新鐵炮百合朱麗葉器官差異基因表達(dá)分析

杜 方，王 婷，樊俊苗，張浩宇

(山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 園藝學(xué)院，山西 太谷 030801)

新鐵炮百合朱麗葉器官差異基因表達(dá)分析

杜 方，王 婷，樊俊苗，張浩宇

(山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 園藝學(xué)院，山西 太谷 030801)

為了探明17個(gè)候選基因在新鐵炮百合朱麗葉花、葉、鱗片3個(gè)器官中的表達(dá)情況，利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)，對(duì)其相對(duì)表達(dá)量進(jìn)行了研究。結(jié)果表明，根據(jù)表達(dá)情況，17個(gè)候選基因可以分為5類(lèi)，CL10636.Contig1_All、CL6300.Contig2_All、CL7951. Contig5_All、 Unigene8314_All、Unigene19279_All和CL1306.Contig1_All 6個(gè)在花中顯著高表達(dá)，分別與糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白-類(lèi)SWEET4基因、赤霉素調(diào)控蛋白基因、線粒體伴侶基因、光依賴(lài)性短下胚軸基因、1-脫氧葡萄糖-5-磷酸合成酶基因、牻牛兒基牻牛兒基焦磷酸合成酶基因高度同源；CL9292.Contig2_All、CL212.Contig5_All、Unigene1800_All、CL3468. Contig1_All、CL4520.Contig5_All、Unigene4212_All、CL4079.Contig1_All和Unigene10210_All 8個(gè)在葉中顯著高表達(dá)，分別與GDSL酯酶/脂酶基因、類(lèi)黃酮O-甲基轉(zhuǎn)移酶、脂氫過(guò)氧化物裂解酶基因、4-羥基-3-甲基-2-丁烯基二磷酸合成酶基因、多酚氧化酶基因、類(lèi)葡苷露聚糖4-β-甘露糖轉(zhuǎn)移酶基因、左旋海松烷合成酶基因和反式羅勒烯合成酶基因高度同源；CL2405.Contig1_All在鱗片中顯著高表達(dá)，功能未知；CL1114.Contig2_All在花和葉中同時(shí)顯著高表達(dá)，與3-酮酯酰CoA-硫解酶高度同源；CL1772.Contig2_All為非器官差異表達(dá)基因，與Δ24-甾醇還原酶基因高度同源。此結(jié)果可為今后研究這些候選基因的功能奠定基礎(chǔ)，對(duì)百合分子育種具有重要意義。

百合；差異基因；實(shí)時(shí)熒光定量PCR；器官

百合是百合科(Liliaceae)百合屬(Lilium)所有植物的統(tǒng)稱(chēng)，其花朵碩大，色彩豐富，花姿優(yōu)美，具有很高的觀賞價(jià)值和藥用價(jià)值[1]。百合的完整植株包括須根、鱗莖、花莖、葉片和花朵等器官，所有器官都來(lái)自于變態(tài)膨大的地下莖—鱗莖的鱗莖盤(pán)，這使得百合器官的起源變得十分有趣。

早期，對(duì)器官發(fā)生相關(guān)基因的研究主要是基于突變體庫(kù)的建立，利用擬南芥模式系統(tǒng)，科學(xué)家對(duì)植物根、莖、葉、花等各器官的形態(tài)建成進(jìn)行了研究，花發(fā)育的ABC模型是其中最重要的發(fā)現(xiàn)之一。后來(lái)，對(duì)矮牽牛胚珠發(fā)育和擬南芥花發(fā)育的深入研究，導(dǎo)致了花發(fā)育ABCDE模型的確認(rèn)[2-3]。同時(shí)，對(duì)水稻[4]、人參[5]和大豆[6]等器官發(fā)育基因的研究，正推動(dòng)著器官發(fā)育生物學(xué)的全面發(fā)展。

然而，對(duì)突變體進(jìn)行篩選費(fèi)時(shí)費(fèi)力，該方法不適用于基因組特別大的物種(如百合，36 Gb)。近幾年，隨著測(cè)序技術(shù)的快速發(fā)展，可以在較短的時(shí)間內(nèi)找到不同品種、不同器官或不同試驗(yàn)處理間的差異基因，為百合的分子生物學(xué)研究提供了發(fā)展機(jī)遇。近3年來(lái)，利用Illumina測(cè)序平臺(tái)發(fā)展起來(lái)的數(shù)字基因表達(dá)譜技術(shù)，有學(xué)者深入挖掘了百合春化[7]、脅迫[8]、碳代謝[9]、矮化[10]、花粉萌發(fā)[11]、花發(fā)育[12-13]和花色生物合成[14]相關(guān)的基因。

為了開(kāi)發(fā)百合的分子標(biāo)記，山西農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院百合課題組利用Illumina測(cè)序平臺(tái)構(gòu)建了東方百合索邦(Sorbonne)根、鱗莖、莖皮、葉片、花瓣和柱頭6種器官混合樣的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)[15]；在此基礎(chǔ)上，又構(gòu)建了東方百合索邦花、葉、鱗片3個(gè)器官的數(shù)字基因表達(dá)譜，找出了在索邦器官中差異表達(dá)的基因[16]。然而，基因的表達(dá)水平可能隨品種和植株的發(fā)育時(shí)期而變化。朱麗葉是新鐵炮百合系列的一個(gè)品種，花白色、長(zhǎng)筒形，朝天開(kāi)放，易于種子繁殖；與粉色、碟形花、花朵斜向開(kāi)放的東方百合索邦完全不同。

為了探明在索邦花、葉、鱗片中差異表達(dá)的基因在朱麗葉中的表達(dá)情況，本研究利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qPCR)對(duì)17個(gè)在索邦花、葉、鱗莖中差異表達(dá)的基因在朱麗葉中的表達(dá)進(jìn)行了研究，以期為今后研究這些候選基因的功能奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1試驗(yàn)材料

新鐵炮百合朱麗葉(LiliumformolongiJulius)，購(gòu)于浙江虹越花卉有限公司，2015年4月栽植于山西農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝站，2015年7月開(kāi)花，挖取剛開(kāi)放的3株百合完整植株于實(shí)驗(yàn)室，分取5 cm長(zhǎng)花蕾、頂端葉片(L)和內(nèi)層鱗片(S)，撕成小塊后快速儲(chǔ)藏于-80 ℃冰箱。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1 總RNA提取與反轉(zhuǎn)錄 RNA的提取根據(jù)GenStar公司的TRIGene 總RNA提取試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)其質(zhì)量，用MONODROP 2000c生物光度計(jì)檢測(cè)RNA濃度和純度，質(zhì)量合格的RNA保存于-80 ℃超低溫冰箱。

按照GenStar公司的StarScript Ⅱ cDNA 第1鏈合成試劑盒說(shuō)明書(shū)反轉(zhuǎn)錄cDNA，將得到的cDNA溶液稀釋至100 ng/μL，保存于-20 ℃冰箱備用。

1.2.2 引物設(shè)計(jì) 基因序列來(lái)源于山西農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院百合課題組前期所構(gòu)建的百合轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)L.-Unigene-All[15]，采用Primer 3(http：//primer 3.ut.ee/)在線設(shè)計(jì)引物(表1)，交由生工生物工程有限公司合成。

1.2.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 采用熒光染料法，以18S rRNA為內(nèi)參基因(正向引物5′-CGCAAGGCTGAAACTTA

AAGG-3′；反向引物5′-CAGACAAATCGCTCCACCAAC-3′)，利用TaKaRa公司 q-PCR試劑盒配置20 μL反應(yīng)體系，包括 SYBR Ⅱ 10 μL，雙蒸水 7 μL，cDNA 1 μL，Primer 1.6 μL，ROX 0.4 μL。在7500 Real time PCR System上運(yùn)行qRT-PCR試驗(yàn)，每個(gè)樣本重復(fù)3次。反應(yīng)程序如下：95 ℃ 3 min；之后94 ℃ 30 s ，55 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min(熒光)，共40個(gè)循環(huán)。溶解曲線條件為95 ℃ 15 s，54 ℃ 1 min，從54 ℃每30 s上升0.4 ℃直到95 ℃，95 ℃ 30 s(熒光)，54 ℃ 15 s。

1.3數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

采用2-ΔΔCt法計(jì)算相對(duì)表達(dá)量，采用SPSS和LSD法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析及多重比較，利用Excel 2003繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1總RNA提取

使用生物光度計(jì)檢測(cè)各樣品RNA質(zhì)量，各組織總RNA的OD260/280值均在1.8～2.0。取4 μL 總RNA進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像系統(tǒng)成像如圖1所示。相對(duì)而言，朱麗葉百合鱗片的RNA較難提取，提取濃度較低，但可以滿(mǎn)足試驗(yàn)需求。

2.2花中的高表達(dá)基因

實(shí)時(shí)熒光定量PCR的結(jié)果表明，CL10636.Contig1_All、CL6300.Contig2_All、CL7951.Contig5_All、 Unigene8314_All 等4個(gè)轉(zhuǎn)錄本在朱麗葉百合花器官中的表達(dá)量顯著高于在葉和鱗片中的表達(dá)量(P<0.05)，且在葉片和鱗片中的表達(dá)量差異不顯著。Unigene19279_All(7)和CL1306.Contig1_All(17)除在朱麗葉花中有顯著高的表達(dá)量外，在葉中也有一定的表達(dá)量，顯著低于花中的表達(dá)量，但顯著高于鱗片中的表達(dá)量(P<0.05)(圖2)。

表1 引物信息Tab.1 Information of primers

注：F.正向引物；R.反向引物。

Note：F. Forward primer；R. Reverse primer.

F. 花；L.葉；S.鱗片；M.DL2000 Marker。圖2-6同。F.Flower；L.Leaf；S.Scale;M.DL2000 Marker. The same as Fig.2-6.

2.3葉中的高表達(dá)基因

圖3結(jié)果顯示，CL9292.Contig2_All、CL212.Contig5_All、Unigene1800_All、CL3468. Contig1_All、CL4520.Contig5_All、Unigene4212_All 6個(gè)基因在朱麗葉葉器官中的表達(dá)量顯著高于在花和鱗片中的表達(dá)量(P<0.05)，且在葉和鱗片中的表達(dá)量差異不顯著。CL4079.Contig1_All和Unigene10210_All在朱麗葉葉器官中的表達(dá)量顯著高于在花和鱗片中的表達(dá)量，但花和鱗片中的表達(dá)量存在顯著差異(P<0.05)。其中，CL4079.Contig1_All(15)在朱麗葉花中的表達(dá)量顯著高于鱗片中的表達(dá)量，而Unigene10210_All(16)在朱麗葉鱗片中的表達(dá)量顯著高于在花中的表達(dá)量(P<0.05)。

2.4鱗片中的高表達(dá)基因

僅CL2405.Contig1_All在朱麗葉鱗片中的表達(dá)量顯著高于在花和葉中的表達(dá)量(P<0.05)，且在花和葉中的表達(dá)量差異不顯著(圖4)。

1.CL10636.Contig1_All ；5.CL6300.Contig2_All ；6.CL7951.Contig5_All ；7.Unigene19279_All ；12.Unigene8314_All ；17.CL1306.Contig1_All。不同小寫(xiě)字母表示差異顯著(P<0.05)。圖3-6同。1.CL10636.Contig1_All；5.CL6300.Contig2_All；6.CL7951.Contig5_All；7.Unigene19279_All；12.Unigene8314_All；17.CL1306.Contig1_All；Different lowercase mean significant difference at 0.05 level.The same as Tab.3-6..

2.CL9292.Contig2_All；4.CL212.Contig5_All；8. Unigene1800_All；10.CL3468.Contig1_All；13.CL4520.Contig5_All；14.Unigene4212_All；15.CL4079.Contig1_All；16.Unigene10210_All。

圖4 朱麗葉百合鱗片中高表達(dá)的基因Fig. 4 Highly expressed genes in scales

2.5花、葉中均高表達(dá)的基因

轉(zhuǎn)錄本CL1114.Contig2_All在朱麗葉花和葉器官中的表達(dá)量差異不顯著，但均顯著高于在鱗莖中的表達(dá)量(P<0.05)(圖5)。

2.6非器官差異表達(dá)基因

轉(zhuǎn)錄本CL1772.Contig2_All在朱麗葉花、葉、鱗片中均表達(dá)，但差異不顯著(圖6)。

圖5 朱麗葉百合花和葉中高表達(dá)的基因Fig.5 Highly expressed genes in flowers and leaves

圖6 朱麗葉百合的非器官差異表達(dá)基因Fig.6 Insignificant expressed genes in flowers，leaves and scales

3 討論

實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qPCR)是一種快速、特異地檢測(cè)單個(gè)基因表達(dá)變化的方法，現(xiàn)已在基礎(chǔ)科學(xué)研究、食品安全檢測(cè)、藥物研發(fā)、海關(guān)檢驗(yàn)檢疫等科研和實(shí)踐領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用[17]。本研究應(yīng)用此項(xiàng)技術(shù)，將17個(gè)基因在朱麗葉3個(gè)器官中的表達(dá)情況分為5類(lèi)，即在花中顯著高表達(dá)的基因、在葉中顯著高表達(dá)的基因、在鱗片中顯著高表達(dá)的基因、在花和葉中同時(shí)顯著高表達(dá)的基因和非器官差異表達(dá)基因。

供試轉(zhuǎn)錄本中有6個(gè)轉(zhuǎn)錄本在花朵中顯著高表達(dá)，它們分別與糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白-類(lèi)SWEET4基因、赤霉素調(diào)控蛋白基因、線粒體伴侶基因、光依賴(lài)性短下胚軸基因、1-脫氧葡萄糖-5-磷酸合成酶基因、牻牛兒基牻牛兒基焦磷酸合成酶基因高度同源。SWEET蛋白起蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)體的作用，在植物體中常與育性有關(guān)[18]。線粒體伴侶蛋白對(duì)于線粒體電子傳遞復(fù)合物Ⅲ的組裝必不可少[19]，光依賴(lài)性短下胚軸基因在擬南芥的花和葉的邊界細(xì)胞(Boundary cells)中被檢測(cè)到[20]，它們可能與花朵開(kāi)放過(guò)程中能量的供應(yīng)和形態(tài)發(fā)生有關(guān)。1-脫氧葡萄糖-5-磷酸合成酶基因和牻牛兒基牻牛兒基焦磷酸合成酶基因均是萜類(lèi)代謝途徑中2-C-甲基-D-赤蘚糖醇-4-磷酸(MEP)途徑的重要基因，可能與花香的形成有關(guān)[21]。

有8個(gè)轉(zhuǎn)錄本在葉片中高表達(dá)，它們分別與GDSL酯酶/脂酶基因、類(lèi)黃酮O-甲基轉(zhuǎn)移酶、脂氫過(guò)氧化物裂解酶基因、4-羥基-3-甲基-2-丁烯基二磷酸合成酶基因、多酚氧化酶基因、類(lèi)葡苷露聚糖4-β-甘露糖轉(zhuǎn)移酶基因、左旋海松烷合成酶基因和反式羅勒烯合成酶基因高度同源。其中，GDSL酯酶/脂酶已在多種植物中證明參與植物的生長(zhǎng)發(fā)育和形態(tài)建成[22]。左旋海松烷合成酶和類(lèi)黃酮O-甲基轉(zhuǎn)移酶被發(fā)現(xiàn)在多種植物中具有防御病蟲(chóng)害的功能[23-26]，4-羥基-3-甲基-2-丁烯基二磷酸合成酶基因和反式羅勒烯合成酶基因也是MEP途徑中的重要基因，在多種植物的葉片和根中被克隆[27-28]。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，反式羅勒烯合成酶基因在朱麗葉花中也有少量表達(dá)，說(shuō)明萜烯類(lèi)是多種植物多種器官重要的次生代謝產(chǎn)物。多酚氧化酶是植物體內(nèi)普遍存在的一類(lèi)銅結(jié)合酶，主要存在于正常的光合組織內(nèi)[29]。脂氫過(guò)氧化物裂解酶基因是脂氧合酶下游的一個(gè)關(guān)鍵性酶，與植物抗病蟲(chóng)、老化等生理進(jìn)程有關(guān)[30]。也有試驗(yàn)證明，脂氫過(guò)氧化物裂解酶基因催化脂氫過(guò)氧化物裂解產(chǎn)生具有特異芳香氣味的物質(zhì)，在濃香型東方百合桑坦德中的表達(dá)量是香味稍差的東方百合和喇叭百合雜交種巴拉多納的3倍[31]，表明不同品種中該基因的表達(dá)水平不一樣。本試驗(yàn)中的朱麗葉為清香型百合，該基因在花中的表達(dá)量顯著低于在葉片中的表達(dá)量。

轉(zhuǎn)錄本CL1772.Contig2_All參與類(lèi)固醇代謝，是與Δ24-甾醇還原酶基因高度同源的基因。甾醇存在于高等植物的細(xì)胞膜、細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞器內(nèi)，是調(diào)節(jié)細(xì)胞膜流動(dòng)性與通透性的關(guān)鍵脂質(zhì)成分，對(duì)植物生長(zhǎng)發(fā)育有重要作用[32]。該基因?qū)儆诠芗一?，不具有器官特異性，這與該基因在朱麗葉花、葉、鱗片3個(gè)器官的表達(dá)特征無(wú)顯著差異相一致。轉(zhuǎn)錄本CL1114.Contig2_All是與3-酮酯酰CoA-硫解酶高度同源的基因，參與脂質(zhì)的代謝活動(dòng)，催化β氧化循環(huán)中的硫解反應(yīng)[33]，而β氧化循環(huán)是個(gè)放能的過(guò)程，該基因在朱麗葉花和葉中高表達(dá)，暗示著剛剛開(kāi)花的百合植株的地上部正進(jìn)行著旺盛的生命活動(dòng)。

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AnalysisofDifferentiallyExpressedGenesinOrgansofLiliumformolongiJulius

DU Fang，WANG Ting，F(xiàn)AN Junmiao，ZHANG Haoyu

(College of Horticulture，Shanxi Agricultural University，Taigu 030801，China)

To understand the expression levels of 17 candidate genes in flower，leaf and scale ofLiliumformolongiJilius，Real time quantitative PCR was conducted. The results showed that the 17 candidate genes could be divided into five groups.CL10636.Contig1_All，CL6300.Contig2_All，CL7951. Contig5_All，Unigene8314_All，Unigene19279_All and CL1306.Contig1_All significantly highly expressed in flowers，which were highly homologous with Bidirectional sugar transporter SWEET4-like gene，cold-regulated gibberellin-regulated protein gene bidirectional，mitochondrial chaperone gene，Lightlight-dependent short hypocotyls 4-like gene，1-deoxyxylulose-5-phosphate synthase gene，geranylgeranyl pyrophosphate synthase gene. CL9292.Contig2_All，CL212.Contig5_All，Unigene1800_All，CL3468. Contig1_All，CL4520.Contig5_All，Unigene4212_All，CL4079.Contig1_All and Unigene10210_All eight significantly highly expressed in leaves，which were highly homologous with GDSL esterase/lipase gene，flavonoid O-methyltransferase gene，hydroperoxide lyase gene，4-hydroxy-3-methylbut-2-en-1-yl diphosphate gene，polyphenol oxidase gene，glucomannan 4-beta-mannosyltransferase 1-like gene，Levopimaradiene synthase gene and trans-ocimene synthase gene. CL2405.Contig1_All significantly highly expressed in scales，function unknown. CL1114.Contig2_All significantly highly expressed in both flowers and leaves，highly homologous with 3-ketoacyl-CoA thiolase gene. CL1772.Contig2_All，homologous with delta-(24)-sterol reductase，was non-organ specific gene. The results are valuable for the functional study of those genes and will be benefit for the molecular breeding of lily.

Lily；Differentially expressed genes；Real-time q-PCR；Organs

2017-05-02

山西省應(yīng)用基礎(chǔ)研究項(xiàng)目(201601D011077)；山西農(nóng)業(yè)大學(xué)引進(jìn)人才科研啟動(dòng)項(xiàng)目(2014ZZ02)

杜 方(1973-)，女，山西原平人，副教授，博士，碩士生導(dǎo)師，主要從事花卉種質(zhì)資源創(chuàng)新及生物技術(shù)應(yīng)用研究。

S682.29；Q78

A

1000-7091(2017)05-0025-06

10.7668/hbnxb.2017.05.005