蓮基因組學(xué)和分子生物學(xué)研究進(jìn)展

劉正位+季群+柯衛(wèi)東+朱紅蓮+劉玉平+彭靜+匡晶+王蕓+郭丹丹

摘 要：綜述了蓮藕基因組學(xué)和分子生物學(xué)研究進(jìn)展，主要包括蓮核基因組和細(xì)胞器基因組測(cè)序、系統(tǒng)進(jìn)化和遺傳多樣性、重要基因挖掘和功能分析等，并對(duì)其今后的研究進(jìn)行了展望。

關(guān)鍵詞：蓮；基因組學(xué)；分子生物學(xué)；研究進(jìn)展

中圖分類號(hào)：S645.1 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1001-3547（2017）18-0041-08

蓮屬于蓮科蓮屬，是一種古老的雙子葉植物，其最早的化石可追溯至早白堊紀(jì)晚期，距今100.5百萬～113.0百萬a前[1]，它與水杉銀杏等冰川孑遺植物一樣，是當(dāng)今地球上幸存的活化石植物[2]，在新石器時(shí)代早期即被當(dāng)時(shí)的人類大量采集食用，

7 000 a前即被作為食物進(jìn)行種植，具有悠久的栽培和馴化歷史。蓮是集食用、觀賞、藥用、環(huán)保等重要作用為一身的重要水生蔬菜。蓮屬中國十大名花，其地下莖和蓮籽均富含淀粉，可供食用。蓮籽可鮮食也可加工成通心白蓮、蓮籽汁、蓮籽粉、蓮蓉等，其節(jié)、葉、花、蒂、須等都可入藥。此外，荷葉的自潔功能[3，4]和千年古蓮籽開花之謎[5～7]也吸引著越來越多研究者的興趣。中國蓮栽培主要分布在長(zhǎng)江流域、珠江流域和黃河流域，其中以長(zhǎng)江中下游種植面積最大，臺(tái)灣省也有一定面積的蓮藕種植。據(jù)《中國農(nóng)業(yè)統(tǒng)計(jì)資料》（2009年）統(tǒng)計(jì)，全國22個(gè)省、市（自治區(qū)）的蓮藕播種面積

25.29萬hm2，產(chǎn)量749.9萬t。全國子蓮的主產(chǎn)區(qū)分布在江西省、福建省、湖南省、湖北省、浙江省等地。日本、印度、越南等東南亞國家也有栽培，每年子蓮種植總面積5.3萬～6.7萬hm2。

近年來，蓮基因組學(xué)和分子生物學(xué)發(fā)展迅猛，相關(guān)研究也愈加廣泛和深入。本文綜述了蓮基因組學(xué)和分子生物學(xué)研究進(jìn)展，并討論了未來可能的研究領(lǐng)域和方向，以供參考。

1 基因組測(cè)序和遺傳圖譜構(gòu)建

1.1 蓮核基因組測(cè)序

2013年，中國科學(xué)院武漢植物園和美國伊利諾伊大學(xué)[8]聯(lián)合完成了中國古代蓮的全基因組測(cè)序，組裝基因組大小804 Mb，占蓮藕基因組的86.5%；基因組中含有57%的重復(fù)序列，轉(zhuǎn)座因子占47.7%，對(duì)26 685個(gè)基因進(jìn)行了注釋，基因的平均長(zhǎng)度為6 561 bp。22 803個(gè)基因在地下莖、根、葉片或心皮中表達(dá)，占基因總數(shù)85.5%，其中，持家基因14 477個(gè)，組織特異性表達(dá)基因3 094個(gè)。發(fā)現(xiàn)了蓮藕在進(jìn)化過程中存在瓶頸效應(yīng)和全基因組復(fù)制現(xiàn)象，也從基因?qū)用嫔蠈?duì)蓮藕水生生長(zhǎng)環(huán)境適應(yīng)性進(jìn)行了探討。同年，武漢市蔬菜科學(xué)研究所和深圳華大基因[9]合作完成了中間湖野蓮的全基因組測(cè)序。組裝基因組大小為792 Mb，GC含量為38.7%，編碼基因40 348個(gè)，平均基因長(zhǎng)度為

3 431 bp，平均外顯子3.68個(gè)，外顯子和內(nèi)含子平均長(zhǎng)度分別為246、939 bp。發(fā)現(xiàn)膜聯(lián)蛋白基因ANNfam5中存在2個(gè)明顯的正向選擇位點(diǎn)，可能是蓮籽保持長(zhǎng)久生命活力的原因所在。對(duì)蓮中淀粉合成相關(guān)基因的深入分析表明，其GBSS基因有明顯的擴(kuò)張現(xiàn)象，可能是蓮籽及其地下莖中淀粉合成的關(guān)鍵基因。

1.2 蓮細(xì)胞器基因組測(cè)序

2014年，武漢大學(xué)[10]對(duì)中國蓮和美洲黃蓮的葉綠體基因組進(jìn)行了測(cè)序，中國蓮和美洲黃蓮葉綠體基因組全長(zhǎng)分別為163 307、163 206 bp，GC含量各占?jí)A基的37.99%和38.01%，編碼113個(gè)基因。根據(jù)葉綠體基因組序列對(duì)蓮屬的系統(tǒng)進(jìn)化地位進(jìn)行分析表明，蓮科應(yīng)歸類到雙子葉植物中的山龍眼目（分類名稱）中，約有110百萬a的進(jìn)化歷史，中國蓮和美洲黃蓮的分離時(shí)間約在2.41百萬a前。

2016年，武漢大學(xué)[11]使用單分子實(shí)時(shí)測(cè)序技術(shù)（SMRT）測(cè)定了蓮的線粒體基因組，并在從頭組裝和注釋之后構(gòu)建了線粒體基因組圖譜。結(jié)果表明，524 797 bp的蓮線粒體基因組共有63個(gè)基因，揭示了蓮線粒體基因組具有進(jìn)化上的保守性特征，即保留著古老的基因簇和基因數(shù)目、高頻率的RNA編輯以及低頻率的葉綠體片段的插入等現(xiàn)象。

1.3 遺傳圖譜構(gòu)建

遺傳圖譜構(gòu)建在基因定位和圖位克隆中具有重要地位。Yang等[12]利用中國古代蓮×美洲黃蓮的50株F1代分離群體，利用基因組測(cè)序獲得的SSR標(biāo)記和SRAP標(biāo)記分別構(gòu)建了第一張中國古代蓮和美洲黃蓮遺傳圖譜，美洲黃蓮的遺傳圖譜含11個(gè)連鎖群，177個(gè)標(biāo)記，全長(zhǎng)524.51 cM；其亞洲蓮的遺傳圖譜含7個(gè)連鎖群，47個(gè)標(biāo)記，全長(zhǎng)365.67 cM。隨后，Zhang等[13]利用SNP標(biāo)記將該圖譜進(jìn)一步完善，構(gòu)建了包含9個(gè)連鎖群，總長(zhǎng)543.4 Mb，由562個(gè)序列標(biāo)簽集和156個(gè)SSR標(biāo)記構(gòu)成的高密度遺傳圖譜。武漢市蔬菜科學(xué)研究所[14]利用鄂子蓮1號(hào)和鄂蓮9號(hào)為親本構(gòu)建的F2遺傳群體結(jié)合簡(jiǎn)化基因組測(cè)序技術(shù)，構(gòu)建了一個(gè)相對(duì)完整的由8個(gè)連鎖群構(gòu)成的遺傳圖譜，該遺傳圖譜全長(zhǎng)556 cM，含891個(gè)共整合標(biāo)記，平均遺傳圖距為0.74 cM。

近20 a來，隨著分子生物學(xué)和基因組學(xué)等新興學(xué)科的興起，特別是最近幾年，第二代高通量測(cè)序技術(shù)乃至第三代測(cè)序技術(shù)的迅速發(fā)展，為蓮藕基因組學(xué)研究插上了騰飛的翅膀。目前，利用基因組測(cè)序技術(shù)進(jìn)行蓮藕遺傳多樣性研究、大規(guī)模分子標(biāo)記開發(fā)和高密度遺傳圖譜構(gòu)建乃至基因定位等成為目前蓮藕基因組學(xué)研究的熱點(diǎn)，必將促進(jìn)蓮藕分子育種的跨越式發(fā)展。

2 蓮系統(tǒng)進(jìn)化和遺傳多樣性

2.1 蓮系統(tǒng)進(jìn)化研究

蓮與睡蓮科植物具有相似的葉、花器官以及生長(zhǎng)環(huán)境，在1973年，林奈對(duì)蓮進(jìn)行了描述并將其隸屬于睡蓮科（Nymphaeaceae）睡蓮屬（Nymphaea nelumbo Linn.），這一觀點(diǎn)為之后200 a內(nèi)的許多植物學(xué)家所接受。然而，蓮屬與睡蓮科其他屬在形態(tài)、染色體、花粉結(jié)構(gòu)等方面存有顯著的差異：如蓮屬具有不同于睡蓮屬的獨(dú)特倒圓錐形的花托和離生的雌蕊[15]；蓮屬無胚乳，而其他睡蓮科植物含有豐富的外胚乳和胚乳[16]；蓮染色體基數(shù)為8，而睡蓮其他屬一般為12或17，且染色體形態(tài)不同于睡蓮其他屬[17]；蓮屬花粉為三溝花粉，花粉覆蓋層為網(wǎng)狀，花粉外壁具有明顯的柱狀層結(jié)構(gòu)，與睡蓮科其他屬的花粉類型不同[18]。此外，花粉萌發(fā)孔形成時(shí)期、萌發(fā)孔數(shù)目和位置等也不同于睡蓮科其他屬。這些證據(jù)均表明，蓮屬和睡蓮科其他屬在分類學(xué)上具有顯著差異，應(yīng)把蓮屬從睡蓮科提出并獨(dú)立成蓮科（Nelumbonaceae）。endprint

隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，利用基因序列對(duì)植物進(jìn)化系統(tǒng)研究逐漸占據(jù)主導(dǎo)地位，特別是利用葉綠體基因組中高度保守的如ChrbcL，atpB，18S，matK，26S等基因進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化研究。1993年，Chase等[19]測(cè)定了包括蓮在內(nèi)的數(shù)百個(gè)物種的葉綠體rbcL基因序列，蓮被定為一種位于雙子葉植物基部的分支雙子葉植物。2000年，Soltis等[20]結(jié)合atpB和rbcL 2個(gè)基因?qū)Πㄉ徳趦?nèi)的被子植物進(jìn)行了系統(tǒng)進(jìn)化分析等，再用獨(dú)立或多個(gè)基因聯(lián)合分析結(jié)果均表明，蓮科不屬于睡蓮目，而和分支雙子葉植物比較接近。2014年，Wu等[10]利用葉綠體基因組測(cè)序獲得的78個(gè)葉綠體蛋白質(zhì)編碼基因，對(duì)包括蓮在內(nèi)的80個(gè)不同物種進(jìn)行了系統(tǒng)進(jìn)化分析，結(jié)果也表明蓮科屬于分支雙子葉植物，歸屬于山龍眼目，迄今有110百萬a的進(jìn)化歷史。利用蓮核基因組序列進(jìn)行凈化分析的結(jié)果與葉綠體分析結(jié)果相似，即同樣證實(shí)了蓮屬于位于雙子葉植物基部的最古老的雙子葉植物之一[8]。

2.2 蓮分布及遺傳多樣性研究

蓮屬植物現(xiàn)僅存2個(gè)種，蓮（Nelumbo nucifera Gaertn.）和美洲黃蓮（Nelumbo lutea Willd.），在東半球分布的是蓮，在西半球分布的是美洲黃蓮[21]。在亞洲地區(qū)，蓮廣泛分布，因此蓮又被稱為亞洲蓮，野蓮主要分布在我國東北地區(qū)、長(zhǎng)江中下游流域、云貴高原和東南亞各國。栽培蓮在我國有著悠久的歷史，其主要分布區(qū)域與野蓮基本相同。在長(zhǎng)期的栽培過程中，已馴化出藕蓮、子蓮、花蓮3種不同的栽培類型。在采用分子標(biāo)記研究蓮的遺傳多樣性方面，2004年武漢市蔬菜科學(xué)研究所率先采用RAPD標(biāo)記開展了蓮資源遺傳多樣性研究[22]，武漢大學(xué)、中國科學(xué)院武漢植物園和日本京都府立大學(xué)等單位也相繼采用其他分子標(biāo)記技術(shù)對(duì)蓮遺傳多樣性進(jìn)行了研究，至今已有隨機(jī)擴(kuò)增片段多態(tài)性標(biāo)記（RAPD）[22～24]、內(nèi)部簡(jiǎn)單重復(fù)序列（ISSR）[24，25]、簡(jiǎn)單重復(fù)序列（SSR）[26～31]、擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性（AFLP）[31，32]和相關(guān)序列擴(kuò)增多態(tài)性（SRAP）[30]等標(biāo)記在蓮藕的遺傳多樣性研究中得到了應(yīng)用。研究范圍主要為亞洲蓮和美洲蓮親緣關(guān)系、亞洲蓮不同生態(tài)型劃分、中國不同地域野蓮及居群多樣性及中國主要栽培蓮如藕蓮、子蓮和花蓮分類等方面。

對(duì)亞洲蓮和美洲黃蓮遺傳關(guān)系的研究結(jié)果均表明[24，29，30，32]，美洲黃蓮與中國蓮遺傳距離較遠(yuǎn)，兩者在DNA水平上具有明顯的差異，美洲黃蓮和亞洲蓮應(yīng)為2個(gè)獨(dú)立類群，這是由長(zhǎng)期地理隔絕和進(jìn)化導(dǎo)致的。研究表明，中國東北及長(zhǎng)江流域野蓮資源遺傳多樣性相對(duì)較為低下，云南地區(qū)蓮資源多樣性似乎更為豐富。如薛建華等[33]采用ISSR和RAPD標(biāo)記對(duì)黑龍江地區(qū)野蓮的研究表明，野蓮遺傳多樣性不高，黑龍江5個(gè)不同野生居群間遺傳相似性高達(dá)0.931 4～0.995 4，其多樣性顯著低于栽培蓮資源。Han等[34]對(duì)我國中部地區(qū)不同湖泊野蓮遺傳多樣性進(jìn)行了分析，結(jié)果表明，其野蓮居群在物種水平上具有較高的多態(tài)性，而群體間遺傳分化較大。千瓣蓮作為云南地區(qū)特有的蓮資源，在我國作為花蓮廣泛栽培。郭宏波等[35]采用RAPD標(biāo)記對(duì)5份來自云南地區(qū)的千瓣蓮資源進(jìn)行了分析，表明中國千瓣蓮資源具有豐富的遺傳多樣性。美洲黃蓮多樣性少有報(bào)道，Li等[36]對(duì)來自美國不同地方的7個(gè)野生美洲黃蓮居群進(jìn)行遺傳多樣性研究，美洲黃蓮居群間遺傳多樣性較高（FST=0.81），而群體內(nèi)遺傳多樣性非常有限。

在亞洲蓮生態(tài)型劃分方面，張行言等[37]將花蓮資源分為熱帶型和溫帶型2種類型。Yang 等[38]采用SSR標(biāo)記的研究表明，泰國和中國東北野蓮居群在遺傳上具有的明顯差異，為這種分類提供了分子依據(jù)，并認(rèn)為中國東北野蓮屬溫帶型，而泰國野蓮屬熱帶型?？滦l(wèi)東等[39]發(fā)現(xiàn)，東北地區(qū)野蓮資源在武漢生長(zhǎng)植株矮小，根狀莖膨大極早，與長(zhǎng)江中下游地區(qū)野蓮不同，應(yīng)屬不同生態(tài)型的蓮藕，認(rèn)為蓮應(yīng)按緯度分布劃分為溫帶型、亞熱帶型和熱帶型三種不同生態(tài)型。Li等[40]從葉綠體序列變異角度證實(shí)了中國東北的野蓮單倍型和我國中部南部地區(qū)的野蓮單倍型具有顯著的差異。因此，綜合上述研究將蓮分為溫帶型、亞熱帶型和熱帶型3個(gè)生態(tài)型是比較合理的。

在栽培蓮類型劃分方面，采用RAPD[22]、SSR[30]和AFLP[32]等不同標(biāo)記或不同來源樣品的研究結(jié)論基本類似，即栽培蓮可劃分為子蓮、藕蓮和花蓮3個(gè)類群，具有較明顯的遺傳分化，這與傳統(tǒng)上按形態(tài)和栽培類型分類相一致。如郭宏波等[22]采用RAPD標(biāo)記將蓮屬種質(zhì)資源劃分為3個(gè)品種群：藕蓮、子蓮和花蓮，并推測(cè)藕蓮、子蓮和花蓮可能由不同遺傳背景的野蓮演化而來。瞿楨等[41]研究表明，藕蓮、子蓮和花蓮三大類群有明顯的界限，藕蓮和子蓮的遺傳距離較遠(yuǎn)，而花蓮和子蓮遺傳距離較近，研究還表明，中國蓮3種類型中，花蓮遺傳多樣性最高，藕蓮的多樣性最低。Hu 等[31]采用AFLP和SSR標(biāo)記將栽培蓮明顯地劃分為藕蓮和子蓮兩大類群，而花蓮則分別在子蓮和藕蓮類群中并獨(dú)立成支，同樣表明藕蓮、子蓮和花蓮存在明顯的差異。Fu等[32]的研究認(rèn)為，子蓮和花蓮常?；旌暇墼谝活?，兩者間并無明顯的界限，子蓮和花蓮之間的親緣關(guān)系較近。

3 蓮重要基因的挖掘和相關(guān)研究

3.1 與淀粉合成相關(guān)酶基因的挖掘和分析

淀粉是蓮藕主要營養(yǎng)成分，調(diào)控蓮藕淀粉合成的相關(guān)酶類主要有ADPG-焦磷酸化酶、淀粉合成酶、淀粉分支酶和淀粉脫分支酶等。陸葉等[42]從蓮藕美人紅中擴(kuò)增得到淀粉顆粒結(jié)合合成酶基因，基因全長(zhǎng)2 265 bp，開放閱讀框1 848 bp，編碼615個(gè)氨基酸，序列分析表明，蓮藕GBSS基因與金魚草、馬鈴薯、大豆和水稻中同源基因的同源性分別達(dá)61.2%、59.6%、64.2%和50.6%；其氨基酸序列與金魚草同源性最高，達(dá)到77%，與馬鈴薯、甘薯的同源性達(dá)到75%，與豆科植物的同源性在70%～75%，與禾本科植物的同源性在65%～70%。張莉等[43]克隆得到可溶性淀粉合成酶基因（LrSSS）cDNA序列，基因全長(zhǎng)4 080 bp，開放閱讀框3 696 bp，編碼1 231個(gè)氨基酸；該序列與甜瓜、葡萄SSS基因編碼氨基酸序列同源性較高，分別達(dá)79%、69%。程立寶等[44]利用轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)，歸納并分析86個(gè)可能與蓮藕根狀莖膨大相關(guān)基因，分別為35個(gè)激素誘導(dǎo)蛋白基因、4個(gè)光誘導(dǎo)蛋白（MADS-BOX）基因、11個(gè)根狀莖貯藏蛋白基因（Patatin）、35個(gè)與淀粉代謝相關(guān)基因以及1個(gè)與根狀莖形成相關(guān)基因。程立寶等[45]進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，有34個(gè)基因參加了蓮根狀莖淀粉合成過程，其中LrGBSS、LrSBEI、LrSBEII和 LrSBEIII 4個(gè)基因在地下莖膨大后期表達(dá)量顯著增加。endprint

3.2 與抗病抗逆等相關(guān)的基因及基因家族的挖掘和分析

蓮藕組織中含有大量的還原酶類，如多酚氧化酶（PPO）、超氧化物歧化酶（cytCuZnSOD）、抗壞血酸過氧化物酶（APX）等。西北農(nóng)林大學(xué)張躍進(jìn)等[46]從蓮藕莖尖中克隆到了PPO基因全長(zhǎng)序列，其cDNA長(zhǎng)2 074 bp，開放閱讀框1 503 bp，編碼501個(gè)氨基酸，蛋白質(zhì)分子量約為56.8 kD，具有典型的酪氨酸家族結(jié)構(gòu)域。該基因在蓮藕莖尖、幼葉、藕鮮切片、花瓣、莖稈5種組織中均有表達(dá)，其中莖尖和幼葉中表達(dá)量最高，蓮藕、花瓣和莖稈表達(dá)量較少。武漢大學(xué)克隆了Mn-SOD[47]、cytCuZnSOD[48]和APX[49]等基因。Mn-SOD基因全長(zhǎng)926 bp，包括699 bp的開放讀碼框，發(fā)現(xiàn)其在蓮藕幼葉、花、莖、莖尖等多個(gè)組織中表達(dá)，且在幼葉中表達(dá)量最高[47]；cytCuZnSOD基因在葉柄和幼葉中表達(dá)量高于在根中的表達(dá)量[48]；而APX基因在蓮幼葉、根、莖尖和葉柄中均有表達(dá)，且在受傷組織中能應(yīng)激性表達(dá)[49]。Liu等[50]發(fā)現(xiàn)，蓮中的植物螯合肽合成酶（Phytochelatin synthase，PCS）NnPCS1參加了對(duì)金屬鉻的脅迫反應(yīng)，在進(jìn)行鉻脅迫處理后蓮葉片中的NnPCS1基因表達(dá)量顯著升高，在擬南芥中表達(dá)NnPCS1基因可顯著提高對(duì)鉻的吸收和積累。NBS（Nucleotide-binding site）類抗病基因是植物中最重要的一類抗病基因，其進(jìn)化模式、結(jié)構(gòu)特點(diǎn)和功能調(diào)控一直是抗病基因研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)。Jia等[51]從蓮基因組序列中發(fā)現(xiàn)了137個(gè)NBS類抗病基因，分析表明，蓮基因組中該類基因與全基因組序列一樣存在著古老的復(fù)制和重組事件，且其中52個(gè)NBS基因中含有僅在動(dòng)物、真菌和細(xì)菌基因組NBS基因中報(bào)道過的NACHT結(jié)構(gòu)域，暗示著NACHT基因和NBS基因可能具有類似的古代起源，在水生至陸生植物抗病變遷中起著重要作用。GRAS基因家族是一類具有物種特異性的基因家族，參與了植物發(fā)育和生理過程。Wang等[52]從蓮基因組中鑒定出了38個(gè)GRAS基因，對(duì)其種類、結(jié)構(gòu)進(jìn)行了研究，并與水稻、擬南芥等作物中的GRAS基因家族進(jìn)行了比較分析。R2R3-MYB轉(zhuǎn)錄因子作為調(diào)節(jié)蛋白廣泛參與苯丙烷類代謝途徑的調(diào)控，主要為黃酮類代謝途徑，與植物色素合成路徑相關(guān)。Deng等[53]在蓮基因組中發(fā)現(xiàn)了116個(gè)R2R3型 MYB基因，研究表明，13個(gè)候選基因與蓮不同組織中類黃酮合成有關(guān)，其中2個(gè)基因分別在花和種子中正向調(diào)節(jié)花青素和原花青素的生物合成。Jin 等[54]發(fā)現(xiàn)蓮中的海藻糖-6-磷酸合成酶（Trehalose-6-phosphate synthase，TPS）基因家族在進(jìn)化過程中受到純化選擇，且在淹水處理下TPS基因表達(dá)量均顯著提高，發(fā)現(xiàn)其中2個(gè)TPS基因可能在蓮能量代謝和脅迫反應(yīng)中起著重要作用。此外，蓮藕中的一些抗逆相關(guān)蛋白基因如金屬硫蛋白基因NnMT2a[55]、膜聯(lián)蛋白基因NnANN1[5]和轉(zhuǎn)錄因子LrbZIP[48]被成功克隆并轉(zhuǎn)化到擬南芥或煙草中，提高了轉(zhuǎn)基因植株抗逆性。

3.3 蓮重要生理過程的轉(zhuǎn)錄組研究

在蓮重要生理過程的轉(zhuǎn)錄組、蛋白質(zhì)組和代謝組研究方面，Cheng等[56]對(duì)藕發(fā)育和膨大過程中的基因表達(dá)模式，轉(zhuǎn)錄組分析發(fā)現(xiàn)了20個(gè)在蓮藕藕鞭期、膨大前期、中期和后期均差異性表達(dá)的基因，分析表明，這些基因主要和能量代謝和貯存相關(guān)。Deng等[57]利用蛋白質(zhì)組結(jié)合表觀遺傳學(xué)研究表明，ANS基因啟動(dòng)子甲基化可能是調(diào)控蓮開紅花或白花的主要原因。Yang等[58]利用轉(zhuǎn)錄組分析了熱帶蓮和溫帶蓮地下莖發(fā)育的差異基因，發(fā)掘出與蓮地下莖膨大過程相關(guān)的24個(gè)基因，這些基因主要與光周期、淀粉合成代謝及激素傳導(dǎo)相關(guān)。Wang 等[59]利用代謝組結(jié)合蛋白組分析了蓮籽發(fā)育的4個(gè)不同時(shí)期代謝物和蛋白的動(dòng)態(tài)變化，研究表明，其糖代謝、糖酵解、三羧酸循環(huán)和氨基酸代謝等過程具有明顯的差異，重構(gòu)了蓮籽發(fā)育過程中的合成代謝途徑。Liu等[60]構(gòu)建了蓮高溫脅迫下的轉(zhuǎn)錄表達(dá)譜，其中小分子熱激蛋白（sHSPs）在熱激后快速、大量富集，細(xì)胞及其組分形態(tài)建成相關(guān)基因如伸展蛋白、細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)基因、木葡聚糖相關(guān)基因和脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)基因等在熱脅迫后被強(qiáng)烈誘導(dǎo)，研究表明蛋白質(zhì)的折疊加工、細(xì)胞及其組分的形態(tài)建成與蓮的熱激脅迫密切相關(guān)。

3.4 蓮miRNA研究進(jìn)展

miRNA在生長(zhǎng)發(fā)育過程中起著重要的調(diào)控作用。Zheng等[61]從葉片和花中鑒定出了分別屬于41個(gè)保守和已知基因家族的81個(gè)miRNA，并預(yù)測(cè)了137個(gè)已知的miRNA靶標(biāo)基因。Pan等[62]在蓮基因組發(fā)現(xiàn)了屬于40個(gè)家族的106個(gè) miRNA，成熟的miRNAs長(zhǎng)20～24個(gè)堿基，其前體長(zhǎng)55～184個(gè)堿基，并對(duì)456個(gè)miRNA的靶標(biāo)基因進(jìn)行了注釋，發(fā)現(xiàn)在蓮葉片、莖和花等不同組織中，5個(gè)miRNA和靶標(biāo)基因的表達(dá)量存在著明顯的負(fù)相關(guān)關(guān)系。Shi等[63]通過對(duì)葉、莖、花瓣、柱頭等不同蓮組織的小RNA測(cè)序鑒定出了667個(gè)miRNA，發(fā)現(xiàn)具有高齡、高拷貝和目標(biāo)數(shù)的miRNA家族往往具有較低的丟失頻率傾向，并發(fā)現(xiàn)丟失頻率與基因組復(fù)制之間有著密切聯(lián)系，發(fā)現(xiàn)花粉-柱頭互作相關(guān)的miRNA存在強(qiáng)烈的凈化選擇作用，熱帶蓮和溫帶蓮miRNA序列上的差異與其靶標(biāo)基因在葉片和藕發(fā)育過程中的表達(dá)差異有關(guān)。

Jin等[64]對(duì)淹水處理的RNAi及其靶標(biāo)基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行了分析，發(fā)現(xiàn)了在淹水逆境條件下差異表達(dá)的128個(gè)已知和20個(gè)新的miRNA基因，并鑒定出了629個(gè)靶標(biāo)轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物并對(duì)其進(jìn)行了注釋，研究發(fā)現(xiàn)一些與代謝、生理和形態(tài)適應(yīng)相關(guān)的miRNA在淹水適應(yīng)中發(fā)揮了重要作用。Hu等[65]鑒定出了蓮籽萌發(fā)過程中47個(gè)家族的145個(gè)已知的和78個(gè)新的miRNA，發(fā)現(xiàn)一些在單子葉和雙子葉植物中均未曾報(bào)道過的miRNA，對(duì)其鑒定出的2 580個(gè)靶標(biāo)基因分析表明，這些基因主要集中在轉(zhuǎn)錄調(diào)控、碳水化合物代謝、氨基酸和能量代謝等生理過程中。此外，還有對(duì)蓮小干擾RNA及其位點(diǎn)（PHAS）的挖掘和研究等[66]。endprint

4 總結(jié)與展望

基因組測(cè)序包括葉綠體測(cè)序等大量的分子證據(jù)已基本證明了蓮在植物進(jìn)化史上的地位，即其屬于雙子葉植物基部，其與山龍眼科和懸鈴木科較為接近，這目前在學(xué)術(shù)上已無爭(zhēng)議。在美洲黃蓮和亞洲蓮起源和進(jìn)化方面，分子生物學(xué)證據(jù)認(rèn)為其具有共同的祖先，而化石證據(jù)表明亞洲蓮和美洲黃蓮分別起源于歐亞大陸和北美大陸的不同物種，因此，需要更為廣泛的收集美洲黃蓮資源才可能獲得一個(gè)更為準(zhǔn)確的評(píng)價(jià)，也有助于深入揭示蓮不同種間的進(jìn)化歷史。

在亞洲蓮分類方面已取得許多進(jìn)展，基本明確了中國栽培蓮類型劃分、親緣關(guān)系和遺傳多樣性等?，F(xiàn)有研究表明，蓮多樣性較低，特別是野蓮的多樣性甚至低于栽培蓮，這在其他作物如大豆、水稻等作物中是不常見的，其主要原因可能與中國歷史氣候變遷和歷代對(duì)湖泊的圍墾破壞，蓮生境的急劇減少有關(guān)。長(zhǎng)期以來，長(zhǎng)江流域湖泊河流眾多，蓮分布廣泛，類型多樣，被認(rèn)為是蓮的起源中心之一。而我們的初步研究表明，我國云南地區(qū)以及泰國、新加坡等東南亞地區(qū)野蓮資源多樣性高于長(zhǎng)江流域和東北地區(qū)。因此，我們推測(cè)東南亞和云貴高原地區(qū)更有可能是蓮的起源中心，因此，進(jìn)一步加強(qiáng)東南亞、云貴高原地區(qū)蓮資源的收集和研究，明確亞洲蓮的遺傳多樣性、起源和進(jìn)化，將有利于蓮資源保存和保護(hù)、新品種選育和特異基因挖掘等。

近年來，二代測(cè)序技術(shù)、蛋白質(zhì)組、代謝組等技術(shù)的飛速發(fā)展極大地促進(jìn)了蓮分子生物學(xué)研究的發(fā)展。在此基礎(chǔ)上，已有一批生長(zhǎng)發(fā)育、抗病抗逆調(diào)控相關(guān)的基因被成功挖掘和分析，然而重要農(nóng)藝性狀相關(guān)的基因挖掘和相關(guān)研究仍較為少見。此外，由于蓮組織培養(yǎng)和轉(zhuǎn)基因技術(shù)研究的滯后，少有研究能將基因功能和表型驗(yàn)證相結(jié)合，也阻礙了蓮基因功能的深入研究和應(yīng)用。因此，我們提出：①應(yīng)加強(qiáng)在育種上具有重要應(yīng)用價(jià)值的蓮功能基因的挖掘和研究，如抗病性、產(chǎn)量等，開展重點(diǎn)栽培蓮主要農(nóng)藝性狀定位和標(biāo)記開發(fā)工作，如藕蓮性狀入泥深度、煨湯品質(zhì)、地下莖大小等和子蓮性狀如蓮蓬數(shù)、心皮數(shù)和籽粒大小等，以助力于蓮分子育種的發(fā)展。②組織培養(yǎng)和轉(zhuǎn)基因技術(shù)在蓮優(yōu)異種質(zhì)快速純合、重要基因功能驗(yàn)證和外源基因?qū)氲确矫婢哂胁豢苫蛉钡闹匾饔?。?yīng)進(jìn)一步加強(qiáng)蓮組織培養(yǎng)和再生體系建立的相關(guān)研究，力爭(zhēng)在相關(guān)方面有所突破。此外，在目前體細(xì)胞胚再生體系尚未建立和轉(zhuǎn)基因研究仍是空白的情況下，能否嘗試其他轉(zhuǎn)基因方法和策略，如莖尖轉(zhuǎn)化法、花粉管通道法等，值得進(jìn)一步探索。③蓮具有廣泛的藥用、保健功能，其主要能效因子為其富含荷葉堿、多酚、黃酮等次生代謝產(chǎn)物，加強(qiáng)對(duì)蓮次生代謝物含量、功能、合成代謝路徑及其基因的研究，促進(jìn)蓮保健藥用原理機(jī)制研究，對(duì)推動(dòng)蓮各類藥物保健產(chǎn)品的研發(fā)，提高對(duì)蓮傳統(tǒng)廢棄物如荷葉、蓮房等的利用，擴(kuò)充蓮生產(chǎn)價(jià)值鏈，提高蓮種植效益具有重要意義。

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Research Progress in Molecular Biology and Genomics of Nelumbo

LIU Zhengwei， JI Qun， KE Weidong， ZHU Honglian， LIU Yuping，

PENG Jing， KUANG Jing， WANG Yun， GUO Dandan

（ Vegetable Research Institute， Wuhan Academy of Agricultural Sciences， 430345 ）

Abstract： In this article， we reviewed the research progress in molecular biology and genomics of Nelumbo， including nuclear and organelle genome sequencing， phylogenetic evolution and geneticdiversity， gene mining and functional analysis， and the possible future research is also prospected.

Key words： Nelumbo； Genomics； Molecular biology； Research progressendprint