)定RNA樣品的濃度及樣品在260，280 nm波長(zhǎng)下OD值的比值，并用瓊脂糖凝膠電泳定性檢測(cè)所抽提的RNA質(zhì)量。如表2所示，2組RNA完整度均較好，均符合文庫(kù)構(gòu)建要求。處理與對(duì)照各3個(gè)生物學(xué)重復(fù)，用于RNA-Seq轉(zhuǎn)錄組測(cè)序。

表1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR所用的引物Tab.1 Reaction sequences of primers used in Real-time PCR

圖1 繁景杜鵑葉片處理和對(duì)照的表型變化Fig.1 The phenotypic changes of leaf treatment and control in Fanjing Rhododendron

2.3測(cè)序數(shù)據(jù)的產(chǎn)出與組裝

每個(gè)測(cè)序樣品經(jīng)測(cè)序質(zhì)量控制，如表3所示各樣品質(zhì)量不低于20的堿基(Q20)的百分比均大于98%，堿基G和C數(shù)占總堿基數(shù)的比例(GC含量)不超過(guò)50%，測(cè)序數(shù)據(jù)可用于組裝[11]。如表4所示，組裝結(jié)果總Unigenes 122 654個(gè)，總長(zhǎng)78 017 305 nt，平均長(zhǎng)度636 nt，N50為1 018 nt。

2.4Contig和Unigenes的長(zhǎng)度分布

如圖2所示，通過(guò)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序獲得大量的序列，且組裝后Conting和Unigenes的長(zhǎng)度增加，表明組裝的效果較好，可進(jìn)一步開(kāi)展后續(xù)分析。

2.5功能注釋和分類

基因本體論(簡(jiǎn)稱GO)是一種國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)化的基因功能分類系統(tǒng)，用來(lái)定義生物體中基因和基因產(chǎn)物。通過(guò)GO 數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)繁景杜鵑的 Unigenes進(jìn)行功能分類，從宏觀上了解杜鵑低溫脅迫下，表達(dá)基因的功能分布特征[12]。GO分為3個(gè)本體，分別是基因的分子功能、所處的細(xì)胞位置、參與的生物過(guò)程。研究結(jié)果表明，注釋到GO數(shù)據(jù)庫(kù)的44 534個(gè)Unigenes可劃分為 51個(gè)功能組，并對(duì)每一個(gè)功能組涉及的Unigenes進(jìn)行了歸類分析。如圖3所示，注釋到GO數(shù)據(jù)庫(kù)的44 534個(gè)Unigenes可劃分為 51個(gè)功能組， 21個(gè)功能組共13 516(47.8%)個(gè)Unigenes歸屬于參與的生物過(guò)程， 16個(gè)功能組共9 460(33.5%)個(gè)Unigenes歸屬于細(xì)胞組分， 14個(gè)功能組共5 294(18.7%)個(gè)Unigenes歸屬于分子功能。其中，在上調(diào)和下調(diào)表達(dá)的基因中，細(xì)胞進(jìn)程、代謝進(jìn)程、單生物進(jìn)程、催化活性、結(jié)合活性和糖酵解功能組中涉及的Unigenes較多，而生物黏附、胞外基質(zhì)部分、類核、鳥(niǎo)嘌呤核苷酸交換因子活性、營(yíng)養(yǎng)庫(kù)活性和蛋白標(biāo)簽功能組中涉及的Unigenes較少。

表2 繁景杜鵑RNA質(zhì)檢結(jié)果Tab.2 RNA quality inspection results of Fanjing Rhododendron

表3 繁景杜鵑轉(zhuǎn)錄組測(cè)序的產(chǎn)出量Tab.3 Transcriptome sequencing yield statistics of Fanjing Rhododendron

表4 繁景杜鵑基因序列組裝統(tǒng)計(jì)結(jié)果Tab.4 Statistical results of gene sequence assembly of Fanjing Rhododendron

圖2 繁景杜鵑基因序列組裝的Contigs和Unigenes的長(zhǎng)度分布Fig.2 Length distribution of Contigs and Unigenes in gene sequence assembly of Fanjing Rhododendron

圖3 繁景杜鵑Unigenes的GO分類Fig.3 Fanjing Rhododendron GO classification of Unigenes

2.6Unigenes的COG功能分類

蛋白質(zhì)直系同源數(shù)據(jù)庫(kù)(Cluster of orthologous groups，COG)是對(duì)基因產(chǎn)物進(jìn)行直系同源分類的數(shù)據(jù)庫(kù)。所有組成COG的蛋白都被暫且認(rèn)為源于同一個(gè)蛋白，這個(gè)源蛋白可能是orthologs也可能是paralogs[13-14]。將繁景杜鵑Unigenes比對(duì)到COG 數(shù)據(jù)庫(kù)上，對(duì)Unigenes的功能進(jìn)行預(yù)測(cè)和分類統(tǒng)計(jì)。得知，繁景杜鵑的 81 850 個(gè)Unigenes根據(jù)其功能大致可分為 25 類，并對(duì)每一類的Unigenes進(jìn)行了統(tǒng)計(jì)分析。如圖4所示，Unigenes涉及的COG功能類別比較全面，涉及了大多數(shù)的生命活動(dòng)。其中一般功能預(yù)測(cè)類基因最多(12 084個(gè))，翻譯、核糖體結(jié)構(gòu)與生物合成類基因(8 682個(gè))等也較多；而核酸結(jié)構(gòu)類基因(16個(gè))、胞外結(jié)構(gòu)基因(89個(gè))較少；其他類別基因表達(dá)各不相同。

2.7KEGG通路分析

KEGG是系統(tǒng)分析基因產(chǎn)物在細(xì)胞中的代謝途徑以及基因產(chǎn)物功能的數(shù)據(jù)庫(kù)。根據(jù) KEGG 數(shù)據(jù)庫(kù)的注釋信息能進(jìn)一步得到Unigenes的Pathway注釋[15]。結(jié)合KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)，對(duì)繁景杜鵑的52 057個(gè)Unigenes參與或涉及的代謝途徑進(jìn)行了統(tǒng)計(jì)分析。如圖5所示，可將繁景杜鵑Unigenes歸屬于 5大類的代謝途徑，主要包括代謝途徑和次生代謝產(chǎn)物合成、能量代謝；蛋白折疊、脂類物質(zhì)代謝；碳水化合物代謝；氨基酸代謝；分類和降解、轉(zhuǎn)錄與翻譯、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等。

將 KEGG pathway 數(shù)據(jù)庫(kù)作為參考，可將Unigenes定位到 128 個(gè)具體的代謝途徑分支。其中，在上調(diào)和下調(diào)表達(dá)的基因中，主要涉及能量代謝的基因，蛋白折疊分類和降解途徑的基因，核苷酸代謝途徑基因，轉(zhuǎn)錄與翻譯的基因以及運(yùn)輸和代謝途徑的基因等。

A.RNA的加工與修飾;B.染色體結(jié)構(gòu)與動(dòng)力學(xué)；C.能量產(chǎn)生和轉(zhuǎn)換；D.細(xì)胞周期調(diào)控與分裂、染色體重排；E.氨基酸運(yùn)輸與代謝；F.核苷酸運(yùn)輸與代謝；G.碳水化合物運(yùn)輸與代謝；H.輔酶運(yùn)輸與代謝；I.脂質(zhì)運(yùn)輸與代謝；J.翻譯、核糖體結(jié)構(gòu)與生物合成；K.轉(zhuǎn)錄；L.復(fù)制、重組與修復(fù)；M.細(xì)胞壁、膜生物合成；N.細(xì)胞運(yùn)動(dòng)；O.翻譯后修飾、蛋白質(zhì)折疊和分子伴侶；P.無(wú)機(jī)離子運(yùn)輸與代謝；Q.次生代謝物合成、運(yùn)輸和代謝；R.一般功能預(yù)測(cè)；S.未知功能；T.信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制；U.細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)、分泌和囊泡運(yùn)輸；V.防御機(jī)制；W.胞外結(jié)構(gòu)；Y.核酸結(jié)構(gòu)；Z.細(xì)胞骨架。

A.RNA processing and modification; B.Chromatin structure and dynamics; C.Energy production and conversion; D.Cell cycle control,cell division,chromosome partitioning; E.Amino acid transport and metabolism; F.Nucleotide transport and metabolism; G.Carbohydrate transport and metabolism; H.Coenzyme transport and metabolism; I.Lipid transport and metabolism; J.Translation,ribosomal structure and biogenesis; K.Transcription; L.Replication, recombination and repair; M.Cell wall/membrane/envelope biogenesis; N.Cell motility; O.Posttranslational modification,protein turnover,chaperones; P.Inorganic ion transport and metabolism; Q.Secondary metabolites biosynthesis,transport and catabolism; R.General function prediction only; S.Function unknown; T.Signal transduction mechanisms; U.Intracellular trafficking,secretion,and vesicular transport; V.Defense mechanisms; W.Extracellular structure;Y.Nucleic acid structure;Z.Cytoskeleton.

圖4繁景杜鵑Unigenes的COG功能分類
Fig.4FanjingRhododendronCOGclassificationofUnigenes

2.8差異表達(dá)基因分析

如圖6所示，差異表達(dá)的基因共有10 829個(gè)，其中上調(diào)表達(dá)基因6 347個(gè)，下調(diào)表達(dá)基因4 482個(gè)，上調(diào)與下調(diào)的基因相差較大，這些上調(diào)和下調(diào)的基因，為揭示杜鵑抗寒機(jī)理，及其相關(guān)代謝途徑分析提供了大量和可靠的數(shù)據(jù)。

2.9差異表達(dá)顯著的基因在低溫脅迫下的表達(dá)分析

分別取低溫脅迫處理后，上調(diào)表達(dá)和下調(diào)表達(dá)顯著的4個(gè)轉(zhuǎn)錄因子ALDH、ERF、MYB和bHLH家族中的24個(gè)基因，上調(diào)12個(gè)，下調(diào)12個(gè)(其中ALDH家族全部為上調(diào)表達(dá)的基因，ERF、MYB和bHLH家族中既有轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)的也有轉(zhuǎn)錄水平下調(diào)的)，利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR對(duì)其低溫脅迫處理前后表達(dá)變化進(jìn)行分析。如圖7所示，熒光定量結(jié)果雖然在表達(dá)變化幅度上有些差異，但從24個(gè)基因的表達(dá)趨勢(shì)來(lái)看，除了20776基因相對(duì)表達(dá)量較低(0.2)，其余23個(gè)基因相對(duì)表達(dá)量均比較高，與轉(zhuǎn)錄組結(jié)果基本一致，且31795、10108、937 3個(gè)基因的相對(duì)表達(dá)量最高。實(shí)時(shí)熒光定量分析結(jié)果與轉(zhuǎn)錄組結(jié)果基本一致，說(shuō)明本次Illumina測(cè)序所獲得的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)可靠。

3 討論與結(jié)論

隨著新一代高通量測(cè)序技術(shù)的廣泛應(yīng)用，植物基因組研究得到快速發(fā)展，但杜鵑基因組研究還很少。Illumina 高通量測(cè)序的數(shù)據(jù)量大、速度快、成本低、效率高，適合于沒(méi)有參考基因組信息的杜鵑展開(kāi)轉(zhuǎn)錄組研究。本研究中通過(guò)組裝得到 Unigenes序列122 654個(gè)，說(shuō)明本研究所得的數(shù)據(jù)量和數(shù)據(jù)信息較為豐富。前人應(yīng)用轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)，分別對(duì)擬南芥在不同光強(qiáng)和溫度之下，分析了其分子機(jī)制及擬南芥中 872 個(gè)基因在其花粉突變體中的差異表達(dá)情況[16-17]。Liu等[18]運(yùn)用Illumina 高通量測(cè)序的方法，發(fā)現(xiàn)了控制擬南芥發(fā)育出根的關(guān)鍵基因WOX11和WOX12。Li等[19]利用Illumina 測(cè)序技術(shù)分析了差異基因在越橘果皮和果肉中的表達(dá)情況，結(jié)果表明，核苷酸序列為4.8 Gb，Unigenes的平均長(zhǎng)度為 735 bp，能夠進(jìn)行基因功能注釋信息的有 25 376 個(gè)。Rowland 等[20]利用高通量測(cè)序技術(shù)研究了植物各組織之間的轉(zhuǎn)錄組信息與低溫鍛煉等的相關(guān)性，結(jié)果表明，所預(yù)測(cè)基因的表達(dá)情況和結(jié)果是一致的。根據(jù)張振亞等[21]的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的分析，發(fā)現(xiàn)其中有25個(gè)差異表達(dá)的基因在鹽脅迫下苜蓿和蛋白質(zhì)表達(dá)的變化趨勢(shì)相同，上調(diào)表達(dá)基因有14個(gè)，下調(diào)表達(dá)基因有11個(gè)，這些基因參與代謝、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、蛋白質(zhì)降解、防御、抗氧化、細(xì)胞骨架、膜轉(zhuǎn)運(yùn)、轉(zhuǎn)錄等及一系列未知功能。孫穎等[22]利用 RNA-seq 技術(shù)對(duì)油桐 2 個(gè)不同發(fā)育時(shí)期的花芽的轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行比較分析，獲得大量差異表達(dá)的Unigenes序列，在一定程度上解析油桐花芽形態(tài)分化的分子調(diào)控模式與機(jī)制。陳娜等[23]利用高通量測(cè)序技術(shù)，通過(guò)低溫處理后芯片雜交實(shí)驗(yàn)，篩選花生葉片中低溫脅迫響應(yīng)轉(zhuǎn)錄因子基因。結(jié)果表明，175 個(gè)具有轉(zhuǎn)錄調(diào)控活性的基因在低溫脅迫的花生葉片中表達(dá)變化量達(dá)到 2 倍以上，其中 92 個(gè)為上調(diào)基因，83 個(gè)為下調(diào)基因。因此，通過(guò)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)合生物信息學(xué)分析及定量表達(dá)分析的方法尋找與杜鵑抗寒相關(guān)的基因也是可行的。

圖5 繁景杜鵑Unigenes的部分KEGG 分類Fig.5 Fanjing Rhododendron KEGG classification of Unigenes

本研究中應(yīng)用Illumina高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)杜鵑葉片轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行測(cè)序，研究其基因表達(dá)譜和挖掘低溫脅迫下的重要表達(dá)基因。本研究通過(guò)組裝得到 Unigene 序列122 654個(gè)，將測(cè)序結(jié)果與nr、Swiss-Prot、GO、KEGG等蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行BlastX比對(duì)，有部分Unigenes無(wú)匹配信息，可能是片段過(guò)短或基因注釋信息匱乏等原因，也可能為杜鵑特有的基因序列。經(jīng)前人研究發(fā)現(xiàn)，GO在結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)上的存在缺陷，同時(shí)基因的大部分功能目前并不明確，因此導(dǎo)致了這種基因注釋信息并不完整[24]。因此，在本研究中，繁景杜鵑通過(guò) GO 數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)Unigenes所做的有關(guān)功能方面的分類等數(shù)據(jù)還不完善，仍有較多的Unigenes沒(méi)有對(duì)應(yīng)相關(guān)的 GO 注釋，需要借助另外的生物信息學(xué)分析對(duì) Unigenes功能進(jìn)行進(jìn)一步的分類和完整。將繁景杜鵑的Unigenes比對(duì)到 COG 數(shù)據(jù)庫(kù)，對(duì)基因的功能進(jìn)行統(tǒng)計(jì)和歸類，從基因組層次，為其對(duì)銅元素的追蹤和預(yù)測(cè)未知開(kāi)放閱讀框(ORF)的生物學(xué)功能提供了可能和便利，這使得基因功能的注釋更加精確。將以上Unigenes比對(duì)到KEGG 數(shù)據(jù)庫(kù)中，并對(duì)其代謝途徑進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)共涉及128個(gè)具體的代謝途徑分支，參與到繁景杜鵑體內(nèi)的碳水化合物代謝、能量代謝、轉(zhuǎn)錄與翻譯、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等代謝途徑中，為進(jìn)一步大量挖掘杜鵑低溫脅迫下的重要表達(dá)基因，開(kāi)展杜鵑的基因克隆及功能分析等研究提供了基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

圖6 繁景杜鵑差異表達(dá)基因統(tǒng)計(jì)Fig.6 Differential expression gene of Fanjing Rhododendron

圖7 低溫脅迫下差異表達(dá)顯著基因的相對(duì)表達(dá)量Fig.7 The relative expression of the differentially expressed genes under low temperature stress

通過(guò)熒光定量 PCR 結(jié)果分析發(fā)現(xiàn)，在低溫脅迫下，上調(diào)和下調(diào)表達(dá)顯著的4個(gè)轉(zhuǎn)錄因子家族中的24個(gè)基因，除了其中的20776基因相對(duì)表達(dá)量較低(0.2)，其余23個(gè)基因相對(duì)表達(dá)量均比較高，與轉(zhuǎn)錄組結(jié)果基本一致。其中31795、10108、937 3個(gè)基因的相對(duì)表達(dá)量較高，推測(cè)這3個(gè)基因可能在杜鵑低溫脅迫的過(guò)程中，行使著促進(jìn)耐寒相關(guān)的功能。其中相對(duì)表達(dá)量最高的31795為醛脫氫酶(ALDH)轉(zhuǎn)錄家族中的基因，通過(guò)前人對(duì)該相關(guān)基因的研究，筆者發(fā)現(xiàn)，第一個(gè)在植物中被克隆出來(lái)的醛脫氫酶基因來(lái)自于玉米雄性不育恢復(fù)基因Rf2a，它在線粒體乙醛脫氫酶的合成中起關(guān)鍵作用[25-26]；而類似的是，通過(guò)對(duì)擬南芥AtALDH3I1基因的研究，發(fā)現(xiàn)該基因表達(dá)受多種脅迫的誘導(dǎo)，如干旱脅迫、高濃度鹽脅迫、重金屬脅迫以及脫落酸脅迫等[27]；Gao等[28]發(fā)現(xiàn)20個(gè)醛脫氫酶基因在水稻中，分屬于10個(gè)亞科。值得注意的是，約有12個(gè)與干旱脅迫或高濃度鹽脅迫相關(guān)的基因，表明植物中的醛脫氫酶積極地參與了植物的各類抗逆反應(yīng)。目前，31795基因的生物學(xué)功能只是通過(guò)熒光定量表達(dá)分析以及通過(guò)對(duì)擬南芥、玉米和水稻中該基因功能的研究進(jìn)行推斷，究竟它的功能是否如此，以及是否還參與其他生命和代謝活動(dòng)，仍需進(jìn)一步研究。

在本研究中，第一次利用 Illumina高通量測(cè)序技術(shù)構(gòu)建了繁景杜鵑轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)，獲得了大量與轉(zhuǎn)錄本相關(guān)的信息，并通過(guò)序列組裝、功能注釋和分類、代謝途徑等對(duì)該基因的表達(dá)進(jìn)行分析，挖掘出杜鵑低溫脅迫下轉(zhuǎn)錄組的整體表達(dá)特征。為深入研究杜鵑的基因克隆、抗逆機(jī)理以及分子標(biāo)記開(kāi)發(fā)提供了極大的方便，為杜鵑花科植物的分子生物學(xué)研究提供了豐富的數(shù)據(jù)資源。

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TranscriptomeAnalysisofSuperiorStrainsofRhododendronHybridsunderLowTemperatureStress

WU Yueyan1，MING Meng1，2，HE Jingwen1，2，LU Dan1，SHEN Zili1，QIU Tian1，WU Yanyan1，XIE Xiaohong1

(1.College of Biological and Environmental Sciences，Zhejiang Wanli University，Ningbo 315100，China；2.College of Fisheries and Life Science，Shanghai Ocean University，Shanghai 201306，China)

To explore the molecular mechanism of cold resistance ofRhododendron，screening of cold resistant genes，using artificial low temperature，excellent strains withRhododendronFanjing-6 ℃(T)and 25 ℃(CK)control as test materials，conduct transcriptome sequencing and de novo assembly data and bioinformatics analysis，the data obtained by assembling 122 654 Unigenes sequences，functional annotation showed that a large number of Unigenes could be annotated with GO and COG database，information，some of Unigenes，might be the unique gene sequence ofRhododendron.RhododendronFanjing transcription in the Unigenes group according to the GO function can be divided into cellular component，molecular function and biological process of 3 kinds of 51 branches，including Unigenes and metabolic process，a large number of catalytic activity and cell process. There were 6 347 up-regulated differentially expressed genes and down regulated expression genes of 4 482. The expression of 24 genes in the four transcription factors，with 12 up-regulated and 12 down-regulated at the transcription level，which were significantly different in the transcriptional results，was verified by the expression level under low temperature stress. It was found that the transcriptional data were reliable.

Rhododendron；Low temperature stress；Transcriptome；Cold-resistant genes

2017-08-16

浙江省重中之重學(xué)科“生物工程”開(kāi)放基金項(xiàng)目(KF2015008)；寧波市重大科技專項(xiàng)(2014C11002)

吳月燕(1963-)，女，浙江金華人，教授，碩士，主要從事植物生理生化與分子生物學(xué)研究。

S685.21；Q78

A

1000-7091(2017)05-0052-09

10.7668/hbnxb.2017.05.009