某雞場大腸桿菌和沙門氏菌的分離鑒定及自家滅活苗免疫效果檢測

王成聰 ，黃秋華 ，嚴(yán)金平 ，王娟

（1.四川省內(nèi)江金鑫畜禽有限公司，四川 內(nèi)江 641100；2.西南大學(xué)榮昌校區(qū)動物醫(yī)學(xué)系，重慶 榮昌 402460）

某雞場大腸桿菌和沙門氏菌的分離鑒定及自家滅活苗免疫效果檢測

王成聰1，黃秋華2，嚴(yán)金平2，王娟2

（1.四川省內(nèi)江金鑫畜禽有限公司，四川 內(nèi)江 641100；2.西南大學(xué)榮昌校區(qū)動物醫(yī)學(xué)系，重慶 榮昌 402460）

在四川某肉雞場采集臨床上疑似大腸桿菌與沙門氏菌混合感染的病死雞的心血、肝臟，進(jìn)行細(xì)菌分離，并對分離菌進(jìn)行形態(tài)觀察、生化試驗(yàn)、致病力測定、16S rRNA測序及自家滅活苗免疫效果檢測。結(jié)果顯示：分離出的兩株細(xì)菌一株為致病性大腸桿菌，一株為沙門氏菌；用自家滅活苗免疫1個(gè)月后，大腸桿菌平均凝集效價(jià)為1∶63.67，沙門氏菌為1∶48，具有良好的免疫效果。

雞大腸桿菌；沙門氏菌；分離鑒定；免疫效果

2015年四川某肉雞場出現(xiàn)雞群大批死亡，臨床和剖檢發(fā)現(xiàn)疑似雞大腸桿菌與沙門氏菌混合感染。為查明病因，本試驗(yàn)采集病料進(jìn)行了細(xì)菌的分離鑒定，并制備自家滅活苗進(jìn)行免疫，然后進(jìn)行了免疫效果檢測。

1 材料與方法

1.1 材料 病料來源：病料來自四川省內(nèi)江市某肉雞養(yǎng)殖場病死雞的心血、肝臟。病雞主要是1～2月齡的肉雞，臨床表現(xiàn)精神沉郁，食欲下降，下痢，糞便呈白色、黃色，有死亡，死亡率高達(dá)18.3%。剖檢可見心包膜增厚，有的有纖維性心包炎、纖維性肝周炎，脾臟腫大、有出血斑點(diǎn)、有的有白色壞死灶，腎臟腫大、出血，小腸黏膜充血、出血等病變。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)菌分離培養(yǎng)及染色鏡檢 將典型病變雞的心血、肝、脾病料接種于營養(yǎng)肉湯，37℃培養(yǎng)24h，觀察有無細(xì)菌生長，如有細(xì)菌生長再接種到營養(yǎng)瓊脂，觀察菌落形態(tài)，涂片進(jìn)行革蘭氏染色，鏡檢。

1.2.2 培養(yǎng)特性 將營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)物接種于麥康凱、SS瓊脂平板，37℃培養(yǎng)24h，觀察菌落顏色、大小，并進(jìn)行純化，純化后得到兩種不同顏色的細(xì)菌，紅色編為1號菌，灰白色編為2號菌，勾取單個(gè)菌落涂片、革蘭氏染色、鏡檢。

1.2.3 生化試驗(yàn) 將純化的1、2號菌分別接種到微量發(fā)酵管，作好標(biāo)記，37℃培養(yǎng)24～72h，觀察并記錄結(jié)果。

1.2.4 藥敏試驗(yàn) 采用紙片法進(jìn)行，用純化的1、2號菌營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)物均勻涂布在麥康凱瓊脂培養(yǎng)基上，貼上藥敏紙片，37℃培養(yǎng)24h，測定抑菌圈直徑。

1.2.5 致病性試驗(yàn) 將13只試驗(yàn)用小白鼠隨機(jī)分成3組，1組、2組分別為5只，3組為3只。1組、2組分別腹腔注射1、2號分離菌肉湯培養(yǎng)物0.2mL/只，3組注射營養(yǎng)肉湯0.2mL/只，注射后小白鼠隔離飼養(yǎng)，記錄發(fā)病及死亡情況。剖檢死亡小白鼠，觀察病變，用其心血在麥康凱瓊脂平板上劃線培養(yǎng)，觀察是否為接種菌。

1.2.6 16S rRNA鑒定 對1、2號分離菌提取DNA，用16S rRNA通用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增后電泳、純化，將純化后的產(chǎn)物送基因公司測序。

1.2.7 自家滅活苗的制備 將分離的1、2號菌接種到營養(yǎng)肉湯，37℃培養(yǎng)24h；將肉湯培養(yǎng)物均勻涂布在麥康凱瓊脂平板上，37℃培養(yǎng)24h；用生理鹽水洗下菌苔，配成含細(xì)菌100億個(gè)/mL的菌液，加入0.5%甲醛37℃滅活24～48h；最后加入適量蜂膠,在10000r/min的攪拌機(jī)中攪拌2～3min，分裝；經(jīng)無菌檢驗(yàn)為無菌后，即為自家滅活苗。

1.2.8 自家滅活苗免疫效果檢測 用自家滅活苗免疫雞群，于頸部皮下注射0.5mL，免疫后30d隨機(jī)選取30只雞，翅靜脈采血分離血清，采用試管法進(jìn)行大腸桿菌和沙門氏菌凝集試驗(yàn)，測定凝集效價(jià)。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)菌分離培養(yǎng)結(jié)果 將病死雞病料接種到營養(yǎng)肉湯中培養(yǎng)，肉湯變混濁有細(xì)菌生長。接種到麥康凱、SS瓊脂培養(yǎng)基上，分離到二種細(xì)菌，分別編號為1、2號菌。1號分離菌為粉紅色菌落，菌落呈圓形、邊緣整齊、隆起、濕潤光滑；2號菌菌落形態(tài)與1號菌相似，但顏色為灰白色，有的中心呈黑色。涂片、革蘭氏染色后鏡檢，均為兩端鈍圓，單個(gè)或成對排列，紅色的革蘭氏陰性球桿菌。

2.2 生化試驗(yàn)結(jié)果 生化試驗(yàn)結(jié)果表明，1號、2號菌均能發(fā)酵葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、甘露醇，但1號菌能發(fā)酵乳糖，2號菌不能發(fā)酵乳糖，1號菌不能產(chǎn)H2S，2 號菌能產(chǎn) H2S。

2.3 分離菌致病力測定結(jié)果 將1號、2號分離菌的營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)物接種到小白鼠，小白鼠在接種后12～72 h死亡，從死亡小白鼠心血中又分離得到接種菌，詳細(xì)結(jié)果見表1。

表1 1、2號分離菌接種小白鼠后的死亡結(jié)果

2.4 分離菌藥敏試驗(yàn)結(jié)果 二株分離菌對多西環(huán)素、強(qiáng)力霉素、丁胺卡那、先鋒噻肟、菌必治高度敏感，對阿莫西林、青霉素G、慶大霉素、復(fù)方新諾明、頭孢噻吩、氟哌酸、環(huán)丙沙星、恩諾沙星、克林霉素、克拉霉素、新霉素、萬古霉素等耐藥。

2.5 分離菌16S rRNA測序結(jié)果 1號分離菌經(jīng)16S rRNA擴(kuò)增可見一條1.5kb左右的核酸條帶，測序后與GenBank中已知的雞源大腸桿菌16S rRNA序列比對，同源性達(dá)到99.99%；2號分離菌擴(kuò)增可見一條1.4kb左右的核酸條帶，測序后比對，與腸炎沙門氏菌同源性為100.00%。

2.6 自家滅活苗免疫效果檢測結(jié)果 用自家滅活苗免疫1個(gè)月后，測得大腸桿菌平均凝集效價(jià)為1∶63.67，沙門氏菌為1∶48.00，詳細(xì)結(jié)果見表2。

表2 自家滅活苗免疫后的血清凝集試驗(yàn)

3 分析與結(jié)論

3.1 從臨床癥狀和解剖病理變化看，病雞主要發(fā)生于1～2月齡，表現(xiàn)精神沉郁，食欲下降，剖檢可見心包膜增厚，有的有纖維性心包炎、纖維性肝周炎，與文獻(xiàn)[1]報(bào)道的雞大腸桿菌病癥狀相符。病死雞脾臟腫大、有出血斑點(diǎn)、有的有白色壞死灶，腎腫大、出血等病變與文獻(xiàn)[1]報(bào)道的雞沙門氏菌病相符，可初步診斷為大腸桿菌與沙門氏菌混合感染。

3.2 從分離菌的培養(yǎng)特性、形態(tài)、生化試驗(yàn)結(jié)果看，1號為大腸桿菌、2號為沙門氏菌[2]。通過16S rRNA基因測序進(jìn)一步證明1號菌為雞源大腸桿菌，2號菌為雞沙門氏菌。

3.3 致病性測定結(jié)果顯示1號菌致死率高達(dá)60%，2號菌致死率高達(dá)80%，表明1號、2號菌均有致病性。其藥敏試驗(yàn)結(jié)果與刁有祥等[3]報(bào)道的“大腸桿菌對氧氟沙星、環(huán)丙沙星具有高度敏感性”不一致，與鄒玲等[4]報(bào)道的“44株大腸桿菌對青霉素、紅霉素、環(huán)丙沙星均有明顯的耐藥”相符。造成這種結(jié)果的原因可能與不同地區(qū)的用藥習(xí)慣和血清型不同有關(guān)。在雞大腸桿菌和沙門氏菌病的防治工作中，應(yīng)根據(jù)藥敏試驗(yàn)結(jié)果使用敏感的抗菌藥物聯(lián)合用藥和交替用藥，以避免多重耐藥性和交叉耐藥性產(chǎn)生。

3.4 從自家苗免疫檢測效果看，該自家苗免疫30d后的平均凝集效價(jià)為63.67。關(guān)于凝集效價(jià)判定的陽性標(biāo)準(zhǔn)尚無定論，據(jù)苗立中等[5]報(bào)道，雞大腸桿菌自家滅活苗微量凝集試驗(yàn)的判定標(biāo)準(zhǔn)為：凝集效價(jià)22以下為陰性，23以上為陽性。毛春生等[6]報(bào)道，雞場使用雞大腸桿菌多價(jià)自家滅活苗免疫后12周，平均凝集抗體滴度為 1∶26.4，并將 1∶16 作為臨界值，≥1∶16時(shí)判為陽性。根據(jù)以上標(biāo)準(zhǔn)，本試驗(yàn)制備的自家蜂膠滅活苗免疫效果好，大腸桿菌和沙門氏菌抗體陽性率分別為96.67%、93.33%。

[1]陳溥言.獸醫(yī)傳染病學(xué)[M].5版.北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，2007：113-121.

[2]陸承平.獸醫(yī)微生物學(xué)[M].5版.北京：中國農(nóng)業(yè)大學(xué)出版社，2013：93-107.

[3]刁有祥，李久芹，陳慶普.山東省雞大腸桿菌的分離鑒定[J].中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2002，24（1）：21-22.

[4]鄒玲，唐棟，劉文華，等.雞大腸桿菌病病原的分離鑒定及藥敏試驗(yàn)[J].中國畜牧獸醫(yī)，2007，34（2）：119-121.

[5]苗立中，沈志強(qiáng)，劉吉山，等.雞大腸桿菌改良微量凝集試驗(yàn)抗原的制備及試驗(yàn)條件優(yōu)化[J].家禽科學(xué)，2009（3）.

[6]毛春生，盧中華，崔保安，等.雞大腸桿菌多價(jià)自家滅活菌苗的研制和應(yīng)用初報(bào)[J].河南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，1992，26（4）：388-391.

Separation，Identification of E.coli，Salmonella and Immune Effect Testing of Autogenous Inactivated Vaccine in a Chicken Farm

Wang Chengcong1，Huang Qiuhua2，Yan Jinping2，et al.
（1.The Jinxin Livestock and Poultry Co.′Ltd.，Sichuan Neijiang 641100；2.Department of Veterinary Medicine，Southwest University of Rongchang Campus，Chongqing Rongchang 402460，China）

Heart blood and liver samples of dead chickens that suspected had mixed infection of E.coli and Salmonella were saparated，collected，and observed the colony morphology，conducted the biochemical experiments and pathogenicity determination，sequenced its 16S rRNA，preparated the autogenous inactived vaccine to detect its immune effect.The result showed that there were two germs，the one was pathogenic E.coli，the other was Salmonella.After a month of immunization with autogenous inactived vaccine，the average agglutination titer of E.coli was 1∶63.67，and the Salmonella was 1∶48，which showed good immune effect.

E.coli；Salmonella；Saparation and identification；Immune effect

S854.43

B

1001-8964（2017）10-0027-03

2017-07-10

王成聰（1971-），男，四川安岳人，大專，畜牧師，主要從事種雞的疾病防治和飼養(yǎng)管理以及商品蛋雞、商品肉雞的銷售、推廣工作。