沖天湖底泥表層微囊藻休眠體復(fù)蘇與菌群動(dòng)態(tài)

鄒萬(wàn)生,王 智,劉良國(guó),王文彬,石迎普

1 湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院, 長(zhǎng)沙 410218 2 湖南文理學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院, 常德 415000 3 水產(chǎn)高校健康生產(chǎn)湖南省協(xié)同創(chuàng)新中心與動(dòng)物學(xué)湖南省高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 常德 415000

沖天湖底泥表層微囊藻休眠體復(fù)蘇與菌群動(dòng)態(tài)

鄒萬(wàn)生1,2,3,王 智1,*,劉良國(guó)2,3,王文彬2,3,石迎普2

1 湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院, 長(zhǎng)沙 410218 2 湖南文理學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院, 常德 415000 3 水產(chǎn)高校健康生產(chǎn)湖南省協(xié)同創(chuàng)新中心與動(dòng)物學(xué)湖南省高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 常德 415000

對(duì)頻繁暴發(fā)微囊藻水華的西洞庭沖天湖表層底泥和上覆水取樣,檢測(cè)和分析了底泥表層微囊藻休眠體豐度和菌濃度、上覆水中微囊藻細(xì)胞豐度和菌濃度以及部分理化性質(zhì),結(jié)合室內(nèi)模擬試驗(yàn)。結(jié)果表明：2—6月份沖天湖底泥表層和上覆水中總菌濃度均顯著上升(P<0.05),底泥表層總菌濃度顯著高于上覆水(P<0.05),優(yōu)勢(shì)菌群均為微小桿菌屬(Exiguobacterium)、假單胞菌屬(Pseudomonas)和芽孢桿菌屬(Bacillus)；4月份底泥表層微囊藻休眠體開(kāi)始復(fù)蘇且休眠體豐度下降,6月份休眠體豐度顯著低于4—5月份(P<0.05),而上覆水中微囊藻細(xì)胞豐度上升,6月份顯著高于4—5月份(P<0.05)；復(fù)蘇優(yōu)勢(shì)藻為銅綠微囊藻(Microcystisaeruginosa)、水華微囊藻(Microcystisflos-aqua)和惠氏微囊藻(Microcystiswesenbergii)；復(fù)蘇期間促休眠體復(fù)蘇優(yōu)勢(shì)菌群濃度顯著上升、“底泥-上覆水”界面溶解氧濃度與TN/TP比顯著下降(P<0.05)。說(shuō)明沖天湖底泥表層和上覆水優(yōu)勢(shì)菌群可能通過(guò)改變底泥表層理化環(huán)境影響微囊藻休眠體復(fù)蘇。

微囊藻；休眠體；優(yōu)勢(shì)菌群；復(fù)蘇；底泥；上覆水

淡水微囊藻水華頻繁暴發(fā)得益于微囊藻細(xì)胞在受到外界環(huán)境脅迫時(shí)能形成營(yíng)養(yǎng)休眠體,以渡過(guò)生長(zhǎng)環(huán)境惡劣時(shí)期,當(dāng)環(huán)境條件適宜時(shí)微囊藻休眠體啟動(dòng)復(fù)蘇,再次種群暴發(fā),形成水華[1- 3]。微囊藻水華發(fā)生初期的藻細(xì)胞或種源主要來(lái)源于“越冬”的微囊藻休眠體群[4- 5]。長(zhǎng)期以來(lái),許多環(huán)境科學(xué)工作者一直圍繞微囊藻休眠體復(fù)蘇的機(jī)理展開(kāi)研究,以期能找到從源頭控制微囊藻暴發(fā)水華的方法。目前,關(guān)于微囊藻休眠體復(fù)蘇的生態(tài)生理學(xué)研究主要集中在溫度[6- 8]、光照強(qiáng)度[8- 9]、營(yíng)養(yǎng)鹽[10- 13]以及水動(dòng)力等領(lǐng)域[14- 16],很少有關(guān)于生物因子對(duì)微囊藻休眠體復(fù)蘇的影響研究,特別是底泥表層菌群對(duì)微囊藻休眠體復(fù)蘇的影響研究更為鮮見(jiàn)。水域底泥表層環(huán)境極其復(fù)雜,底泥表層和上覆水中菌群是水域中重要的組成成員,它們與眾多生物及環(huán)境要素一起構(gòu)成復(fù)雜的“底泥-上覆水”生態(tài)系統(tǒng),這些菌群與微囊藻休眠體復(fù)蘇及暴發(fā)水華之間是否存在一定的關(guān)聯(lián)性不得而知。本文就此對(duì)頻繁暴微囊藻水華的湖南常德西洞庭沖天湖永豐垸水域進(jìn)行了為期一年的底泥和上覆水水樣采集及水體部分理化指標(biāo)的測(cè)定,通過(guò)對(duì)底泥及上覆水中藻、菌的月動(dòng)態(tài)變化分析,結(jié)合室內(nèi)模擬實(shí)驗(yàn),以期從藻菌關(guān)系角度探討微囊藻休眠體復(fù)蘇與菌群動(dòng)態(tài)關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 底泥與水樣采集選址

沖天湖位于湖南省常德市鼎城區(qū)石拱橋鎮(zhèn)東北側(cè),面積約15.7 km2的典型淡水湖泊,枯水期平均水深1.35m,豐水期平均水深1.80m,系西洞庭湖水系。由于大力發(fā)展人工珍珠養(yǎng)殖業(yè),沖天湖已成為重度富營(yíng)養(yǎng)化湖泊,頻繁暴發(fā)藍(lán)藻水華。本實(shí)驗(yàn)底泥與水樣采集地點(diǎn)選在沖天湖永豐垸水域(圖1),取樣點(diǎn)3個(gè),即A(111°90′059″E,29°14′386″N)、B(111°90′462″E,29°13′963″N)和C(111°90′922″E,29°13′881″N)。

圖1 沖天湖取樣點(diǎn)示意圖Fig.1 sampling sites in lake Chongtian

1.2 樣品的采集與處理

樣品采集從2015年1月 1日開(kāi)始,至2015年12月30 日結(jié)束。每10d采樣1次,每月采樣3次。

1.2.1 底泥采集與處理

用便捷式沉積物柱狀取樣器(KC-Denmark公司,丹麥)對(duì)A、B、C三個(gè)取樣點(diǎn)進(jìn)行底泥取樣,取柱狀底泥表層3cm樣品,混勻后用120目(孔徑125um)分樣篩過(guò)濾預(yù)處理后,裝入已滅菌編號(hào)的樣品袋中,置于4℃手提式恒溫箱內(nèi)保存,帶回實(shí)驗(yàn)室。

1.2.2微囊藻捕捉器(Trap)[9]及其內(nèi)上覆水樣采集[17](用于捕捉從底泥中復(fù)蘇的休眠體藻細(xì)胞)

微囊藻捕捉器是半徑20cm、高180cm的特制透明塑料筒,底部開(kāi)口并固置于底泥表層。捕捉器四周壁下部有小孔并用10 μm孔徑篩網(wǎng)覆蓋,允許湖水交換,頂端有具橡膠塞,可用小型抽水器從頂端抽取水樣。本實(shí)驗(yàn)上覆水層指底泥表層0—10cm處水體。捕捉器在取樣點(diǎn)A、B、C各放置1個(gè),實(shí)驗(yàn)第1次放置后立即抽出筒內(nèi)水樣,消除原上覆水中微囊藻細(xì)胞對(duì)復(fù)蘇實(shí)驗(yàn)的影響。用Micros水樣采集器(單管,德國(guó))采集捕捉器內(nèi)上覆水樣,將每個(gè)采集點(diǎn)的上覆水樣充分混勻并裝入3個(gè)已滅菌編號(hào)的250mL塑料瓶中。水樣置于4℃手提式恒溫箱內(nèi)保存(其中一瓶加入Lugol′s試劑10mL,用于測(cè)定藻濃度),帶回實(shí)驗(yàn)室。

1.2.3微囊藻捕捉器外上覆水水樣采集與處理： 與微囊藻捕捉器內(nèi)上覆水水樣采集方法相同且同步進(jìn)行。

1.3 細(xì)菌培養(yǎng)基及培養(yǎng)

所用培養(yǎng)基為淡水細(xì)菌專(zhuān)用FWA培養(yǎng)基,配方為：蛋白胨5g、酵母膏1g、磷酸鐵0.01g、瓊脂15g、蒸餾水1000 mL,pH =7.3、121 ℃條件滅菌20 min倒平板。

1.3.1 底泥細(xì)菌的培養(yǎng)

在實(shí)驗(yàn)室將3個(gè)取樣點(diǎn)的底泥樣品倒進(jìn)已經(jīng)滅菌的250mL燒杯中,充分混勻；取1mL混勻底泥樣品加入到9mL無(wú)菌蒸餾水中進(jìn)行梯度稀釋,以此方法稀釋梯度10-1—10-7；各吸取10-5—10-7樣品溶液0.1mL于FWA淡水培養(yǎng)基平板涂布,培養(yǎng)48h后選擇合適的梯度平板進(jìn)行計(jì)數(shù)。

1.3.2 微囊藻捕捉器內(nèi)外上覆水中細(xì)菌的培養(yǎng)

從沒(méi)加Lugol′s試劑的塑料瓶中吸取1mL水樣,加入到9mL無(wú)菌蒸餾水中進(jìn)行梯度稀釋。稀釋梯度10-1—10-7,吸取10-5—10-7樣品溶液0.1mL于FWA淡水培養(yǎng)基平板涂布,培養(yǎng)48h后選擇合適的梯度平板計(jì)數(shù)。

1.4 細(xì)菌的分離與鑒定

1.4.1 分離

從平板上隨機(jī)挑取10株細(xì)菌,在新平板培養(yǎng)基上劃線(xiàn)純化。每培養(yǎng) 48 h 進(jìn)行1次劃線(xiàn),直到獲得純的菌株。將獲得的單一菌株用 15 % 的甘油生理鹽水制成菌懸液,在-80℃超低溫冰箱內(nèi)保藏。

1.4.2 細(xì)菌的鑒定

細(xì)菌分子生物學(xué)鑒定(16SrDNA)：挑取單菌落接種到10 mL LB培養(yǎng)基中37℃振蕩過(guò)夜培養(yǎng)；取2 mL培養(yǎng)液到2 mL EP管中,8000 r/min離心2min后倒掉上清液；加140 μLTE打散細(xì)菌,再加入60 μL 10 mg/mL的溶菌酶；37℃放置10min；加入400 μL Digestion Buffer,混勻。再加入3 μL 蛋白酶K,混勻,55℃溫育5min；加入260 μL乙醇,混勻,全部轉(zhuǎn)入U(xiǎn)NIQ- 10柱中。10000 r/min離心1min,倒去收集管內(nèi)的液體；加入500 μL 70%乙醇(Wash Solution),10000 r/min離心0.5min；再10000 r/min離心2min徹底甩干乙醇。吸附柱轉(zhuǎn)移到一個(gè)新的1.5mL的離心管；加入50μL預(yù)熱(60℃)的洗脫緩沖液,室溫放置3min。12000 r/min離心2min,流下的液體即為基因組DNA；以DNA為模板,采用細(xì)菌通用引物：正向引物27 F： 5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG- 3′和反引物1492 R：5′-GGTTACCTTGTTACGACTT- 3′擴(kuò)增細(xì)菌16S rDNA序列,引物由上海生工合成,回收的片段也由上海生工進(jìn)行測(cè)序,測(cè)序引物為16S PCR引物；將測(cè)序的結(jié)果進(jìn)行NCBI序列比對(duì),鑒定菌種。

1.5 微囊藻(休眠體)的鑒定和計(jì)數(shù)

1.5.1 微囊藻捕捉器內(nèi)外上覆水中微囊藻

將加入Lugol′s試劑的水樣充分搖勻,用40KHZ超聲波解聚2min,用血球計(jì)數(shù)板(25×16)鏡檢。微囊藻的分類(lèi)鑒定參照文獻(xiàn)[18],計(jì)算各藻豐度和總藻豐度[19]。

1.5.2 底泥中微囊藻休眠體

將4%的甲醛溶液與蒸餾水按體積比1∶1配置成甲醛混合溶液,再取1 mL混勻底泥樣品用40%的硅石膠(percoll)懸浮液預(yù)處理后加入到9mL甲醛混合溶液中進(jìn)行稀釋。取1 mL樣液于水生植物計(jì)數(shù)板上靜置4h,用倒置熒光顯微鏡進(jìn)行鏡檢分類(lèi)并計(jì)數(shù)[9]。

1.6 上覆水水體理化指標(biāo)測(cè)定

使用便捷式多功能水質(zhì)檢測(cè)儀(梅特勒FG4-B)現(xiàn)場(chǎng)測(cè)定上覆水溫度(T)、pH與溶解氧(DO),重復(fù)測(cè)定3次；總氮(TN)采用堿性過(guò)硫酸鉀紫外分光光度法(GB11894- 89),總磷(TP)采用鉬酸銨分光光度法(GB11893- 89)。

1.7 室內(nèi)模擬實(shí)驗(yàn)

將淺層底泥高壓蒸汽滅菌(121℃條件下滅菌20 min),冷卻后取200mL底泥均勻平鋪于直徑15cm、高50cm的特制圓形刻度玻璃筒中；將步驟1.4分離出的各優(yōu)勢(shì)菌和步驟1.5分離出休眠體藻泥混合并用BG11培養(yǎng)液浸潤(rùn)包埋(對(duì)照組不加菌,底泥中菌濃度均為1×105cfu/mL,休眠體豐度均為1×105cell/mL),用導(dǎo)流棒依玻璃筒壁緩慢(防止攪動(dòng)底泥)加入BG11培養(yǎng)液至40cm處；后將玻璃筒置于溫度24℃、固定光照強(qiáng)度10μEm-2s-1(預(yù)實(shí)驗(yàn)表明與野外夏秋季節(jié)湖泊水下180cm處平均光強(qiáng)相當(dāng))光∶暗比12h∶12h的人工氣候箱中培養(yǎng)28d。4d取水樣1次10 mL,測(cè)定玻璃筒水體中藻豐度,測(cè)定方法同1.5.1。

1.8細(xì)菌、微囊藻和休眠體的計(jì)數(shù)以及上覆水理化指標(biāo)的測(cè)定全程三平行組,數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(X±SD)表示；作圖采用Excel 2007,統(tǒng)計(jì)分析采用SPSS 13.0軟件；試驗(yàn)期藻菌的動(dòng)態(tài)變化情況采用單因素方差分析(ANOVA)及Duncans多重比較分析處理,以P<0.05作為差異顯著水平。

2 結(jié)果與分析

2.1 沖天湖上覆水理化指標(biāo)動(dòng)態(tài)

沖天湖(取樣點(diǎn))上覆水1—8月份平均水溫逐漸上升,月度平均水溫從1月份(8.65±0.47)℃上升至8月份(25.75±1.82)℃,3—6月份平均水溫月度差異顯著(P<0.05)(表1)； 4、5、6月份以及9月份水體偏堿性(pH>8.0),6月份pH值(9.01±0.71)與其他月份差異顯著(P<0.05)(表1)；溶解氧(DO)濃度月度變化較明顯,6月份和9月份溶解氧濃度分別為(2.32±0.38)mg/L和(2.28±0.26)mg/L,顯著低于其他月份(P<0.05)(表1)；4—9月份TN濃度明顯低于其他月份,5、6月份和9月份TP濃度較低,TN/TP較低值出現(xiàn)在4—5月份和7—8月份(表1)。

2.2 底泥表層與微囊藻捕捉器內(nèi)外上覆水中總菌濃度

2—5月份底泥表層總菌濃度顯著上升,5—9月份底泥表層總菌濃度無(wú)顯著差異(P>0.05)。9月份總菌濃度最大8.89×105cfu/mL,2月份總菌濃度最小1.16×105cfu/mL(圖2Ⅰ)。微囊藻捕捉器內(nèi)外上覆水中總菌濃度月度動(dòng)態(tài)與底泥表層總菌濃度動(dòng)態(tài)基本一致。上覆水中總菌濃度顯著低于底泥表層總菌濃度(P<0.05),同月份微囊藻捕捉器內(nèi)外上覆水中總菌濃度無(wú)顯著性差異(P>0.05)(圖2Ⅱ)。

表1 不同月份沖天湖上覆水水體理化性質(zhì)動(dòng)態(tài)

微囊藻捕捉器內(nèi)外上覆水能進(jìn)行交換,內(nèi)外上覆水理化指標(biāo)采用同一組數(shù)據(jù)表示,表中數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(n=3),不同小寫(xiě)英文字母表示同一指標(biāo)不同月份間的差異顯著(P<0.05)

圖2 不同月份淺層底泥與微囊藻捕捉器內(nèi)外上覆水體中總菌濃度的動(dòng)態(tài)變化Fig.2 Dynamic of total bacteria density on sediment, inside and outside overlying water column of Trap by monthⅠ表示淺層底泥,Ⅱ表示微囊藻捕捉器內(nèi)外上覆水體；圖1中不同大寫(xiě)字母表示不同月份總菌濃度具顯著性差異,不同小寫(xiě)英文字母表示同月份微囊藻捕捉器內(nèi)外上覆水體總菌濃度具顯著性差異(P<0.05),圖中數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(n=3)

2.3 底泥表層微囊藻休眠體與捕捉器內(nèi)外上覆水中總微囊藻細(xì)胞豐度

1—5月份底泥表層微囊藻休眠體豐度無(wú)顯著差異(P>0.05),6月份顯著下降(P<0.05)。7月份與10月份底泥表層微囊藻休眠體豐度急劇上升,兩者無(wú)顯著性差異(P>0.05),與其他月份均具顯著性差異(P<0.05)。全年底泥微囊藻休眠體最大濃度為36.46×105個(gè)/mL(圖3Ⅰ)。4—11月份捕捉器內(nèi)外上覆水中均檢測(cè)到微囊藻細(xì)胞,內(nèi)外總微囊藻細(xì)胞豐度無(wú)顯著差異(P>0.05)。6月份與9月份捕捉器內(nèi)外上覆水中總微囊藻細(xì)胞豐度快速上升,兩者無(wú)顯著性差異(P>0.05),但與其他月份均具顯著性差異(P<0.05)(圖3Ⅱ)。

圖3 不同月份淺層底泥休眠體與捕捉器內(nèi)外上覆水體總藻細(xì)胞豐度的動(dòng)態(tài)Fig.3 Dynamic of Microcystis dormant density on sediment, Microcystis cell inside and outside overlying water column of Trap by monthⅠ表示淺層底泥,Ⅱ表示捕捉器內(nèi)外上覆水體；圖2中不同大寫(xiě)字母表示不同月份總藻細(xì)胞或休眠體豐度具顯著性差異,不同小寫(xiě)字母表示同月份捕捉器內(nèi)外上覆水體總藻細(xì)胞豐度具顯著性差異(P<0.05),圖中數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(n=3)

2.4 底泥表層與微囊藻捕捉器內(nèi)外上覆水中菌群動(dòng)態(tài)

全年篩出底泥菌150株,其中微小桿菌屬(Exiguobacterium)菌48株,芽孢桿菌屬(Bacillus)菌31株,假單胞菌屬 (Pseudomonas)菌13株。上覆水中篩出菌株126株,其中微小桿菌屬(Exiguobacterium)菌24株,芽孢桿菌屬(Bacillus)菌24株,假單胞菌屬 (Pseudomonas)菌25株(表2)。底泥表層與上覆水中優(yōu)勢(shì)菌群均為微小桿菌屬(Exiguobacterium)、假單胞菌屬 (Pseudomonas)和芽孢桿菌屬(Bacillus)。

表2 淺層底泥與上覆水中分離出細(xì)菌的種屬與數(shù)量

微囊藻捕捉器內(nèi)與捕捉器外上覆水能進(jìn)行交換,內(nèi)外上覆水中細(xì)菌的種屬與數(shù)量采用同一組數(shù)據(jù)表示

5月份底泥表層微小桿菌屬(Exiguobacterium)、假單胞菌屬 (Pseudomonas)和芽孢桿菌屬(Bacillus)三類(lèi)優(yōu)勢(shì)菌屬占總菌屬的61%,8月份占57%,其他月份約占總菌屬的40%(圖4A)。5月份上覆水中的三類(lèi)優(yōu)勢(shì)菌屬占總菌屬的54%,8月份占58%。上覆水中芽孢桿菌屬(Bacillus)占比低于同月份底泥中的占比,而假單胞菌屬 (Pseudomonas)占比要高于同月份底泥中的占比(圖4B)。

圖4 底泥表層與上覆水中優(yōu)勢(shì)菌(屬)占比動(dòng)態(tài)Fig.4 Dynamic of dominant bacteria flora rate on sediment and in overlying water column

2.56、9月份微囊藻捕捉器內(nèi)外上覆水中優(yōu)勢(shì)藻種及其占比

6月份和9月份上覆水中總微囊藻細(xì)胞豐度顯著高于其他月份(P<0.05)(圖2),捕捉器內(nèi)外上覆水中優(yōu)勢(shì)藻均為銅綠微囊藻(Microcystisaeruginosa)、水華微囊藻(Microcystisflos-aqua)和惠氏微囊藻(Microcystiswesenbergii),捕捉器內(nèi)外上覆水中優(yōu)勢(shì)藻占比無(wú)顯著性差異(圖5Ⅰ、圖5Ⅱ)。6月份3種微囊藻細(xì)胞占總微囊藻細(xì)胞數(shù)的92%,其中銅綠微囊藻(M.aeruginosa)占比為68%,與其他微囊藻占比具有顯著性差異(P<0.05)(圖5)。9月份3種微囊藻細(xì)胞占總微囊藻細(xì)胞數(shù)的91%,其中銅綠微囊藻(M.saeruginosa)占比為37%、水華微囊藻(M.flos-aqua)占比為46%,惠氏微囊藻(M.wesenbergii)占比為8%。9月份銅綠微囊藻與水華微囊藻占比無(wú)顯著性差異(P>0.05),與其他微囊藻占比具顯著性差異(P<0.05)(圖5)。

圖5 6、9月份上覆水體中優(yōu)勢(shì)藻種及其占比Fig.5 Rate of dominant Microcystis of overlying water column in June and SeptemberⅠ:捕捉器內(nèi)上覆水體,Ⅱ:捕捉器外上覆水體；大寫(xiě)字母表示不同月份同一優(yōu)勢(shì)微囊藻占比具有差異顯著性,小寫(xiě)字母表示同月份不同優(yōu)勢(shì)微囊藻占比間差異顯著性(P<0.05),圖中數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(n=3)

2.6 優(yōu)勢(shì)菌屬對(duì)微囊藻休眠體復(fù)蘇影響

微小桿菌屬(Exiguobacterium)、假單胞菌屬 (Pseudomonas)和芽孢桿菌屬(Bacillus)均對(duì)銅綠微囊藻(M.aeruginosa)休眠體復(fù)蘇具顯著促進(jìn)作用(P<0.05),微小桿菌屬和芽孢桿菌屬促?gòu)?fù)蘇作用顯著強(qiáng)于假單胞菌屬(P<0.05)(圖6)；假單胞菌屬、微小桿菌屬和芽孢桿菌屬對(duì)惠氏微囊藻(M.wesenbergii)休眠體促?gòu)?fù)蘇作用弱于對(duì)銅綠微囊藻休眠體,三類(lèi)菌屬對(duì)惠氏微囊藻休眠體促?gòu)?fù)蘇作用無(wú)顯著差異(P>0.05),但均顯著強(qiáng)于對(duì)照組(P<0.05)(圖6)；假單胞菌屬對(duì)水華微囊藻(M.flos-aqua)休眠體的促?gòu)?fù)蘇效果顯著強(qiáng)于微小桿菌屬和芽孢桿菌屬(P<0.05)。微小桿菌屬和芽孢桿菌屬對(duì)水華微囊藻休眠體的促?gòu)?fù)蘇效果無(wú)顯著差異(P>0.05),但均顯著強(qiáng)于對(duì)照組(P<0.05)(圖6)；三類(lèi)優(yōu)勢(shì)菌屬對(duì)魚(yú)害微囊藻(M.ichthyoblabeKutz)休眠體的促?gòu)?fù)蘇作用不明顯(圖6)。

圖6 三類(lèi)優(yōu)勢(shì)菌(屬)對(duì)4微囊藻休眠體復(fù)蘇的影響Fig.6 Effect of three dominant bacteria on recruitment of four Microcystis dormant各組小寫(xiě)字母表示同時(shí)期不同設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)組(加不同的菌)微囊藻豐度具有顯著性差異(P<0.05);圖中數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(n=3)

3 討論

1—3月份微囊藻捕捉器內(nèi)上覆水中無(wú)微囊藻細(xì)胞檢出,捕捉器外上覆水中能檢測(cè)出且豐度很低；4—6月份捕捉器內(nèi)外上覆水中均檢出微囊藻細(xì)胞,且微囊藻細(xì)胞豐度逐漸增加,但捕捉器內(nèi)外微囊藻細(xì)胞豐度無(wú)顯著性差異；4—6月份底泥表層微囊藻休眠體豐度逐漸降低(圖3)。這說(shuō)明沖天湖底泥表層微囊藻休眠體從4月份開(kāi)始復(fù)蘇,且底泥表層中微囊藻休眠體是上覆水中微囊藻細(xì)胞的主要種源。富營(yíng)養(yǎng)化湖泊上覆水中微囊藻種的來(lái)源一直存在爭(zhēng)議：Preston等[4]對(duì)Blelham Tam湖的微囊藻生活史進(jìn)行同位素追蹤實(shí)驗(yàn),發(fā)現(xiàn)夏季水體中微囊藻種源主要來(lái)自于底泥越冬的休眠體；Brunberg等[9]在對(duì)瑞典湖泊底泥越冬微囊藻復(fù)蘇進(jìn)行研究時(shí),發(fā)現(xiàn)參與水華形成的微囊藻細(xì)胞50%來(lái)自底泥休眠體復(fù)蘇；Thomas等[20]通過(guò)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)水華微囊藻中只有3%—4.2%來(lái)自底泥微囊藻的復(fù)蘇；Bostrom等[15]甚至認(rèn)為在富營(yíng)養(yǎng)化水體中,底泥微囊藻休眠體的數(shù)量會(huì)超過(guò)水體中的總微囊藻生物量最大值。本研究結(jié)果(圖3)與Preston等和Brunberg等實(shí)驗(yàn)結(jié)果近似。

4—6月份沖天湖平均水溫11℃以上(表1),滿(mǎn)足底泥微囊藻休眠體復(fù)蘇對(duì)溫度的要求[21- 22]。同時(shí),“底泥-上覆水”界面溶解氧(DO)濃度逐漸降低,至6月份溶解氧濃度達(dá)最低值,顯著低于1—3月份(表1)。較低的溶解氧環(huán)境能促進(jìn)或誘發(fā)微囊藻休眠體復(fù)蘇：Tsujimura等[16]對(duì)日本琵琶湖底泥中微囊藻生物量的季節(jié)變化研究時(shí)發(fā)現(xiàn),低氧的底泥環(huán)境能提升底泥表層微囊藻休眠體的復(fù)蘇率；Brunberg等[9]在對(duì)Limmaren湖的濱湖區(qū)和大湖區(qū)底泥上微囊藻越冬過(guò)程生物量變化的研究中,也得出類(lèi)似結(jié)論,認(rèn)為低水平的DO有利于微囊藻休眠體的越冬和復(fù)蘇。本研究中4—6月份底泥表層總菌濃度顯著增加,優(yōu)勢(shì)菌群主要是微小桿菌屬(Exiguobacterium)、假單胞菌屬 (Pseudomonas)和芽孢桿菌屬(Bacillus)菌株(表2,圖4)?？赡苷怯捎诘啄嗪蜕细菜腥?lèi)優(yōu)勢(shì)菌群的快速生長(zhǎng)增殖消耗“底泥-上覆水”界面的溶解氧[23],導(dǎo)致4—6月份的低氧環(huán)境,促進(jìn)或誘發(fā)底泥表層微囊藻休眠體復(fù)蘇(底泥微囊藻休眠體豐度逐漸降低和上覆水中微囊藻細(xì)胞豐度逐漸上升)。這一結(jié)果與Tsujimura等和Brunberg等的研究結(jié)果趨同,底泥表層和上覆水中優(yōu)勢(shì)菌群可能對(duì)底泥低氧環(huán)境和促進(jìn)或誘發(fā)微囊藻休眠體復(fù)蘇起著重要作用。

氮(TN)和磷(TP)是微囊藻休眠體復(fù)蘇和暴發(fā)水華的營(yíng)養(yǎng)因子,特別是TN/TP對(duì)微囊藻休眠體復(fù)蘇影響較大。Katri等[24]和Verspagen等[25]通過(guò)實(shí)驗(yàn)證明降低TN/TP比有利用誘發(fā)銅綠微囊藻休眠體復(fù)蘇、上浮,同時(shí)Wan等[2]得出相似結(jié)論；Benjamin等[26]認(rèn)為T(mén)N、TP以及低TN/TP比只是微囊藻復(fù)蘇的必要條件而非誘發(fā)因子,誘發(fā)微囊藻休眠體復(fù)蘇并導(dǎo)致微囊藻水華暴發(fā)的主要因子是底棲生物的擾動(dòng)或化感作用；Anne等[27]通過(guò)實(shí)驗(yàn)證明了小幅度的生物擾動(dòng)有利于促進(jìn)底泥微囊藻休眠體的生長(zhǎng)和新陳代謝,這個(gè)結(jié)論得到了Li等[28]研究結(jié)果的支持；蘇玉萍等[29]認(rèn)為底棲生物的物理擾動(dòng)對(duì)微囊藻休眠體復(fù)蘇的影響作用不如低TN/TP顯著。本研究4—5月份TN/TP比顯著低于1—3月份,可能是底泥表層和上覆水中優(yōu)勢(shì)菌濃度顯著上升所引起(表1,圖2),特別是微小桿菌屬中的反硝化桿菌、斯氏桿菌及螢氣極毛桿菌等具有較強(qiáng)去除TN的能力,致使TN/TP比下降。但TN/TP比下降促進(jìn)或誘發(fā)微囊藻休眠體復(fù)蘇的機(jī)理目前尚不清楚,待進(jìn)一步研究。

室內(nèi)模擬實(shí)驗(yàn)表明微小桿菌屬(Exiguobacterium)、假單胞菌屬 (Pseudomonas)和芽孢桿菌屬(Bacillus)對(duì)銅綠微囊藻(Microcystisaeruginosa)、水華微囊藻(Microcystisflos-aqua)和惠氏微囊藻(Microcystiswesenbergii)休眠體均具有促?gòu)?fù)蘇作用。底泥與上覆水中促藻功能菌的篩選和利用偶見(jiàn)報(bào)道：Ukeles等[30]從頻繁發(fā)生赤潮的淺海底泥中分離出了一株能促進(jìn)水生植物硅藻快速生長(zhǎng)的促藻細(xì)菌；Imai等[31]和Spilling等[32]通過(guò)實(shí)驗(yàn)證明了一些環(huán)境細(xì)菌能夠針對(duì)性的促進(jìn)某種藻類(lèi)的生長(zhǎng)和繁殖,利用促藻細(xì)菌可大大提高藻類(lèi)產(chǎn)量；Hernandez等[33]從對(duì)蝦健康養(yǎng)殖池中富集并分離出60株優(yōu)勢(shì)菌,從中篩選出了3株能高效降解有機(jī)物和促藻生長(zhǎng)的菌株。本研究中底泥表層優(yōu)勢(shì)菌屬對(duì)微囊藻休眠體雖具促?gòu)?fù)蘇功能,但不同菌屬對(duì)同一微囊藻休眠體的促?gòu)?fù)蘇作用具有顯著差異(圖6),這種顯著性可能是導(dǎo)致沖天湖水域不同季節(jié)優(yōu)勢(shì)藻占比存在很大差異的原因(圖5)。沖天湖水域底泥微囊藻休眠體和上覆水中優(yōu)勢(shì)藻主要是銅綠微囊藻(M.aeruginosa)、水華微囊藻(M.flos-aqua)和惠氏微囊藻(M.wesenbergii),但不同月份(季節(jié))三者的占比存在差異。藻類(lèi)占比的季節(jié)性差異在其他水域普遍存在[34]。

由于本研究只對(duì)底泥表層和上覆水中藻菌濃度和部分理化性質(zhì)進(jìn)行取樣測(cè)定,除了優(yōu)勢(shì)菌群增長(zhǎng)可能導(dǎo)致低氧、低TN/TP環(huán)境而影響微囊藻休眠體復(fù)蘇外,關(guān)于這些菌群促進(jìn)或誘發(fā)微囊藻休眠體復(fù)蘇的具體機(jī)理并不清楚(如有無(wú)菌群化感或種間競(jìng)爭(zhēng)關(guān)系等),這些都有待進(jìn)一步深化研究。

4 結(jié)論

沖天湖水域底泥表層微囊藻休眠體是上覆水中微囊藻的主要種源。微囊藻休眠體4月份開(kāi)始復(fù)蘇進(jìn)入上覆水中,優(yōu)勢(shì)藻為銅綠微囊藻(M.aeruginosa)、水華微囊藻(M.flos-aqua)和惠氏微囊藻(M.wesenbergii)；復(fù)蘇前后(主要2—6月份)底泥表層總菌濃度逐漸上升,優(yōu)勢(shì)菌群是微小桿菌屬(Exiguobacterium)、假單胞菌屬 (Pseudomonas)和芽孢桿菌屬(Bacillus)菌株；微囊藻休眠體復(fù)蘇同時(shí)上覆水DO濃度與TN/TP比下降,底泥表層微囊藻休眠體豐度下降,上覆水中微囊藻豐度上升且占比存在差異。這些可能均與優(yōu)勢(shì)菌群的快速增值而改變“底泥-上覆水”界面的理化性質(zhì)有著密切關(guān)系。

致謝：美國(guó)密蘇里大學(xué)宋齊生教授幫助寫(xiě)作,湖南文理學(xué)院劉飛副教授幫助做圖,特此致謝。

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RelationshipbetweenrecruitmentofMicrocystisdormantinsedimentandannualdynamicsofbacterialflorainLakeChongtian

ZOU Wansheng1,2,3, WANG Zhi1,*, LIU Liangguo2,3, WANG Wenbin2,3, SHI Yingpu2

1CollegeofBioscienceandBiotechnology,HunanAgriculturalUniversity,Changsha410128,China2DepartmentofLifeScience,HunanUniversityofArtsandScience,Changde415000,China3CollaborativeInnovationCenterforEfficientandHealthProductionofFisheriesinHunanProvinceandZoologyKeyLaboratoryofHunanHigherEducation,HunanUniversityofArtsandScience,Changde415000,China

Recruitment ofMicrocystisdormant from the upper sediment is a critical stage in its life history and plays an important role in forming blooms. However, little is known about the benthic bacteria associated with recruitment ofMicrocystiscells in sediment. To investigate the relationship between the recruitment of dormantMicrocystisand bacterial flora in the upper sediment, we detected and comparatively analyzed the density of bacteria and the abundance ofMicrocystisdormant in the upper sediment in Lake ChongTian, situated to the west of Lake DongTong, whereMicrocystisblooms have formed frequently in recent years. At the same time, bacterial density,the abundance ofMicrocystiscells, and some of the physical and chemical properties of the overlying water column were measured. Results show that total bacterial density in both the upper sediment and the overlying water column gradually increased from January to May, remained stable from June to September, and decreased gradually from October to December. However, the total bacteria density in sediment was significantly higher than that in the overlying water column in each month. From April to June, total bacterial density significantly increased (P<0.05) and the density of dormantMicrocystissignificantly decreased (P<0.05) in the upper sediment, which indicated that the recruitment of dormantMicrocystisbegan in April. In the same period, the concentration of dissolved oxygen (DO) and the TN/TP ratio decreased significantly in the overlying water column. In May, the total bacterial density in sediment was 7.32×105colony-forming units (cfu)/mL, significantly higher than that in April; moreover, the proportion of dominant flora increased remarkably(up to 61%). The density ofMicrocystiscells in the overlying water column increased significantly to 180×106cells/mL in June, andMicrocystisaeruginosawas dominant theMicrocystisspecies.The density of dormantMicrocystisin the upper sediment reduced to its minimum value,3.71×106cells/mL, at this time. In July, the total bacterial density in the upper sediment was not significantly different from that in May and June, and the proportion of dominant flora decreased to 40%—42%, which was the average value in other months. Meanwhile, the density ofMicrocystiscells in the overlying water column decreased significantly, and the density of dormantMicrocystisincreased significantly in the upper sediment (P<0.05). In August, the total bacterial density in the upper sediment was 8.89×105cfu/mL,which was the highest value for all months, and the proportion of dominant flora increased significantly (up to 57%). Consequently, in September, the density of dormantMicrocystisin the upper sediment again decreased significantly; in contrast, the density ofMicrocystiscells in the overlying water column increased significantly (P<0.05). This study also revealed that the dominantMicrocystisspecies in Lake ChongTianwereM.aeruginosa,M.flos-aqua, andM.wesenbergii, though the relative proportions of these species differed in different months. The dominant bacterial flora in the sediment and overlying water column wereExiguobacterium,Pseudomonas,andBacillus,all of which can promote, to some extent, the recruitment of dormantM.aeruginosa,M.flos-aqua,andM.wesenbergiifrom the upper sediment. These results have important implications in that dominant bacterial flora in the upper sediment may exert important effects on the recruitment of dormantMicrocystisspecies from the upper sediment.

Microcystis; dormant; dominant flora; recruitment; sediment; overlying water

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31472017, 31272339, 31572619)；湖南省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(2016JJ2090) ;湖南省常德市科技局計(jì)劃項(xiàng)目(CDJH201610); 湖南文理學(xué)院科研項(xiàng)目(15ZD03)

2016- 07- 10; < class="emphasis_bold">網(wǎng)絡(luò)出版日期

日期:2017- 05- 27

*通訊作者Corresponding author.E-mail: wangzhisipder@hotmail.com

10.5846/stxb201607101412

鄒萬(wàn)生,王智,劉良國(guó),王文彬,石迎普.沖天湖底泥表層微囊藻休眠體復(fù)蘇與菌群動(dòng)態(tài).生態(tài)學(xué)報(bào),2017,37(19):6597- 6606.

Zou W S, Wang Z, Liu L G, Wang W B, Shi Y P.Relationship between recruitment ofMicrocystisdormant in sediment and annual dynamics of bacterial flora in Lake Chongtian.Acta Ecologica Sinica,2017,37(19):6597- 6606.