高效液相-示差折光法測(cè)定米酒中3種糖的含量

楊成聰，凌霞，胡偉偉，張振東，范文瑩，郭壯，*

（1.湖北文理學(xué)院化學(xué)工程與食品科學(xué)學(xué)院鄂西北傳統(tǒng)發(fā)酵食品研究所，湖北襄陽(yáng)441053；2.襄陽(yáng)市食品藥品檢驗(yàn)所，湖北襄陽(yáng)441021）

高效液相-示差折光法測(cè)定米酒中3種糖的含量

楊成聰1，凌霞2，胡偉偉1，張振東1，范文瑩1，郭壯1，*

（1.湖北文理學(xué)院化學(xué)工程與食品科學(xué)學(xué)院鄂西北傳統(tǒng)發(fā)酵食品研究所，湖北襄陽(yáng)441053；2.襄陽(yáng)市食品藥品檢驗(yàn)所，湖北襄陽(yáng)441021）

建立應(yīng)用高效液相-示差折光法同時(shí)測(cè)定米酒中葡萄糖、蔗糖和麥芽糖含量的方法。結(jié)果表明當(dāng)檢測(cè)器為示差折光檢測(cè)器，InertSustain NH2氨基色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），流動(dòng)相中乙腈和水的體積比為 75∶25，流速1.0 mL/min，進(jìn)樣量10 μL，檢測(cè)器和色譜柱溫度均為35℃時(shí)，混標(biāo)及米酒樣品中的3種糖在10 min內(nèi)均達(dá)到基線分離，最低檢測(cè)限為0.006 g/100 g，精密性試驗(yàn)相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差值為0.115%、0.045%和0.220%，重復(fù)性試驗(yàn)相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差值為0.670%、0.429%和0.723%，平均回收率為99.65%、100.85%和99.43%。由此可見(jiàn)，高效液相-示差折光法結(jié)果準(zhǔn)確可靠，適用于米酒中糖的快速分析。

高效液相色譜法；示差折光檢測(cè)器；米酒；葡萄糖；蔗糖；麥芽糖

米酒又稱糯米酒、酒釀或醪糟，是以糯米為主要原料，經(jīng)酒曲等糖化發(fā)酵劑發(fā)酵而成，具有酸甜可口、營(yíng)養(yǎng)豐富等特點(diǎn)[1]。糖類作為米酒的主要物質(zhì)成分，不僅直接決定了米酒的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，同時(shí)通過(guò)影響酸甜度亦直接決定了消費(fèi)者對(duì)米酒的喜好程度，因而對(duì)米酒中糖的種類和含量進(jìn)行測(cè)定是極為必要的。

目前食品基質(zhì)中可溶性糖的檢測(cè)方法主要有苯酚-硫酸法[2]、離子色譜法[3]、毛細(xì)管電泳法[4]、氣相色譜法[5]和高效液相色譜法[6]等。值得一提的是，目前專門針對(duì)米酒的食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)尚未發(fā)行，參考使用的GB 2758-2012《發(fā)酵酒及其配制酒》中亦沒(méi)有對(duì)米酒中糖含量的測(cè)定方法進(jìn)行描述[7]。行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)[8]或某些地方性標(biāo)準(zhǔn)[9]對(duì)米酒中蔗糖或還原糖的測(cè)定方法進(jìn)行了約束，均參照了國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 5009.8-2008《食品中蔗糖的測(cè)定》或GB/T 5009.7-2008《食品中還原糖的測(cè)定》中的方法，其中GB/T 5009.8-2008指定的是高效液相色譜示差折光檢測(cè)法（high performance liquid chromatography-refractive index detector，HPLC-RID）或酸水解法，GB/T 5009.7-2008指定的是直接滴定法或高錳酸鉀滴定法。值得一提的是，雖然相對(duì)于其他方法HPLC-RID存在靈敏度差等缺點(diǎn)，但可以對(duì)樣品中游離小分子糖進(jìn)行快速檢測(cè)[10]。

本研究采用HPLC-RID對(duì)米酒中的葡萄糖、蔗糖和麥芽糖含量進(jìn)行了測(cè)定，并對(duì)樣品前處理及色譜條件進(jìn)行了優(yōu)化，實(shí)現(xiàn)了米酒中3種糖的快速定量分析，對(duì)米酒生產(chǎn)廠家產(chǎn)品的自我檢測(cè)和相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)的制定提供了參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

米酒：市售；葡萄糖、蔗糖、麥芽糖（均為標(biāo)準(zhǔn)品）：上海金穗生物科技有限公司；乙腈、異丙醇（均為色譜純）：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；三氯乙酸（分析純）：洛陽(yáng)化學(xué)試劑廠；0.45 μm微孔濾膜：上海半島實(shí)業(yè)有限公司凈化器材廠。

LC-20ADXR高效液相色譜儀（配置有SIL-20A XR自動(dòng)進(jìn)樣器、LC-20AD XR四元低壓梯度泵、CTO-10AS vp柱溫箱、RID-20A示差折光檢測(cè)器）、Inert－Sustain NH2氨基色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）：日本島津公司；3K15臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)：德國(guó)Sigma實(shí)驗(yàn)室離心機(jī)股份有限公司；HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋：江蘇省金壇市榮華儀器制造有限公司；BXM-30R立式壓力蒸汽滅菌器：上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；KH-100DY超聲波清洗機(jī)：昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 色譜條件的優(yōu)化

1.2.1.1 供試品溶液的制備

分別稱取1.000 g經(jīng)過(guò)干燥的葡萄糖、蔗糖和麥芽糖標(biāo)準(zhǔn)品，溶解并定容至同一50 mL容量瓶中，配制成含量為20 mg/mL的3種糖的混合供試溶液。

1.2.1.2 流動(dòng)相的選擇

流動(dòng)相：分別設(shè)置乙腈和水的體積比為85∶15、80 ∶20 和 75 ∶25；進(jìn)樣量：10 μL；檢測(cè)器：示差折光檢測(cè)器；色譜柱：InertSustain NH2氨基色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；檢測(cè)器溫度：40℃；色譜柱溫度：40℃；流速：1.0 mL/min。

1.2.1.3 檢測(cè)器和色譜柱溫度的選擇

檢測(cè)器溫度：分別設(shè)置為30、35、40℃；色譜柱溫度：同檢測(cè)器溫度；進(jìn)樣量：10 μL；檢測(cè)器：示差折光檢測(cè)器；色譜柱：InertSustain NH2氨基色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流速：1.0 mL/min；流動(dòng)相：乙腈和水體積比 75∶25。

1.2.1.4 流速的選擇

流速：分別設(shè)置為 0.8、1.0、1.2、1.5 mL/min；進(jìn)樣量：10 μL；檢測(cè)器：示差折光檢測(cè)器；InertSustain NH2氨基色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：乙腈和水體積比75∶25；檢測(cè)器溫度：35℃；色譜柱溫：35℃。

1.2.2 米酒中3種糖含量的測(cè)定

1.2.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

分別稱取2.000 g經(jīng)過(guò)干燥的葡萄糖、蔗糖和麥芽糖標(biāo)準(zhǔn)品，溶解并定容至同一50 mL容量瓶中，配制成含量為40 mg/mL的3種糖的混合標(biāo)準(zhǔn)品貯備溶液。分別吸取 0.1、0.5、1.0、2.0、5.0 mL 上述混合標(biāo)準(zhǔn)品貯備溶液于10 mL的容量瓶中用超純水定容，制備分別相當(dāng)于 0.4、2、4、8、20 mg/mL 的標(biāo)準(zhǔn)品溶液，溶液過(guò)0.45 μm的濾膜備用。分別以3種糖的濃度為自變量x，以峰面積為因變量y，采用外標(biāo)法進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算。

色譜條件為：流速 1.0 mL/min，進(jìn)樣量為 10 μL，檢測(cè)器為示差折光檢測(cè)器，色譜柱為InertSustain NH2氨基色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），流動(dòng)相是體積比為75∶25的乙腈和水混合溶液，檢測(cè)器和色譜柱溫度均為35℃。

1.2.2.2 米酒樣品的采集

從襄陽(yáng)市沃爾瑪超市購(gòu)買7個(gè)品牌10個(gè)品名的米酒樣品，編號(hào)依次為XG1-XG10。

1.2.2.3 米酒預(yù)處理方式對(duì)3種糖含量測(cè)定的影響分別按照下述3種方式對(duì)米酒樣品進(jìn)行預(yù)處理。方法I：米酒樣品用超純水稀釋5倍，10 000 r/min離心10 min，上清液過(guò)0.45 μm濾膜后備用。

方法II：2 g米酒樣品與1 mL 50%三氯乙酸溶液混合，并用超純水定容至10 mL，室溫放置30 min，10 000 r/min離心10 min，上清液過(guò)0.45 μm濾膜后備用。

方法III：米酒樣品用超純水稀釋5倍，10 000 r/min離心10 min，取上清液于121℃熱處理15 min后再次10 000 r/min離心10 min，上清液過(guò)0.45 μm濾膜備用。

1.2.2.4 米酒中葡萄糖、蔗糖和麥芽糖含量的測(cè)定

所有樣品均按照1.2.2.3節(jié)中處理I方式進(jìn)行處理，按照1.2.2.1節(jié)色譜條件進(jìn)行測(cè)定。

1.2.3 方法性能研究

1.2.3.1 精密性試驗(yàn)

將1.2.1.1中的供試品溶液，不間斷進(jìn)樣7次，分別對(duì)葡萄糖、蔗糖和麥芽糖的峰面積進(jìn)行測(cè)定，同時(shí)對(duì)其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差值（relative standard deviation，RSD）進(jìn)行計(jì)算[11]。色譜條件同1.2.2.1。

1.2.3.2 重復(fù)性試驗(yàn)

將XG2樣品用超純水稀釋5倍后，10 000 r/min離心10 min，上清液過(guò)0.45 μm濾膜，濾液備用。按照1.2.2.1中的色譜條件進(jìn)行3種糖峰面積的測(cè)定。試驗(yàn)重復(fù)7次。

1.2.3.3 加樣回收率試驗(yàn)

將XG6樣品用超純水稀釋5倍，10 000 r/min離心10 min，上清液過(guò)0.45 μm濾膜，濾液備用。濾液分為4份，1份不做任何處理，另外3份添加一定量的3種糖的混合溶液后在最優(yōu)的色譜條件下進(jìn)行測(cè)定。色譜條件同1.2.2.1。

1.2.4 統(tǒng)計(jì)分析

使用 Matlab 2010b軟件（The MathWorks，Natick，MA，USA），采用配對(duì)t檢驗(yàn)對(duì)不同預(yù)處理方式樣品中3種糖含量的差異性進(jìn)行分析。使用高效液相色譜工作站自帶的LCsolution軟件將色譜圖另存為數(shù)據(jù)矩陣后，使用 Origin 8.5軟件（OriginLab，MA，USA）作圖。

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜條件的優(yōu)化

2.1.1 流動(dòng)相配比的選擇

在InertSustain NH2氨基色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），流速1.0 mL/min，檢測(cè)器和色譜柱溫度均為40℃的固定條件下，調(diào)節(jié)乙腈和水體積比分別為85∶15、80∶20和75∶25，流動(dòng)相構(gòu)成對(duì)3種糖保留時(shí)間的影響如圖1所示。

圖1 流動(dòng)相構(gòu)成對(duì)3種糖保留時(shí)間的影響Fig.1 Effect of mobile phase composition on retention time of 3 kinds of carbohydrate

由圖1可知，當(dāng)乙腈和水體積比為85∶15、80∶20或75∶25時(shí)，3種糖均會(huì)完全分離開(kāi)來(lái)，然而流動(dòng)相中乙睛和水的比例對(duì)3種糖的保留時(shí)間具有明顯的影響，其中當(dāng)乙睛和水的體積比為85∶15時(shí)，3種糖的保留時(shí)間明顯大于體積比為80∶20和75∶25，且選擇后2個(gè)比例時(shí)3種糖的保留時(shí)間差異不明顯。值得一提的是，當(dāng)乙睛和水的體積比為80∶20時(shí)，3種糖的峰形出現(xiàn)輕微拖尾現(xiàn)象，因而本研究流動(dòng)相中乙腈和水的體積比最終選定為75∶25。

2.1.2 檢測(cè)器和色譜柱溫度的選擇

在InertSustain NH2氨基色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），流動(dòng)相乙腈和水體積比為 75 ∶25，流速 1.0 mL/min的固定條件下，調(diào)節(jié)溫度分別為30、35、40℃進(jìn)行試驗(yàn)，檢測(cè)器和色譜柱溫度對(duì)3種糖保留時(shí)間的影響如圖2所示。

由圖2可知，當(dāng)檢測(cè)器和色譜柱溫度均為30℃時(shí)，色譜圖的基線發(fā)生了偏移。當(dāng)檢測(cè)器和色譜柱均為35℃和40℃時(shí)色譜圖基線平穩(wěn)，且各糖的出峰時(shí)間差異不大，因而本研究檢測(cè)器和色譜柱的溫度最終選定為35℃。

圖2 檢測(cè)器和色譜柱溫度對(duì)3種糖保留時(shí)間的影響Fig.2 Effect of detector and column temperature on retention time of 3 kinds of carbohydrate

2.1.3 流速的選擇

在InertSustain NH2氨基色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），檢測(cè)器和色譜柱溫度均為35℃，流動(dòng)相乙腈和水體積比為75∶25的固定條件下，調(diào)節(jié)流速分別為 0.8、1.0、1.2、1.5 mL/min進(jìn)行試驗(yàn)，試驗(yàn)結(jié)果如圖3所示。

圖3 流動(dòng)相流速對(duì)3種糖保留時(shí)間的影響Fig.3 Effect of mobile phase flow rate on retention time of 3 kinds of carbohydrate

由圖3可知，當(dāng)流速為0.8 mL/min時(shí)，色譜圖的基線發(fā)生了偏移。當(dāng)流速為1.0、1.2、1.5 mL/min時(shí)色譜圖基線平穩(wěn)，且流速為1.2 mL/min時(shí)各糖的出峰時(shí)間明顯比1.0 mL/min時(shí)短，而流速為1.2 mL/min和1.5 mL/min時(shí)各糖的出峰時(shí)間差異不大。此外，流動(dòng)相流速越大則柱壓亦越大，因而在保證分離度、最大限度的縮短試驗(yàn)時(shí)間和不傷害柱子的前提下，本研究流動(dòng)相的流速最終選定為1.2 mL/min。

2.2 米酒中3種糖含量的測(cè)定

2.2.1 標(biāo)準(zhǔn)回歸方程

將1.2.1.1節(jié)制備得到的不同質(zhì)量濃度的葡萄糖、蔗糖和麥芽糖標(biāo)準(zhǔn)溶液在1.2.2.1節(jié)條件下進(jìn)行HPLC測(cè)定，得到了不同質(zhì)量濃度的3種糖混合標(biāo)準(zhǔn)品的HPLC圖。分別以各糖濃度為自變量x，以峰面積為因變量y進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程的計(jì)算，結(jié)果如表1所示。

表1 葡萄糖、蔗糖和麥芽糖的回歸方程Table 1 Linear regression equations of detection for glucose，sucrose and maltose

由表1可知，3種糖的回歸方程的相關(guān)系數(shù)范圍均在0.999以上，由此可見(jiàn)，各糖的濃度和峰面積之間具有良好的線性關(guān)系，這也說(shuō)明本研究所采用的HPLC-RID法可以準(zhǔn)確的測(cè)定葡萄糖、蔗糖和麥芽糖的含量。

2.2.2 米酒預(yù)處理方式對(duì)3種糖含量測(cè)定的影響

選取XG6、XG8和XG10等3個(gè)米酒樣品，分別采用1.2.2.3中的3種方法進(jìn)行樣品預(yù)處理，并按照1.2.2.1節(jié)色譜條件進(jìn)行3種糖含量的測(cè)定，其結(jié)果如表2所示。

表2 不同預(yù)處理方式對(duì)米酒中葡萄糖、蔗糖和麥芽糖含量測(cè)定的影響（n=3）Table 2 The effect of different pretreatme of rice wine on determination for 3 kinds of carbohydrate（n=3）

由表2可知，采用方法I和II處理的米酒樣品經(jīng)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)其葡萄糖、蔗糖和麥芽糖的含量差異均不顯著（p＞0.05）。由圖3亦可知，采用方法III處理的米酒樣品經(jīng)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)其蔗糖含量極顯著低于其他兩種處理方式（p＜0.001），而葡萄糖和麥芽糖差異均不顯著（p＞0.05）。值得一提的是，采用方法III進(jìn)行樣品預(yù)處理時(shí)，米酒樣品受熱由乳白色變?yōu)樯铧S色，因而本研究中米酒樣品預(yù)處理方式最終選定為方法I，即樣品用超純水稀釋5倍后，10 000 r/min離心10 min，上清液過(guò)0.45 μm濾膜后直接上機(jī)測(cè)試。

2.2.3 米酒中葡萄糖、蔗糖和麥芽糖含量的測(cè)定

樣品用超純水稀釋5倍后，10 000 r/min離心10 min，上清液過(guò)0.45 μm濾膜后，利用配備有示差折光檢測(cè)器的HPLC儀，按照1.3.2.1節(jié)的方法對(duì)10個(gè)米酒樣品中葡萄糖、蔗糖和麥芽糖的含量進(jìn)行測(cè)定，其結(jié)果如表3所示。

表3 HPLC-RID法測(cè)定米酒中葡萄糖、蔗糖和麥芽糖含量（n=3）Table 3 Contents of glucose，sucrose and maltose in commercial xiaogan rice wine assayed by HPLC-RID（n=3）

由表3可知，10個(gè)米酒樣品中只有2個(gè)樣品檢測(cè)出了蔗糖，其含量分別為2.25 g/100 g和0.73 g/100 g，所有樣品中均檢測(cè)出了葡萄糖和麥芽糖，其中葡萄糖的含量范圍在9.45 g/100 g～30.47 g/100 g，麥芽糖的含量范圍在 0.82 g/100 g～4.59 g/100 g。

2.3 方法性能研究

2.3.1 精密性試驗(yàn)結(jié)果

精密吸取1.2.1.1節(jié)的20 mg/mL的3種糖的混合供試溶液，按1.2.2.1節(jié)的色譜條件操作，連續(xù)進(jìn)樣7次，分別測(cè)量各糖的峰面積，計(jì)算葡萄糖、蔗糖和麥芽糖的RSD，其結(jié)果如表4所示。

表4 精密度試驗(yàn)結(jié)果Table 4 Results of precision test

由表4可知，葡萄糖、蔗糖和麥芽糖的RSD值分別是0.115%、0.045%和0.220%，由此可見(jiàn)，本研究所采用的HPLC-RID法在測(cè)定上述3種糖的含量時(shí)具有良好的精密性。

2.3.2 重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果

稱取XG2米酒樣品5份，按1.2.3.2節(jié)的方法和1.2.2.1節(jié)的色譜操作條件，重復(fù)進(jìn)樣7次，進(jìn)行葡萄糖、蔗糖和麥芽糖含量的測(cè)定，其結(jié)果如表5所示。

表5 重復(fù)性試驗(yàn)Table 5 Result of repetitive test

由表5可知，葡萄糖、蔗糖和麥芽糖的RSD值分別是0.670%、0.429%和0.723%，由此可見(jiàn)，本試驗(yàn)重復(fù)性良好，可以達(dá)到色譜分析的要求。

2.3.3 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果

稱取XG6米酒樣品，按1.2.3.3節(jié)的方法和1.2.2.1節(jié)的色譜操作條件，分別測(cè)定不同處理樣品中葡萄糖、蔗糖和麥芽糖的含量，加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果如表6所示。

表6 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果Table 6 Results of spike recovery test

由表6可知，葡萄糖、蔗糖和麥芽糖的回收率分別是99.65%、100.85%和99.43%，由此可見(jiàn)，采用HPLC-RID法進(jìn)行米酒中3種糖含量測(cè)定時(shí)具有較高的回收率，可以滿足色譜定量分析的需求。

3 結(jié)論

本研究建立了米酒中葡萄糖、蔗糖和麥芽糖的測(cè)定方法，其中檢測(cè)器為示差折光檢測(cè)器，InertSustain NH2氨基色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），流動(dòng)相中乙腈和水的體積比為75∶25，流速1.0 mL/min，進(jìn)樣量10 uL，檢測(cè)器和色譜柱溫度均為35℃，用該方法對(duì)米酒中3種糖的測(cè)定具有分離性較好、重復(fù)性好、精密度和回收率高等特點(diǎn)。使用該方法研究發(fā)現(xiàn)，米酒中葡萄糖的含量為9.45 g/100 g～30.47 g/100 g，麥芽糖的含量為0.82 g/100 g～4.59 g/100 g，而蔗糖僅存在部分樣品中，含量分別為2.25 g/100 g和0.73 g/100 g。

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Determination of 3 Kinds of Carbohydrate in Rice Wine by HPLC-RID Method

YANG Cheng-cong1，LING Xia2，HU Wei-wei1，ZHANG Zhen-dong1，F(xiàn)AN Wen-ying1，GUO Zhuang1，*
（1.Northwest Hubei Research Institute of Traditional Fermented Food，College of Chemical Engineering and Food Science，Hubei University of Arts and Science，Xiangyang 441053，Hubei，China；2.Xiangyang Institute of Food and Drug Supervision，Xiangyang 441021，Hubei，China）

The method for simultaneously determining glucose，sucrose and maltose in rice wine by high performance liquid chromatography-refractive index detector method（HPLC-RID）was established.The separation was carried out on InertSustain NH2amino column（250 mm×4.6 mm，5 μm），mobile phase was acetonitrilewater（75∶25），flow rate was 1.0 mL/min，sample size was 10 μL，and column and detector temperature was 35℃.The glucose，sucrose and maltose were simultaneous separated under the optimized conditions within 10 minutes，the detection limit was 0.006 g/100 g，the results of precision test were 0.115%，0.045%and 0.220%，the relative standard deviation（RSD）of repetitive test were 0.670%，0.429%and 0.723%，and the results of spike recovery test were 99.65%，100.85%and 99.43%.Thus，HPLC-RID with the properties of accurate and reliable，and could be applied for the rapid analysis of carbohydrate in rice wine.

high performance liquid chromatography；refractive index detector；rice wine；glucose；sucrose；maltose

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.21.026

湖北省高等學(xué)校優(yōu)秀中青年科技創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)計(jì)劃項(xiàng)目（T201616）

楊成聰（1996—），男（漢），本科在讀，主要從事食品生物技術(shù)研究。

*通信作者

2017-02-19