HPLC-MS測定食品中唑嘧磺草胺的殘留量

王鑫，李道霞，劉美，王穎，余曉琴

（四川省食品藥品檢驗(yàn)檢測院，四川成都610097）

HPLC-MS測定食品中唑嘧磺草胺的殘留量

王鑫，李道霞，劉美，王穎，余曉琴

（四川省食品藥品檢驗(yàn)檢測院，四川成都610097）

為建立一套對食品中唑嘧磺草胺殘留量檢測的方法，采用高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（high performance liquid chromatography-mass spectrometry，HPLC-MS）對樣品中的唑嘧磺草胺進(jìn)行檢測。結(jié)果表明：采用乙腈對樣品進(jìn)行提取后，再經(jīng)過凈化劑（花椒：40 mg PSA+10 mg GCB+150 mg MgSO4，其他樣品：30 mg GCB+150 mg MgSO4）處理后進(jìn)樣，得到溶劑標(biāo)準(zhǔn)曲線在1 μg/mL～200 μg/mL濃度范圍內(nèi)呈良好線性關(guān)系（R＞0.999），而11種基質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)曲線在 5 μg/mL～200 μg/mL 濃度范圍內(nèi)也呈良好線性關(guān)系（R＞0.995），檢出限范圍為 0.1 μg/kg～33 μg/kg，因此本試驗(yàn)的方法滿足對唑嘧磺草胺分析的要求。

唑嘧磺草胺；高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)；檢測

唑嘧磺草胺，化學(xué)名稱為：N-C2，6-二氟（苯基）-5-甲基-1，2，4-三唑，商品名為闊草清，是一種由美國陶氏益農(nóng)公司開發(fā)出的超高效的三唑并嘧啶磺酰胺類除草劑[1]。嘧啶磺酰胺類除草劑的作用機(jī)制是乙酰乳酸合成酶抑制劑，其使植物體內(nèi)乙酰乳酸合成酶（ALS）活力降低，纈氨酸、亮氨酸與異亮氨酸的合成受到抑制，影響蛋白質(zhì)的合成從而導(dǎo)致植物生長停止而死亡，主要適用作物為：大豆、玉米、小麥、大麥、三葉草、苜蓿、豌豆等農(nóng)作物[2]。唑嘧磺草胺雖然是低毒性除草劑，但其殘效期較長，又由于使用面積巨大以及不規(guī)范使用等原因，其危害仍不可忽視。據(jù)相關(guān)報(bào)道，長期接觸化學(xué)除草劑，可在人體內(nèi)不斷蓄積，導(dǎo)致慢性危害，如癌癥、免疫性疾病等[3]。我國最新發(fā)布的GB 2763-2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中農(nóng)藥最大殘留限量標(biāo)準(zhǔn)》規(guī)定了唑嘧磺草胺在谷物和大豆油料油脂中最大殘留量為0.05 mg/kg。

酰胺類除草劑可用乙酸乙酯、丙酮、丙酮-水、己烷-丙酮等溶劑提取，弗羅里硅土、中性氧化鋁、硅膠等固相萃取柱凈化，也可采用凝膠滲透色譜凈化，經(jīng)氣相-電子捕獲檢測器（gas phase-electron capture detector，GC-ECD）、氣相-氮磷檢測器（gas phase-nitrogen and phosphorus detector，GC-NPD）、氣相-質(zhì)譜（gas phase mass spectrometry，GC-MS）或高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）測定[4]。由于大多數(shù)酰胺類除草劑都含有電負(fù)性離子，因此適用質(zhì)譜技術(shù)分析，沈偉健等[5]比較電子轟擊離子源和負(fù)化學(xué)離子源兩種電離技術(shù)檢測12種胺類除草劑，發(fā)現(xiàn)兩種方法都具有較高靈敏度，但EI源能夠提供更多的碎片和結(jié)構(gòu)信息。林立業(yè)[6]采用高效液相色譜法測定唑嘧磺草胺的含量，平均回收率為99.71%～99.89%，標(biāo)準(zhǔn)偏差和變異系數(shù)分別為0.113和0.141，雖然已有酰胺類除草劑檢測方法的報(bào)道，但采用高效液相質(zhì)譜聯(lián)用法檢測唑嘧磺草胺這一具體的酰胺類物質(zhì)的還很少。

本文旨在研究反相高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定農(nóng)作物中的唑嘧磺草胺，優(yōu)化檢測條件，使其能夠?qū)r(nóng)作物中的唑嘧磺草胺進(jìn)行準(zhǔn)確的測定，為唑嘧磺草胺殘留檢測方法的制定與修訂提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)與建議。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

玉米、大豆、芹菜、茄子、韭菜、葡萄、柑橘、香菇、花生油、綠茶和花椒等均為市售；唑嘧磺草胺對照品（純度≥96%）：Sigma公司；乙腈（色譜純）、甲酸（色譜純）：賽默飛世爾科技（中國）有限公司；PSA填料：CNW公司；GCB填料：SWELL公司；其他試劑均為分析純。

VORTEX-2 GENIE型渦旋機(jī)：美國Scientific Industries；L-550型高速離心機(jī)：湖南湘儀儀器有限公司；HK-02A萬能粉碎機(jī)：廈門旭朗機(jī)械設(shè)備有限公司；Agilent1290-G6460A型高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀：安捷倫科技公司；ACQUITY UPLC BEH C18，2.1×10 mm（1.7 μm）色譜柱：濟(jì)南捷島分析儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 樣品前處理

將樣品用微型組織粉碎機(jī)進(jìn)行粉碎處理，處理的時(shí)間因樣品不同而不同，即為將樣品粉碎成粉末狀或漿狀，可適當(dāng)延長較難粉碎樣品的粉碎時(shí)間。

1.2.2 提取液制備

向樣品中加入乙腈10 mL（粉末樣品需先加適量的水使樣品完全潤濕），震蕩10 min；加入4 g無水硫酸鎂和1 g氯化鈉，震蕩5 min，以4 000 r/min的轉(zhuǎn)速離心5 min，上清液即為唑嘧磺草胺的提取液。

1.2.3 凈化

取1.5mL上清液于裝有凈化劑（30mgGCB+150mg MgSO4）的2mL塑料離心管中，渦旋1min，離心5min。取上述經(jīng)凈化處理的上清液過0.22 μm的有機(jī)系濾膜，入瓶待測。

1.2.4 液相色譜條件

色譜柱：ACQUITY UPLC BEH C18（2.1 mm×10 mm，1.7 μm）；柱溫：45 ℃；進(jìn)樣量：5 μL；流速：0.3 mL/min；流動相A：0.2%甲酸水溶液，流動相B：乙腈。梯度洗脫程序見表1。

表1 梯度洗脫程序Table 1 Procedures of gradient elution

1.2.5 質(zhì)譜條件

電離方式：正離子電噴霧（ESI+）模式，毛細(xì)管電壓4.0 kV，鞘氣溫度350℃，載氣流速12 L/min，霧化氣7 L/min，干燥氣、碰撞氣：氮?dú)?。反?yīng)（MRM）監(jiān)測模式檢測。質(zhì)譜分析參數(shù)見表2。

表2 質(zhì)譜分析參數(shù)Table 2 HPLC-MS/MS conditions

2 結(jié)果與討論

2.1 定性及定量離子峰的選擇

空白基質(zhì)（葡萄）在采用方法1.2.5中1和2通道時(shí)的離子峰見圖1，樣品（葡萄）加入0.01 mg/L水平濃度的唑嘧磺草胺后在采用方法1.2.5中1和2通道時(shí)的離子峰見圖2。

在對試驗(yàn)所選的檢測對象進(jìn)行檢測時(shí)發(fā)現(xiàn)，無論是水果還是蔬菜的空白基質(zhì)中都沒有發(fā)現(xiàn)相應(yīng)的唑嘧磺草胺的離子峰，因此本試驗(yàn)采用加標(biāo)方式，進(jìn)行質(zhì)譜條件優(yōu)化和基質(zhì)效應(yīng)、線性關(guān)系等驗(yàn)證。在進(jìn)行質(zhì)譜條件優(yōu)化時(shí)發(fā)現(xiàn)，采用方法中1和2通道時(shí)（見圖1和圖2的左上方），在加入0.01 mg/L水平濃度的唑嘧磺草胺后，除花椒外所選的檢測樣品都有兩個(gè)豐度較高的碎片離子，分別是192、129，本試驗(yàn)將192離子峰作為唑嘧磺草胺的定性峰，129離子峰作為唑嘧磺草胺的定量離子峰。但在花椒基質(zhì)中子離子192處，有很明顯的干擾峰，不能將192離子作為其定性離子。

圖1 空白基質(zhì)的質(zhì)譜圖Fig.1 Mass spectra of blank matrix

圖2 加標(biāo)（0.01 mg/L）基質(zhì)的質(zhì)譜圖Fig.2 Mass spectra of the labeled（0.01 mg/L）matrix

2.2 線性關(guān)系、基質(zhì)效應(yīng)的驗(yàn)證

基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性方程、相關(guān)系數(shù)和檢出限見表3。

表3 基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性方程、相關(guān)系數(shù)和檢出限Table 3 Matrix standard curve linear equation and correlation coefficients of compounds

分別用已知含量的唑嘧磺草胺制備成0.005、0.01、0.02、0.05、0.1、0.2 mg/L，6 個(gè)不同濃度的樣品，在所選定的條件下分別進(jìn)行測定，并以唑嘧磺草胺的質(zhì)量濃度（mg/L）為橫坐標(biāo)，以唑嘧磺草胺峰面積為縱坐標(biāo)，得到唑嘧磺草胺的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。在所確定的試驗(yàn)條件下，以峰面積和標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度作圖，溶液標(biāo)準(zhǔn)曲線在 1 μg/mL～200 μg/mL 濃度范圍內(nèi)呈良好線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)＞0.999。對11種基質(zhì)進(jìn)行驗(yàn)證時(shí)，除花椒基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線在5 μg/mL～200 μg/mL濃度范圍內(nèi)不呈良好線性關(guān)系，其相關(guān)系數(shù)R=0.819 3，在控制信噪比S/N≥10，其檢出限為89 μg/kg。其他11種基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線在5 μg/mL～200 μg/mL濃度范圍內(nèi)呈良好線性關(guān)系，其相關(guān)系數(shù)R＞0.995，檢出限范圍為0.1 μg/kg～33 μg/kg。由此推測試驗(yàn)方法對絕大多數(shù)樣品是適用的。

基質(zhì)效應(yīng)是在提取基質(zhì)中的目標(biāo)物時(shí)，基質(zhì)中的干擾物影響目標(biāo)化合物的離子化，使得目標(biāo)化合物在儀器上的響應(yīng)發(fā)生了增強(qiáng)或者抑制的現(xiàn)象，為提高目標(biāo)化合物的測定準(zhǔn)確度，需要對不同基質(zhì)產(chǎn)生的基質(zhì)效應(yīng)做出評價(jià)，并選擇合適的方法減小基質(zhì)效應(yīng)的干擾[7]。采用相對響應(yīng)值法：基質(zhì)效應(yīng)=純?nèi)軇?biāo)準(zhǔn)響應(yīng)值/空白基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)響應(yīng)值，基質(zhì)效應(yīng)大于1時(shí)，為基質(zhì)增強(qiáng)效應(yīng)，基質(zhì)效應(yīng)小于1時(shí)，為基質(zhì)抑制效應(yīng)[8]。檢測結(jié)果見表3，其中有5種樣品基質(zhì)是增強(qiáng)效應(yīng)，其中花椒基質(zhì)效應(yīng)達(dá)20.44，說明花椒基質(zhì)中有很明顯的物質(zhì)干擾唑嘧磺草胺的檢測，需要對花椒重新優(yōu)化凈化劑，6種基質(zhì)是抑制效應(yīng)，且7種的基質(zhì)效應(yīng)值超出了0.7～1.3，因此基質(zhì)效應(yīng)不可忽略。

2.3 準(zhǔn)確度和精密度

通過加標(biāo)回收試驗(yàn)，考察方法的準(zhǔn)確度和精密度（n=5），添加水平分別為 0.01、0.05、0.1 mg/kg。加標(biāo)回收試驗(yàn)結(jié)果見表4。

表4 基質(zhì)添加回收率及精密度測定結(jié)果（x±s，n=5）Table 4 Rusults of recovery and precision of determination（x±s，n=5）

結(jié)果表明，花椒在該添加水平中回收率只有44.4%～55.6%，是不符合分析要求的。而其他10種基質(zhì)的回收率在80%～116%，相對偏差0.4%～8.5%，由此該方法的準(zhǔn)確度和精密度符合這10種樣品的唑嘧磺草胺殘留分析要求。

2.4 花椒檢測條件再優(yōu)化

花椒空白基質(zhì)在采用方法1.2.5中1和3通道時(shí)的離子峰見圖3，花椒加入0.04 mg/L水平濃度的唑嘧磺草胺后在采用方法1.2.5中1和3通道時(shí)的離子峰見圖4。

圖3 花椒空白基質(zhì)的質(zhì)譜圖Fig.3 Mass spectra of blank matrix of Chinese prickly ash

圖4 花椒加標(biāo)（0.04 mg/L）基質(zhì)的質(zhì)譜圖Fig.4 Mass spectra of the labeled（0.04 mg/L）matrix of Chinese prickly ash

在2.1質(zhì)譜條件優(yōu)化時(shí)，發(fā)現(xiàn)花椒在192離子碎片處，有很明顯的其他干擾離子峰，因此不能將其作為定性峰。通過對質(zhì)譜條件的再優(yōu)化，即采用1.2.5方法中1和3通道對花椒進(jìn)行質(zhì)譜分析發(fā)現(xiàn)，在加標(biāo)0.04 mg/L后，如圖4，129離子碎片有一個(gè)很顯著的峰形。因此對于花椒采用方法1.2.5中的1和3通道進(jìn)行質(zhì)譜分析，129離子峰為其定性離子峰，109離子峰為定量離子峰。

在以上的樣品處理方法中，發(fā)現(xiàn)花椒的基質(zhì)干擾較大，造成其線性、回收都較差。為此，通過對凈化劑的選擇，分別比較了不同凈化劑及不同凈化劑按不同比例對樣品凈化效果的影響，選擇出對花椒凈化效果更好的凈化劑：40 mg PSA+10 mg GCB＋150 mg MgSO4。用該凈化劑處理花椒后，得到花椒的線性方程、相關(guān)系數(shù)、基質(zhì)效應(yīng)、檢出限、回收率及精密度分別為y=6 510.348 368x＋251.874 113、R=0.999 30、6.6、33 μg/kg、（75.1±0.9）%，由此該處理方法可以滿足花椒樣品的唑嘧磺草胺殘留分析的要求。

3 結(jié)論

通過對玉米，大豆，芹菜，茄子，韭菜，葡萄，柑橘，香菇，花生油，綠茶和花椒樣品中的唑嘧磺草胺進(jìn)行檢測分析發(fā)現(xiàn)，所選樣品唑嘧磺草胺含量極低，造成在樣品空白基質(zhì)的質(zhì)譜圖中沒有明顯的唑嘧磺草胺離子峰。通過質(zhì)譜條件的優(yōu)化，除花椒樣品外，其他樣品定性離子為192，而花椒為129。在所選樣品中，有5種樣品基質(zhì)是增強(qiáng)效應(yīng)，6種基質(zhì)是抑制效應(yīng)，且7種的基質(zhì)效應(yīng)值超出了0.7～1.3。最后確定對于大多數(shù)基質(zhì)可以采用30 mg GCB＋150 mg MgSO4作為凈化劑，花椒這類質(zhì)譜基質(zhì)效應(yīng)較強(qiáng)的樣品凈化劑為40 mg PSA+10 mg GCB＋150 mg MgSO4。

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Determination of Flumetsulam in Food by HPLC-MS

WANG Xin，LI Dao-xia，LIU Mei，WANG Ying，YU Xiao-qin
（Sichuan Institute for Food and Drug Control，Chengdu 610097，Sichuan，China）

To establish the method for detection of flumetsulam residues，this experiment adopts HPLC-MS instrument testing samples of flumetsulam.The results showed that the samples were extracted by acetonitrile，then after the extraction was dealt with purifying agent（Chinese prickly ash：40 mg PSA+10 mg GCB+150 mg MgSO4，other samples：30 mg GCB+150 mg MgSO4）.The pure standard curve of the solvent in 1 μg/mL-200 μg/mL had a good linear relationship（R＞ 0.999），and 11 kinds of samples of matrix standard curve in 5 μg/mL-200 μg/mLalso had a good linear relationship（R＞ 0.995），and detection limit range was 0.1 μg/kg-33 μg/kg，so the experiment method could meet the requirements of analysis of flumetsulam.

flumetsulam；high performance liquid chromatography-mass spectrometry （HPLC-MS）；determination

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.21.032

王鑫（1983—），女（漢），工程師，碩士研究生，研究方向：食品檢測。

2017-01-20