兩種不同滅活劑對基因Ⅶ型新城疫病毒滅活效果的影響研究

龔文波，郝偉偉，廖韋萍，余玉梅，方鵬飛

（華派生物工程集團有限公司，四川 簡陽 641400）

兩種不同滅活劑對基因Ⅶ型新城疫病毒滅活效果的影響研究

龔文波，郝偉偉，廖韋萍，余玉梅，方鵬飛

（華派生物工程集團有限公司，四川 簡陽 641400）

本試驗采用甲醛及β-丙內(nèi)酯（BPL）對基因Ⅶ型新城疫病毒N07株進行不同時間的滅活處理，檢驗滅活效果，并將滅活后的病毒液乳化配苗，進行安全性和效力檢驗。結(jié)果表明：0.2%甲醛溶液37℃下作用16h可將病毒液徹底滅活，血凝性降低；1∶2000的β-丙內(nèi)酯2～8℃下作用16～48 h可將病毒液徹底滅活，并保持良好的血凝性；將兩種方法滅活的病毒液乳化配苗，接種SPF雞，安全性良好，無不良反應；效力檢驗：新城疫HI抗體分別為 1∶28.0和 1∶27.7，用 N07 毒株攻毒，均能 100%保護。

基因Ⅶ型新城疫；甲醛；β-丙內(nèi)酯；滅活

新城疫（ND）是由屬禽副粘病毒I型的新城疫病毒（NDV）引起的一種急性、烈性禽類傳染病，主要侵害雞和火雞，發(fā)病率和死亡率均很高，是危害我國養(yǎng)禽業(yè)生產(chǎn)的最嚴重疾病之一[1-2]。目前，普遍采用ND的活疫苗和油乳劑滅活疫苗進行預防免疫，并在很大程度上控制了該病的大規(guī)模流行，但該病每年造成的經(jīng)濟損失仍很嚴重。理想的滅活疫苗應能誘導動物機體產(chǎn)生高水平的中和抗體，獲得較好的免疫保護，而且具備安全性。滅活疫苗的制備中，病原滅活得徹底與否決定了是否會有散毒的危險，是確保疫苗安全性的重要一環(huán)?？乖瓬缁钚Ч暮脡呐c滅活劑息息相關，好的滅活劑不但滅活完全、抗原性保留良好，而且無毒副作用。因此，篩選高效、安全的疫苗滅活劑是當前滅活疫苗研制中迫切需要解決的課題。

本試驗將實驗室分離得到的一株基因Ⅶ型新城疫病毒N07株分別用兩種不同滅活劑滅活，并將滅活后的病毒液乳化配苗，比較其安全性和免疫效果，旨在為下一步滅活疫苗的規(guī)模化生產(chǎn)奠定基礎。

1 材料及方法

1.1 材料

1.1.1 病毒液 基因Ⅶ型新城疫病毒液N07株的病毒含量為 108.2ELD50/0.1mL，HA效價為 1∶512。

1.1.2 試驗用雞胚和雞 雞胚：來自濟南斯派福瑞禽業(yè)科技有限公司的SPF蛋，孵化至10日齡；SPF雞：購自濟南斯派福瑞禽業(yè)科技有限公司，在負壓隔離器內(nèi)飼養(yǎng)。

1.1.3 0.1%雞紅細胞懸液 采自健康成年公雞。

1.1.4 檢驗用血清及抗體 HI用雞新城疫陽性血清及SPF雞陰性血清：實驗室制備，抗體效價分別為28和 20；雞新城疫（N07株）HI抗原：實驗室制備，HA效價為 1∶512。

1.1.5 主要試劑 甲醛溶液：分析純，購自成都市科龍化工試劑廠；β-丙內(nèi)酯：購自SELVE公司；白油：購自 Exxon mobil公司；吐溫-80、司盤-80：均購自CRODA公司。

1.2 方法

1.2.1 病毒液滅活

1.2.1.1 甲醛滅活 取病毒液1000mL置于2500mL三角瓶中，加入10%的甲醛溶液8mL，使其濃度為0.2%。37℃恒溫放置，每隔一段時間搖勻一次。16～48 h間每8h取一次樣，置于4℃保存。

1.2.1.2 β-丙內(nèi)酯（BPL）滅活 取病毒液1 000 mL置于2500mL三角瓶中，加入β-丙內(nèi)酯溶液0.5mL（1∶2000）。2～8℃恒溫放置，每隔一段時間搖勻一次。16～48h間每8h取一次樣，37℃放置2h后置于4℃保存。

1.2.2 滅活檢驗 HA效價：按現(xiàn)行《中國獸藥典》附錄測定各樣品HA效價。

滅活檢驗：將滅活病毒液樣品接種到10日齡SPF 雞胚，0.2mL/枚，接種 5枚，37℃孵育 120h，無論雞胚死活逐個測定HA，確定是否感染病毒。取陰性雞胚液混合，盲傳一次，檢測是否感染。

1.2.3 乳化配苗 將96份甲醛及β-丙內(nèi)酯滅活的NDV尿囊液同4份無菌的吐溫-80（水相）與油佐劑（油相∶94%白油、6%司盤-80）按 1∶3比例混合后充分乳化，分別制成油包水型的油乳劑滅活苗。

1.2.4 安全檢驗 將制得的油乳劑滅活疫苗接種35日齡SPF雞，1mL/只，每組10只，設立免疫對照組和空白對照組（見表1），觀察14d。

表1 安全檢驗的配苗及免疫分組

1.2.5 效力檢驗 將制得的油乳劑滅活疫苗接種35日齡SPF雞，20μL/只，每組10只，設立免疫對照組和空白對照組（見表2）。接種后21d經(jīng)翅靜脈采血，分離血清，按《中國獸藥典》附錄——血凝抑制試驗測定抗體效價。免疫后21d，對接種組用N07毒株進行攻擊，點眼、滴鼻N07病毒液（108.6ELD50/0.1mL）各0.1mL，觀察 10d。

表2 效力檢驗的配苗及免疫分組

2 結(jié)果與討論

表3 基因Ⅶ型新城疫病毒液滅活后的HA效價及雞胚接種結(jié)果

2.1 基因Ⅶ型新城疫病毒液滅活效果 兩種滅活劑對病毒液的滅活效果見表3。從表3可以看出，用0.2%甲醛滅活16h后病毒液的HA會降低，為23；將滅活16～40h的病毒液接種雞胚后未能引起感染，陰性雞胚液盲傳也沒有出現(xiàn)雞胚感染的情況，說明可以滅活完全。BPL滅活16～40h后，病毒液HA效價保持在29不變，而且滅活完全。

2.2 滅活疫苗安全性檢驗結(jié)果 A、B、C組雞接種不同滅活疫苗后觀察14d，無任何不良癥狀出現(xiàn)，宰殺剖檢，各器官也均正常，無任何病變。

2.3 滅活疫苗效力檢驗結(jié)果 A、B、C組雞接種不同滅活疫苗后21d，其血清抗體水平及攻毒保護結(jié)果見表4。免疫后21d，接種甲醛滅活疫苗組的雞新城疫抗體效價幾何平均值為28.0，略高于BPL滅活疫苗組的27.7；對照組抗體效價低于21，為陰性。用基因Ⅶ型新城疫N07株病毒液攻擊后，對照組死亡率為80%，兩個免疫組均100%保護。

表4 滅活疫苗效力檢驗結(jié)果

3 結(jié)論與分析

新城疫滅活疫苗自20世紀70年代開始應用以來，廣泛使用的是甲醛溶液滅活，但甲醛滅活存在刺激性強，對病毒衣殼蛋白有一定的破壞作用等缺陷[3]。BPL是一種雜環(huán)化合物，對病毒具有很強的滅活作用，通過與病毒核酸的嘌呤堿基發(fā)生反應而破壞核酸結(jié)構，不直接作用于蛋白，因此能保持良好的抗原性[4]。本試驗采用0.2%甲醛及1∶2000 β-丙內(nèi)酯對基因Ⅶ型新城疫病毒進行滅活，作用16h即可滅活完全，滅活病毒液的HA效價分別為23和29。滅活40h后，甲醛滅活病毒液的HA效價降低，幾乎為零，同之前報道的HA效價降低1～2個滴度有差別，可能是毒株原因；而β-丙內(nèi)酯組保持不變，同之前文獻報道的結(jié)果保持一致[5-6]。

甲醛滅活的效果易受溫度、pH值、濃度、是否存在有機物、病原體種類和含氮量等因素影響。甲醛是一種具有強烈刺激性的致癌物質(zhì)，殘留的游離甲醛若隨疫苗注入機體后，會產(chǎn)生刺激性反應。大劑量β-丙內(nèi)酯雖是一種潛在致癌物，對皮膚、黏膜及眼睛有刺激性，其液體對動物有致癌性，但BPL極易水解，在37℃水浴中水解2h后即可消失，水解為無毒性的人體脂肪代謝產(chǎn)物——β-羥基丙酸，不必考慮在成品疫苗中有殘留，接種反應也輕微[7]。將甲醛及β-丙內(nèi)酯滅活的病毒液乳化配苗后，接種SPF雞進行安全性檢驗，均無不良反應。效力檢驗中，甲醛和β-丙內(nèi)酯組新城疫HI抗體效價的幾何平均值分別為28.0和27.7，β-丙內(nèi)酯組略低；攻毒后均能抵抗強毒N07株的攻擊，保護率100%，故甲醛和β-丙內(nèi)酯的滅活效果及滅活后病毒液的免疫效果相差不大。

目前，免疫接種仍是控制雞新城疫的主要措施，特別是LaSota疫苗的應用尤為普遍。疫苗接種在很大程度上減緩了新城疫的大規(guī)模流行，但免疫雞群中包括高HI抗體雞群中新城疫的發(fā)生仍時有報道[8]。大量研究證明，造成高HI抗體水平雞群發(fā)病的原因不僅與免疫途徑、方法、程序及疫苗質(zhì)量有關，還與新城疫毒株的變異、不同基因型毒株的出現(xiàn)等有重要關系[9]。我國目前常用的傳統(tǒng)疫苗Ⅰ系、Ⅱ系、Ⅳ系和Ⅵ系等疫苗均屬于經(jīng)典型基因Ⅰ型、Ⅱ型毒株，而造成目前新城疫廣泛流行的野毒株多屬于基因Ⅶ型毒株[10-11]，且各地區(qū)的具體流行株又存在不同程度的差異。本試驗針對分離到的基因Ⅶ型新城疫強毒株病毒液的滅活效果進行研究，為下一步研制新毒株滅活疫苗奠定了基礎。

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Inactivation Effect of Genotype Ⅶ Newcastle Disease Virus with Two Different Inactivants

Gong Wenbo，Hao Weiwei，Liao Weiping，et al.
（Huapai Bioengineering Group Co.′Ltd.，Sichuan Jianyang 641400，China）

Genotype Ⅶ newcastle disease virus named strain N07 was inactivated by formaldehyde and β-propiolactone （BPL）for pre-set time intervals.The inactivation effects were determined and the virus completely inactivated was mixed with oil emulsion together to detect the safety and immune efficacy.The results showed that NDV was inactivated by 0.2%formaldehyde under 37 ℃ for 16 h with HA lower，or under 2～8℃ by 1∶2000 BPL for 16～48h with HA maintaining.The two kinds of inactivated vaccines made of virus inactivated by different methods and oil emulsion were safe after injection to the chicken.In immune efficacy，the anti NDV-HI antibodies of different groups were 1∶28.0and 1∶27.7，challenged with N07，the immune protective efficacies were both 100%.

Genotype Ⅶ NDV；Formaldehyde；β-propiolactone；Inactivation

S859.797

B

1001-8964（2017）10-0021-03

2017-08-07

龔文波（1965-），男，重慶墊江人，碩士研究生，高級工程師，華派生物工程集團有限公司總經(jīng)理，主要從事獸用生物制品的研發(fā)及生產(chǎn)管理。