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    2-氨基葡萄糖-熒光染料-紫杉醇兩性小分子單體的制備與表征

    2017-11-01 21:38:40曹玉瑤王維維周宣羽劉紅艷丁青根單玲玲
    宿州學(xué)院學(xué)報(bào) 2017年9期
    關(guān)鍵詞:兩性紫杉醇氨基

    曹玉瑤,王維維,周宣羽,劉紅艷,丁青根,單玲玲

    宿州學(xué)院生物與食品工程學(xué)院,生物技術(shù)藥物研究所,宿州,234000

    2-氨基葡萄糖-熒光染料-紫杉醇兩性小分子單體的制備與表征

    曹玉瑤,王維維,周宣羽,劉紅艷,丁青根,單玲玲*

    宿州學(xué)院生物與食品工程學(xué)院,生物技術(shù)藥物研究所,宿州,234000

    在前期研究的基礎(chǔ)上,選用已制備的2-氨基葡萄糖和熒光染料(2DA-FITC )作為“導(dǎo)向基團(tuán)”靶向高表達(dá)葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)受體GLUT1的腫瘤細(xì)胞和組織,并將其作為兩性小分子的親水端,共價(jià)偶聯(lián)紫杉醇-谷氨酸(PTX-Glu)作為兩性小分子疏水端,合成同時(shí)具有親水性和疏水性的2-氨基葡萄糖-熒光染料-紫杉醇(2DA-FITC-PTX)兩性小分子單體,并用LC-MS和核磁共振氫譜1H-NMR對(duì)2DA-FITC-PTX進(jìn)行結(jié)構(gòu)表征。實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明已成功制備2DA-FITC-PTX兩性小分子單體。

    兩性小分子;2-氨基葡萄糖; 紫杉醇

    目前,臨床上廣泛使用的小分子和高分子藥物都存在以下缺點(diǎn):(1)小分子藥物通過(guò)口服或注射給藥,短時(shí)間內(nèi)體內(nèi)藥物濃度遠(yuǎn)超過(guò)實(shí)際需求量,且無(wú)選擇性;新陳代謝快、半衰期短、體內(nèi)濃度很快降低而影響療效,故需要大劑量給藥,而過(guò)高的藥物濃度又會(huì)增強(qiáng)藥物的副作用[1];(2)生物高分子藥物在體內(nèi)易被酶降解或失活,生物半衰期短, 需重復(fù)給藥;還受到如免疫系統(tǒng)、組織、細(xì)胞膜等的限制,多數(shù)不易通過(guò)這些生物屏障,因而高分子藥物的生物利用度較低[2]。因此,如何提高化學(xué)藥物的局部濃度,減少全身毒副反應(yīng),一直是學(xué)界研究的熱門課題。

    近年來(lái),國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)難溶性化學(xué)藥物劑型的研究取得一些進(jìn)展,其中將難溶性化學(xué)藥物構(gòu)建成腫瘤靶向性納米粒子載藥系統(tǒng)是重要方法之一。用于藥物輸送的納米粒子材料主要是高分子聚合物,載有藥物的聚合物納米粒子通常以膠體分散體的形式通過(guò)口服或經(jīng)皮、皮下和肌肉注射,動(dòng)脈注射,靜脈點(diǎn)滴以及體腔黏膜吸附等給藥途徑進(jìn)入人體[3-4],但高分子聚合物由于分子量較大,在體內(nèi)很難分散成單體形式給藥[5-6]。因此,學(xué)界嘗試制備結(jié)構(gòu)規(guī)整的兩性腫瘤靶向性小分子,在體內(nèi)釋放靶向性小分子作用于腫瘤組織。

    本文在前期研究的基礎(chǔ)上,將已制備的2-氨基葡萄糖-熒光染料(2DA-FITC)作為兩性小分子單體的親水端,共價(jià)偶聯(lián)谷氨酸-紫杉醇前藥中間體,并將其作為兩性小分子單體的疏水端,合成兩性小分子單體2-氨基葡萄糖-熒光染料-紫杉醇前藥,采用LC-MS和1H-NMR對(duì)結(jié)構(gòu)進(jìn)行表征。

    1 試劑與方法

    1.1 實(shí)驗(yàn)試劑

    2-氨基葡萄糖由實(shí)驗(yàn)室制備,紫杉醇(PTX)、谷氨酸[Fmoc-Glu(OtBu)-OH]、熒光染料FITC均購(gòu)買于sigma公司,二氯甲烷(DCM)和4-二甲氨基必定(DMAP)為AR級(jí),購(gòu)于國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

    1.2 儀器設(shè)備

    核磁共振1H-NMR和質(zhì)譜LC-MS檢測(cè)儀器由中國(guó)藥科大學(xué)生物醫(yī)學(xué)工程研究室提供。

    1.3 實(shí)驗(yàn)方法

    1.3.1 谷氨酸-紫杉醇(Glu-PTX)的合成

    稱取100 mg(0.117 mmoL)PTX溶于15 mL的DCM,同時(shí)加入59.7 mg (0.1404 mmol,1.2 eqv)Fmoc-Glu(OtBu)-OH和14.29 mg DMAP(0.117mmoL),將44.85 mg(0.234mmoL,2eqv)EDC溶于10 mL DCM中,在冰浴條件下,將10 mL溶于EDC溶液,并緩慢滴入到PTX反應(yīng)體系中,大約25 min滴加完畢,除去冰浴,室溫下攪拌26 h,用TLC示蹤。待反應(yīng)完后,用同體積的DCM稀釋,然后用同體積的蒸餾水洗2次,加入無(wú)水硫酸鎂干燥,真空旋蒸后得晶狀體產(chǎn)物谷氨酸-紫杉醇,其結(jié)構(gòu)用LC-MS進(jìn)行分子量鑒定。

    1.3.2 2-氨基葡萄糖-谷氨酸-紫杉醇(2DA-Glu(OtBu)-PTX)中間體的制備

    將產(chǎn)物Fmoc-Glu(OtBu)-PTX中溶于8 mL DCM,并加入100 μL,在室溫下攪拌過(guò)夜,直至出現(xiàn)渾濁,然后用TLC示蹤。將產(chǎn)物再次真空旋蒸除去溶劑,再用乙醚萃取(OtBu溶于乙醚中),放入冰箱過(guò)夜,將乙醚去除,烘干產(chǎn)物,即得脫去了OtBu的Fmoc-Glu(COOH)-PTX白色晶體。將0.01 mmol Fmoc-Glu(COOH)-PTX溶于DMF中,加入EDC和NHS(摩爾比1∶1.2∶2)活化Fmoc-Glu(COOH)-PTX的羧基,室溫?cái)嚢? h后,加入0.01 mmoL 2DA,室溫下攪拌過(guò)夜,將反應(yīng)液經(jīng)硅膠柱純化,得到純化的2-氨基-谷氨酸-紫杉醇(2DA-Fmoc-Glu-PTX),將2DA-Fmoc-Glu-PTX溶于DCM體系中,再加入2 mL哌啶(使哌啶為總體積的20%),用乙醚萃取,用TLC示蹤,得到2DA-NH2-Glu-PTX前藥,并鑒定其化學(xué)結(jié)構(gòu)。

    1.3.3 2-氨基葡萄糖-熒光染料-紫杉醇(2DA-FITC-PTX)兩性小分子單體的制備

    將0.1 mmoL 2DA-NH2-Glu-PTX前藥中加入7 mL DCM溶解后,加入0.1 mmoL熒光染料FITC,室溫下攪拌過(guò)夜,將反應(yīng)液經(jīng)G15純化,去除沒(méi)有共價(jià)偶聯(lián)的2DA-NH2-Glu-PTX和FITC片段,得到純化的2氨基葡萄糖-熒光染料紫杉醇前藥(2DA-NH2-Glu-PTX-FITC)小分子單體,-20℃儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

    1.3.4 靶向性紫杉醇前藥單體及中間體的表征

    用核磁共振氫譜1H和LC-MS對(duì)靶向性紫杉醇藥前藥中間體和單體進(jìn)行化學(xué)結(jié)構(gòu)鑒定。

    2 結(jié)果與討論

    2.1 谷氨酸-紫杉醇中間體(Glu-PTX)結(jié)構(gòu)鑒定

    純化后的NH2-Glu(OtBu)-PTX用LC-MS分析,其質(zhì)譜鑒定的結(jié)果與NH2-Glu(OtBu)-PTX的理論分子完全一致,NH2-Glu(OtBu)-PTX:MS (ESI,m/z): 1283.4([M+H]+) ,如圖1。證明已成功合成谷氨酸-紫杉醇中間體。

    圖1 LC-MS鑒定谷氨酸-紫杉醇中間體的分子量 NH2-Glu(OtBu)-PTX: MS (ESI, m/z): 1283.4([M+H]+)

    2.2 2-氨基葡萄糖-紫杉醇(2DA-PTX)前藥結(jié)構(gòu)鑒定

    用LC-MS對(duì)2-氨基葡萄糖-紫杉醇(2DA-PTX)分子量進(jìn)行鑒定,結(jié)果顯示其質(zhì)譜鑒定的結(jié)果與2DA-PTX前藥理論上分子量完全一致,2DA-PTX:MS(ESI,m/z):1656.68([M+H]+),如圖2。由此可證明2DA-PTX前藥已成功地合成。

    圖2 LC-MS鑒定2-氨基葡萄糖-紫杉醇分子量 2DA-PTX:MS(ESI,m/z):1656.68 ([M+H]+)

    2.3 兩性小分子2-氨基葡萄糖-熒光染料紫杉醇(2DA-FITC-PTX )單體結(jié)構(gòu)鑒定

    用核磁共振氫譜1H鑒定2-氨基葡萄糖-熒光染料紫杉醇前藥單體結(jié)構(gòu),從氫譜圖可以看出親水端與疏水端共價(jià)偶聯(lián)2-OH位置在4.77 ppm到5.44 ppm之間(圖3),證明小分子單體的合成。

    圖3 核磁氫譜鑒定小分子2-氨基葡萄糖-熒光染料紫杉醇前藥單體

    3 結(jié) 論

    在傳統(tǒng)抗腫瘤藥物劑型中,存在包封率低、易滲漏、穩(wěn)定性差、毒副作用大和靶向性差等問(wèn)題[7]。兩性小分子自組裝靶向性納米粒子載藥系統(tǒng),在高效率載藥的同時(shí),在酸性條件下也可生物降解成小分子靶向性前藥釋放紫杉醇原藥。納米粒子藥物除具有低毒、高效、緩釋、長(zhǎng)效,能識(shí)別變異細(xì)胞,藥物穩(wěn)定性好,藥物釋放后的高分子載體無(wú)毒,不會(huì)長(zhǎng)期積累在體內(nèi),以及副作用小等優(yōu)點(diǎn)外[8], 還具有更強(qiáng)的定向釋放能力, 是各種藥物的較佳替代品。本文在前期研究的基礎(chǔ)上,用2-氨基葡萄糖-熒光染料(2-DA-FITC)作為兩性小分子單體的“導(dǎo)向基團(tuán)”和親水端,共價(jià)偶聯(lián)谷氨酸-紫杉醇[(2DA-Glu(OtBu)-PTX]中間體作為兩性小分子單體的疏水端,制備兩性小分子單體2-氨基葡萄糖-熒光染料-紫杉醇前藥(2DA-FITC-PTX),旨在為進(jìn)一步構(gòu)建靶向性納米藥物傳遞體系提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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    (責(zé)任編輯:汪材印)

    TP273

    A

    1673-2006(2017)09-0115-03

    10.3969/j.issn.1673-2006.2017.09.027

    2017-07-05

    國(guó)家級(jí)大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目(201510379027,201410379014);安徽省教育廳自然科學(xué)研究重點(diǎn)項(xiàng)目(KJ2014A249);宿州學(xué)院科研平臺(tái)開(kāi)放課題(2016ykf08)。

    曹玉瑤(1995-),女,安徽宿州人,研究方向:腫瘤靶向性藥物的合成與應(yīng)用。

    *通信作者:?jiǎn)瘟崃?1971-),女,安徽宿州人,博士,副教授,研究方向:抗腫瘤藥物及其新劑型。

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