D-苯基乳酸高產(chǎn)菌株發(fā)酵罐發(fā)酵條件研究

謝建松，徐艷，鄭麗雪，*

（1.常熟理工學(xué)院生物與食品工程學(xué)院，江蘇常熟215500；2.蘇州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與生物科學(xué)學(xué)院，江蘇蘇州215000）

D-苯基乳酸高產(chǎn)菌株發(fā)酵罐發(fā)酵條件研究

謝建松1，徐艷2，鄭麗雪1，*

（1.常熟理工學(xué)院生物與食品工程學(xué)院，江蘇常熟215500；2.蘇州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與生物科學(xué)學(xué)院，江蘇蘇州215000）

研究了D-苯基乳酸高產(chǎn)菌株在5 L發(fā)酵罐中全細(xì)胞轉(zhuǎn)化苯丙酮酸鈉合成D-苯基乳酸的條件，分別考察了溶氧量、表面活性劑、底物補(bǔ)加方式等對D-苯基乳酸產(chǎn)量的影響。結(jié)果表明：最適溶氧為40%，控制pH值為7.0分批補(bǔ)加底物得到D-苯基乳酸的產(chǎn)量為18.76 g/L，較未控制pH值發(fā)酵提高7.22%；添加1%吐溫80時，D-苯基乳酸產(chǎn)量達(dá)到了18.59 g/L，比未加表面活性劑發(fā)酵提高了6.98%。在此基礎(chǔ)上，將底物勻速流加得到D-苯基乳酸的產(chǎn)量提高到19.43 g/L。

大腸桿菌；D-苯基乳酸；發(fā)酵罐；全細(xì)胞轉(zhuǎn)化

D-苯基乳酸（D-phenyllactic acid，D-PLA），也稱3－D-苯基乳酸或2－羥基－3－苯基丙酸，是一種廣泛存在于乳酸菌發(fā)酵產(chǎn)品[1-3]和蜂蜜中的有機(jī)酸[4-6]，同時它還是一種新型的天然防腐劑，抑菌譜較廣，對大多數(shù)食源性致病細(xì)菌和真菌有明顯的抑制作用。相較于常見的化學(xué)防腐劑，其安全性能高，對人體和動物細(xì)胞均無毒性[7-8]，在食品工業(yè)中具有較好的應(yīng)用前景。

目前，關(guān)于D-PLA方面的研究大多集中在高產(chǎn)菌株的篩選[9-10]、搖瓶發(fā)酵條件優(yōu)化[11-14]、重組大腸桿菌的構(gòu)建[15-17]及高純度合成[18]等方面的研究，在發(fā)酵罐中利用全細(xì)胞轉(zhuǎn)化合成D-苯基乳酸還鮮見報道。課題組前期在7.5L發(fā)酵罐中研究了pH值及底物對副干酪乳桿菌發(fā)酵產(chǎn)D-PLA的影響[19]，在此基礎(chǔ)上，本研究進(jìn)一步用帶有D-乳酸脫氫酶基因的重組大腸桿菌，以苯丙酮酸鈉為底物，在發(fā)酵罐中全細(xì)胞轉(zhuǎn)化合成D-苯基乳酸，優(yōu)化了發(fā)酵罐的發(fā)酵條件，取得了較好的結(jié)果，為后續(xù)的放大實(shí)驗(yàn)奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 菌種

E.coli BL21 pET-28a-LDH-FDH，常熟理工學(xué)院生物與食品工程學(xué)院發(fā)酵工程中心保存。

1.2 主要儀器

FS-05 Winpact發(fā)酵罐：美國Winpact公司；SPD-20AV型高效液相色譜儀、UV-2450型紫外可見分光光度計：日本島津公司；DHP-9162303A-5S型電熱恒溫培養(yǎng)箱：上海索普儀器有限公司；YXQ-LS-100A型立式壓力蒸汽滅菌鍋：上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；PE20型實(shí)驗(yàn)室PH計：梅特勒—托利多儀器（上海）有限公司；FA604A型精密電子天平：上海精天電子儀器有限公司；SW-CJ-1B超凈工作臺：蘇凈集團(tuán)安泰公司；CR22GII型高速冷凍離心機(jī)：日本日立公司。

1.3 培養(yǎng)基與試劑

LB培養(yǎng)基：胰蛋白胨10 g，酵母提取物5 g，氯化鈉 10 g，蒸餾水定容至 1 000 mL，pH 7.0。

50 mg/mL Kana霉素試劑：0.5 gKana溶于10 mL無菌超純水，定容，過0.22 μm濾頭過濾除菌，分裝處于4℃冰箱貯存待用。

0.1 mol/L異丙基硫代半乳糖苷（Isopropyl β-DThiogalactoside，IPTG）試劑：2 g IPTG 溶于10 mL無菌超純水，定容，過0.22 μm濾頭過濾除菌，分裝處于4℃冰箱貯存待用。

0.1 mol/L，pH=7.0的磷酸鈉緩沖液。以上培養(yǎng)基與試劑均來自上海生工。

1.4 菌種活化

將保存的E.coli pET-28a-LDH-FDH接種到LB固體培養(yǎng)基上，37℃恒溫培養(yǎng)12 h。

1.5 菌種培養(yǎng)

1.5.1 種子液制備

將活化好的E.coli pET-28a-LDH-FDH菌株挑取一環(huán)接種到裝有400 mL LB液體培養(yǎng)基的三角瓶中，37℃，200 r/min培養(yǎng)12 h。

1.5.2 接菌

在裝有4LLB液體培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中，加入4 mL Kana溶液，將制備好的種子液加入發(fā)酵罐，37℃，200 r/min條件下培養(yǎng)至OD600=0.8～1.0。

1.5.3 加誘導(dǎo)劑

在發(fā)酵罐中加入0.8 mL IPTG，25℃，200 r/min誘導(dǎo)8 h。

1.6 菌液處理

1.6.1 離心

將全部菌液倒入離心管，在4℃，6 000 r/min離心5 min，棄去上清液，留下沉淀菌泥。用磷酸鈉緩沖液沖洗兩次。

1.6.2 菌懸液制備

用5 mL磷酸鈉緩沖液將菌泥吸打混勻，制成菌懸液，同時加入0.6 g葡萄糖，0.21 g甲酸鈉。

1.6.3 苯丙酮酸鈉溶液制備

稱取8 g苯丙酮酸鈉溶于40 mL蒸餾水中，70℃水浴溶解1 h后過濾。

1.7 發(fā)酵罐發(fā)酵條件的研究

1.7.1 溶氧量對D-苯基乳酸產(chǎn)量的影響

將發(fā)酵罐溶氧量分別通過轉(zhuǎn)速與通氣量自動控制在30%、40%、50%、60%，轉(zhuǎn)化開始前加入20 mL苯丙酮酸鈉溶液，轉(zhuǎn)化30分鐘后補(bǔ)加20 mL苯丙酮酸鈉溶液，在37℃條件下轉(zhuǎn)化100 min，每隔10 min取一次樣，進(jìn)行HPLC檢測。

1.7.2 表面活性劑對D-苯基乳酸產(chǎn)量的影響

菌懸液中加入1%（體積分?jǐn)?shù)）的吐溫-80，轉(zhuǎn)化開始前加入20 mL苯丙酮酸鈉溶液，轉(zhuǎn)化30分鐘后補(bǔ)加20 mL苯丙酮酸鈉溶液，在37℃，溶氧量控制在40%的條件下轉(zhuǎn)化100 min，每隔10 min取一次樣，備檢測。

1.7.3 未控制pH值發(fā)酵對D-苯基乳酸產(chǎn)量的影響

轉(zhuǎn)化開始前加入20 mL苯丙酮酸鈉溶液，轉(zhuǎn)化30分鐘后補(bǔ)加20 mL苯丙酮酸鈉溶液，在37℃，溶氧量控制在40%的條件下轉(zhuǎn)化100 min，每隔10 min取一次樣，備檢測并記錄pH值變化。

1.7.4 控制pH值對D-苯基乳酸產(chǎn)量的影響

轉(zhuǎn)化開始前加入20 mL苯丙酮酸鈉溶液，轉(zhuǎn)化30分鐘后補(bǔ)加20 mL苯丙酮酸鈉溶液，在37℃，溶氧量控制在40%的條件下轉(zhuǎn)化100 min，調(diào)節(jié)pH=7.0，每隔10 min取一次樣，備檢測。

1.7.5 底物流加對D-苯基乳酸產(chǎn)量的影響

40 mL苯丙酮酸鈉溶液在補(bǔ)料瓶中在60 min內(nèi)勻速流加進(jìn)發(fā)酵罐，在37℃，溶氧量控制在40%，恒定pH值為7.0的條件下轉(zhuǎn)化100 min，每隔10 min取一次樣，備檢測。

1.8 高效液相色譜檢測[20]

取1 mL樣品12 000 r/min離心5 min，取上清液100 μL加入 900 μL流動相稀釋后用 0.22 μm 濾頭過濾至液相小瓶中以備檢測。苯丙酮酸與D-苯基乳酸檢測方法如下：色譜柱為Bio－Rad Aminex HPX－87H有機(jī)酸分析柱；流動相為5 mmol/L稀硫酸；流速0.6 mL/min；柱溫30℃；進(jìn)樣體積5 μL，檢測波長210 nm。

苯丙酮酸的轉(zhuǎn)化率/%=mD-苯基乳酸/m苯丙酮酸×100；式中：mD-苯基乳酸為特定反應(yīng)時間內(nèi)合成的D-苯基乳酸的質(zhì)量，g；m苯丙酮酸為消耗的苯丙酮酸的質(zhì)量，g。

2 結(jié)果與分析

2.1 溶氧量對D-苯基乳酸產(chǎn)量的影響

將發(fā)酵罐溶氧量控制在30%、40%、50%、60%4個梯度，以取樣時間為橫坐標(biāo)，D-苯基乳酸和苯丙酮酸（3-Phenylpyruvic acid，PPA）的含量為縱坐標(biāo)分別作圖 1（ABCD）。

圖1 溶氧量對D-苯基乳酸產(chǎn)量的影響Fig.1 Effects of dissolved oxygen on the production of D-PLA

由圖1可以看出，當(dāng)溶氧量為40%時，D-苯基乳酸的產(chǎn)量最高，達(dá)到了18.06 g/L，轉(zhuǎn)化率達(dá)到了84.1%，相比于其他3個溶氧量的轉(zhuǎn)化率都高，表明溶氧量對于發(fā)酵罐發(fā)酵合成苯丙酮酸有影響，因此得到發(fā)酵罐發(fā)酵合成PLA最適溶氧為40%。

2.2 表面活性劑對D-苯基乳酸產(chǎn)量的影響

控制40%最優(yōu)溶氧量，在菌懸液加入1%（體積分?jǐn)?shù)）的吐溫－80表面活性劑進(jìn)行轉(zhuǎn)化，以取樣時間為橫坐標(biāo)，D-苯基乳酸和苯丙酮酸的含量為縱坐標(biāo)作圖（圖 2）。

圖2 表面活性劑對D-苯基乳酸產(chǎn)量的影響Fig.2 Effects of surface active agent on the production of D-PLA

由圖2可以看出，未加表面活性劑發(fā)酵時，D-苯基乳酸產(chǎn)量為17.86 g/L，轉(zhuǎn)化率為70.7%；加入表面活性劑后，D-苯基乳酸產(chǎn)量增加，達(dá)到了18.59 g/L，提高了6.98%，轉(zhuǎn)化率為75.7%。這是因?yàn)橥聹兀?0是一種非離子型表面活性劑，與細(xì)胞膜相互作用改變了細(xì)胞膜的通透性，有利于底物輸入和產(chǎn)物輸出。

2.3 控制pH值分批補(bǔ)料發(fā)酵

設(shè)置發(fā)酵液pH值在7.0時進(jìn)行轉(zhuǎn)化，根據(jù)液相色譜結(jié)果，以取樣時間為橫坐標(biāo)，D-苯基乳酸和苯丙酮酸的含量為縱坐標(biāo)作圖3。

從圖3A與3B進(jìn)行比較可以看出，未控制pH值的發(fā)酵液最終合成D-苯基乳酸的產(chǎn)量為18.04 g/L，轉(zhuǎn)化率為71.4%，控制pH值進(jìn)行發(fā)酵，D-苯基乳酸產(chǎn)量18.76 g/L，較未控制pH值發(fā)酵提高了7.22%，轉(zhuǎn)化率為77.3%，這說明控制pH值對于D-PLA的合成有一定的影響。分鐘后，底物流加結(jié)束，利用積累的PPA進(jìn)行轉(zhuǎn)化，PPA含量逐漸降低，最終得到D-PLA產(chǎn)量為19.43 g/L。在轉(zhuǎn)化過程中，生產(chǎn)菌株的活性會隨著產(chǎn)物的增加降低，而勻速流加底物能夠充分利用細(xì)胞的活性轉(zhuǎn)化苯丙酮酸，因此底物流加的方式較分批補(bǔ)加底物能夠得到更多產(chǎn)物。

圖3 pH值對D-苯基乳酸產(chǎn)量的影響Fig.3 Effect of pH on PLA production

3 結(jié)論

D-苯基乳酸高產(chǎn)菌株E.coli BL21 pET-28a-LDH-FDH在發(fā)酵罐轉(zhuǎn)化苯丙酮酸合成D-苯基乳酸時，最適溶氧為40%，當(dāng)控制發(fā)酵罐溶氧為最適溶氧時，控制pH=7.0發(fā)酵比未控制pH值發(fā)酵的D-PLA產(chǎn)量較高，提高了7.22%，添加一定的表面活性劑，如Tween-80，能夠明顯提高D-苯基乳酸的產(chǎn)量，提高了6.98%，與分批補(bǔ)料相比，底物勻速流加得到D-PLA的產(chǎn)量有提高到19.43 g/L，這比趙明月[15]在發(fā)酵罐中全細(xì)胞催化合成D-苯基乳酸的產(chǎn)量要高。本研究對發(fā)酵罐全細(xì)胞轉(zhuǎn)化合成D-苯基乳酸的條件進(jìn)行了初步的研究，表面活性劑、控制pH值、及底物流加都能提高D-PLA的產(chǎn)量，后續(xù)將進(jìn)一步研究不同pH值、底物濃度等條件對全細(xì)胞轉(zhuǎn)化合成PLA的影響，本研究為后續(xù)研究奠定了基礎(chǔ)。

2.4 底物流加對D-苯基乳酸產(chǎn)量的影響

將底物苯丙酮酸鈉溶液勻速流加進(jìn)行轉(zhuǎn)化，控制在60 min后流加結(jié)束，以取樣時間為橫坐標(biāo)，D-苯基乳酸和苯丙酮酸的含量為縱坐標(biāo)作圖4。

圖4 底物流加對D-苯基乳酸產(chǎn)量的影響Fig.4 Effect of Bottom logistics plus on the production of D-PLA

由圖4可以看出，前60分鐘，隨著底物的勻速流加，D-PLA的產(chǎn)量逐漸增加，PPA含量緩慢積累，至60

[1]Schnurer J,Magnusson J.Antifungal lactic acid bacteria as biopreservatives[J].Trends in Food Science&Technology,2005,16(1):70-78

[2]Mu W,Yu S,Zhu L,et al.Recent research on 3-phenyllactic acid,a broad-spectrum antimicrobial compound[J].Applied Microbiology and Biotechnology,2012,95(5):1155-1163

[3]Rodríguez N,Salgado J M,Cortés S,et al.Antimicrobial activity of d-3-phenyllactic acid produced by fed-batch process against Salmonella enterica[J].Food Control,2012,25(1):274-284

[4]Lavermicocca P,Valerio F,Evidente A,et al.Purification and characterization of novel antifungal compounds from the sourdough Lactobacillus plantarum strain 21B[J].Applied&Environmental Microbiology,2000,66(9):4084

[5]Tuberoso C I,Bifulco E,Caboni P,et al.Lumichrome and phenyllactic acid as chemical markers of thistle (Galactites tomentosa Moench)honey[J].Journal of Agricultural&Food Chemistry,2011,59(1):364-369

[6]Li X,Jiang B,Pan B.Biotransformation of phenylpyruvic acid to phenyllactic acid by growing and resting cells of a Lactobacillus sp.[J].Biotechnology Letters,2007,29(4):593-597

[7]Lavermicocca P,Valerio F,Visconti A.Antifungal activity of phenyllactic acid against molds isolated from bakery products[J].Applied&Environmental Microbiology,2003,69(1):634-640

[8]Allen K L,Molan P C,Reid G M.A survey of the antibacterial activity of some New Zealand honeys[J].Journal of Pharmacy&Pharmacology,1991,43(12):817-822

[9]王丹,陳光,王立梅.基因組改組技術(shù)選育D-苯基乳酸高產(chǎn)菌株[J].食品工業(yè)科技,2011(10):208-211

[10]田雪嬌.高產(chǎn)苯乳酸菌株的誘變選育及發(fā)酵條件優(yōu)化[D].大慶:黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué),2013:12-50

[11]胡發(fā)根,羅林,王鵬,等.巨大芽孢桿菌的篩選及其全細(xì)胞合成D-苯基乳酸條件[J].中國食品學(xué)報,2016(9):101-106

[12]王穎,何禾,胡發(fā)根,等.響應(yīng)面法優(yōu)化重組大腸桿菌全細(xì)胞合成D-D-苯基乳酸[J].食品科學(xué),2016,37(7):88-92

[13]劉戈,王立梅.Lactobacillus paracaseiW2合成苯乳酸培養(yǎng)條件的優(yōu)化[J].食品科學(xué),2010,31(23):174-177

[14]劉晨.高產(chǎn)苯乳酸菌株的復(fù)合誘變及其生產(chǎn)培養(yǎng)基的優(yōu)化[D].大慶:黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué),2014:12-50

[15]趙明月,鄭兆娟.重組大腸桿菌全細(xì)胞催化合成D-D-苯基乳酸的研究[J].廣東化工,2015,42(6):29-30

[16]蔣卓越,季偉,錢蓓蓓,等.乳酸脫氫酶突變體D-LDHY52L在大腸桿菌中的重組表達(dá)及其合成D-D-苯基乳酸的研究[J].食品與發(fā)酵工業(yè),2016,42(1):1-6

[17]王穎,范銘,薛素妹,等.全細(xì)胞催化合成L-D-苯基乳酸重組大腸桿菌的構(gòu)建[J].食品與發(fā)酵工業(yè),2015,41(12):13-17

[18]朱益波,魯如彬,程俊,等.重組大腸桿菌合成光學(xué)純L-D-苯基乳酸[J].食品科學(xué),2017,38(2):59-64

[19]王立梅,騰宇,陳文飛,等.pH值及底物對副干酪乳桿菌發(fā)酵生產(chǎn)苯乳酸的影響[J].食品科學(xué),2014,35(1):163-166

[20]Zhu Y,Hu F,Zhu Y,et al.Enhancement of phenyllactic acid biosynthesis by recognition site replacement of D-lactate dehydrogenase from Lactobacillus pentosus[J].Biotechnology Letters,2015,37(6):1233-1241

Study on Fermentation Conditions of High Yield Strain of D-Phenyllactic Acid in Fermentation Tank

XIE Jian-song1，XU Yan2，ZHENG Li-xue1，*
（1.College of Biology and Food Engineering，Changshu Institute of Technology，Changshu 215500，Jiangsu，China；2.Institute of Basic Medical and Biological Sciences，Soochow University，Suzhou 215000，Jiangsu，China）

The conditions of the synthesis of D-phenyllactic acid by the whole cell transformation of phenylpyruvic acid in 5 L fermentor were studied in this paper.Dissolved oxygen，surfactant，substrate adding method on the yield of D-phenyllactic acid were studied.The results showed：the optimum dissolved oxygen was 40%，the yield of D-phenyllactic acid was 18.76 g/L when batch addition of the substrate and a constant pH of 7.0，compared with natural pH fermentation increased by 7.22%.The yield of D-phenyllactic acid was up to 18.59 g/L when 1%Twain was added，compared with that without surfactant addition increased by 6.98%.On the basis of this，the yield of D-phenyllactic acid was increased to 19.43 g/L under the uniform substrate flow.

Escherichia coli；D-phenyllactic acid；fermentation tank；whole cell transformation

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.21.034

常熟理工學(xué)院重點(diǎn)畢業(yè)論文團(tuán)隊項目

謝建松（1994—），男（漢），學(xué)士，研究方向：食品科學(xué)與工程。

*通信作者：鄭麗雪（1982—），女（漢），實(shí)驗(yàn)師，碩士，研究方向：食品生物技術(shù)。

2017-03-23