重編程誘導(dǎo)多功能干細(xì)胞的研究進(jìn)展*

郭曉令， 劉 慶， 王 嬋， 郭永龍， 余榕捷， 陳建蘇,2,△

(暨南大學(xué) 1再生醫(yī)學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 2醫(yī)學(xué)院眼科研究所，3附屬第一臨床學(xué)院眼科， 4生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院細(xì)胞生物學(xué)系，廣東 廣州 510632)

誘導(dǎo)多功能干細(xì)胞(induced pluripotent stem cells，iPSCs)，即通過不同的轉(zhuǎn)導(dǎo)方法，將影響重編程的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子、RNA、蛋白或小分子化合物導(dǎo)入到成體細(xì)胞，使其“返老還童”回到胚胎干細(xì)胞狀態(tài)，并能夠被誘導(dǎo)分化產(chǎn)生不同的細(xì)胞類型。iPSCs的問世，對干細(xì)胞的發(fā)展具有劃時(shí)代的意義，使得患者來源的體細(xì)胞可以被誘導(dǎo)成iPSCs，用于相關(guān)疾病的檢測分析與干細(xì)胞治療，規(guī)避了免疫排斥和道德論理等問題。但是由于iPSCs誘導(dǎo)的低效性和致瘤性，使得這個(gè)“新星”在臨床中的應(yīng)用被質(zhì)疑，目前科學(xué)家一直圍繞這2個(gè)核心問題展開研究，通過改進(jìn)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，改變重編程方法來提高它的安全性和效率，并取得了一系列喜人的結(jié)果，從而使iPSCs未來用于臨床的前景變得越來越光明。

1 可誘導(dǎo)多功能干細(xì)胞取材不同的靶細(xì)胞

2006年，Takahashi等[1]首次實(shí)現(xiàn)將Oct4、Sox2、c-Myc及Klf4轉(zhuǎn)錄因子導(dǎo)入到小鼠皮膚成纖維細(xì)胞,獲得了類似于胚胎干細(xì)胞(embryonic stem cells, ES)的多能性干細(xì)胞, 并命名為“誘導(dǎo)多能性干細(xì)胞”，從而拉開了iPSCs研究的序幕。2007年，Takahashi等[2]和Yu等[3]又分別將人成纖維細(xì)胞誘導(dǎo)成iPSCs, 從而使iPSCs用于臨床治療的可能性又向前邁進(jìn)了一步。2008年，Aoi等[4]將4種轉(zhuǎn)錄因子導(dǎo)入到鼠內(nèi)胚層的肝臟細(xì)胞和胃上皮細(xì)胞，成功重編程出iPSCs。同年，Hanna等[5]又將4種轉(zhuǎn)錄因子導(dǎo)入到鼠中胚層的B淋巴細(xì)胞，成功誘導(dǎo)出iPSCs。2008年，Kim等[6]實(shí)現(xiàn)了將2種轉(zhuǎn)錄因子導(dǎo)入到人外胚層的神經(jīng)干細(xì)胞，從而實(shí)現(xiàn)了iPSCs的重編程。2011年，Zhou等[7]從人的尿液中提取的腎小管細(xì)胞成功重編程出iPSCs，這使得誘導(dǎo)iPSCs取材細(xì)胞來源更加豐富和多樣化。由于取材細(xì)胞來自三胚層的體細(xì)胞(表1)，所以從理論上講，機(jī)體的所有細(xì)胞均可被誘導(dǎo)成iPSCs。

2 通過不同途徑重編程iPSCs

Takahashi等[1]首次實(shí)現(xiàn)了iPSCs在DNA水平的重編程，但是重編程效率很低，而且由病毒介導(dǎo)，同時(shí)轉(zhuǎn)錄因子中包含了c-Myc 致瘤蛋白，安全性較差。近幾年，通過不斷的改進(jìn)技術(shù)，分別實(shí)現(xiàn)了在RNA水平、蛋白質(zhì)水平以及小分子化合物水平的iPSCs重編程，使重編程iPSCs的安全性和效率得到相應(yīng)的提高。

表1 總結(jié)不同種屬的不同細(xì)胞重編程

2.1通過DNA途徑的重編程iPSCs 鼠和人的體細(xì)胞能通過一系列轉(zhuǎn)錄因子，在DNA水平實(shí)現(xiàn)重編程為iPSCs(表2)。2006年，Takahashi等[1]首次通過Oct4、Sox2、c-Myc和Klf4因子將鼠的體細(xì)胞重編程iPSCs。2007年，Yu等[3]報(bào)道另一套轉(zhuǎn)錄因子Oct4、Sox2、Nanog及Lin8，將體細(xì)胞重編程為iPSCs。2008年，Duinsbergen等[8]和Wernig等[9]又分別實(shí)現(xiàn)了利用3種轉(zhuǎn)錄因子(Oct4、c-Myc和Klf4；或Oct4、Sox2和Klf4)將體細(xì)胞重編程為iPSCs。同年，Kim等[6]也實(shí)現(xiàn)利用2種轉(zhuǎn)錄因子Oct4、Klf4或c-Myc將神經(jīng)干細(xì)胞重編程為iPSCs， Huangfu等[10]成功利用Oct4和Sox2轉(zhuǎn)錄因子重編程成纖維細(xì)胞。通過進(jìn)一步改進(jìn)實(shí)驗(yàn)方法，Kim等[11]僅用一種關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子Oct4實(shí)現(xiàn)了對神經(jīng)干細(xì)胞的重編程。

表2 總結(jié)重編程不同細(xì)胞的不同轉(zhuǎn)錄因子

2.2通過RNA途徑的重編程iPSCs DNA途徑的重編程無法規(guī)避基因插入而引起致瘤的風(fēng)險(xiǎn)，為了提高重編程iPSCs的安全性，2010年，Yakubov等[12]首次報(bào)道通過RNA途徑將人的體細(xì)胞重編程為iPSCs。通過在體外使用T7 RNA聚合酶和線性化質(zhì)粒pTMA，構(gòu)建合成Oct4、Lin28、Sox2及 Nanog的mRNA系統(tǒng)，合成4種轉(zhuǎn)錄因子的mRNA,利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染到人的體細(xì)胞，從而實(shí)現(xiàn)重編程iPSCs。但是由于mRNA的穩(wěn)定性差，需要每間隔24 h 連續(xù)轉(zhuǎn)染mRNA，直到出現(xiàn)iPSCs陽性克隆為止，所以操作起來較麻煩。同年，Warren等[13]通過對體外合成Klf4、c-Myc、Oct4及Sox2 mRNA進(jìn)行5’端糖基化和甲基化修飾，延長mRNA的半衰期，從而轉(zhuǎn)染1次可以穩(wěn)定表達(dá)較長時(shí)間，顯著簡化重編程過程。2013年, Yashioka等[14]進(jìn)一步改進(jìn)技術(shù)，構(gòu)造出能夠自我復(fù)制的VEE-RF RNA復(fù)制子，該復(fù)制子會在降解之前能高表達(dá)4種重編程因子(Oct4, Klf4, Sox2, c-Myc或Glis1)RNA，將其導(dǎo)入到人的體細(xì)胞，可成功重編程出iPSCs，從而使RNA水平重編程技術(shù)得到更大提高。另外，Anokye-Danso等[15]在外加Hdac2，將外源合成的miR302/367克隆到pLOVE載體上，將其轉(zhuǎn)染到人和鼠的成纖維細(xì)胞，成功重編程出iPSCs，使RNA水平的重編程更加多樣化。

2.3通過蛋白途徑的重編程iPSCs Zhou等[16]首次報(bào)道通過蛋白途徑實(shí)現(xiàn)了對小鼠體細(xì)胞的重編程，將Oct4、Sox2、Klf4、及 c-Myc 4種轉(zhuǎn)錄因子的基因克隆到原核生物表達(dá)載體上，并在其末端外加11個(gè)精氨酸殘基的基因，構(gòu)建融合蛋白表達(dá)載體，使其在大腸桿菌中大量表達(dá)，從而純化獲取4種轉(zhuǎn)錄因子對應(yīng)的蛋白。2013年，Nemes等[17]再次報(bào)道利用改造后的4種關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄蛋白將鼠的體細(xì)胞重編程為iPSCs,并將iPSCs注射到小鼠的早期胚囊中，成功獲得嵌合體小鼠。不僅通過原核表達(dá)載體獲取的轉(zhuǎn)錄蛋白可以重編程iPSCs,來自真核表達(dá)載體的轉(zhuǎn)錄蛋白同樣能重編程iPSCs。Kim等[18]分別將Oct4、Sox2、Klf4及c-Myc的基因進(jìn)行改造，在其末端加上具有細(xì)胞膜穿梭功能的CPP短肽基因，構(gòu)建真核表達(dá)重組載體，使其在真核細(xì)胞內(nèi)表達(dá)，從而獲取構(gòu)象上更接近真核的4種融合轉(zhuǎn)錄蛋白，將其加入到誘導(dǎo)培養(yǎng)基，不用外加小分子化合物便可將人的體細(xì)胞重編程為iPSCs。隨后，Kim團(tuán)隊(duì)基于蛋白途徑重編程的iPSCs,誘導(dǎo)其定向分化為功能性多巴胺神經(jīng)元細(xì)胞，并移植這些細(xì)胞到患有帕金森疾病的小鼠模型中，成功達(dá)到了治療的效果[19]。由于沒有外源基因的介入，安全性高，從而為未來人類個(gè)性化的細(xì)胞治療帕金森疾病開辟了全新的道路。2012年，Zhang等[20]對帶有11個(gè)精氨酸的融合蛋白介導(dǎo)的重編程與帶有穿膜肽融合蛋白介導(dǎo)的重編程效率進(jìn)行了比較，發(fā)現(xiàn)帶有穿膜肽的4種轉(zhuǎn)錄蛋白重編程的效率要明顯高于帶有11個(gè)精氨酸的轉(zhuǎn)錄蛋白。

2.4通過小分子化合物途徑的重編程iPSCs 重編程的發(fā)生主要與核小體中DNA的甲基化和組蛋白的?；约耙恍╆P(guān)鍵信號通路有關(guān)，通過影響細(xì)胞的表觀遺傳學(xué)及關(guān)鍵信號通路，可以獲得重編程效果。2011年，Li等[21]通過尋找影響重編程的表觀遺傳和關(guān)鍵信號通路的抑制劑或激活劑，首次報(bào)道僅用Oct4一種轉(zhuǎn)錄因子，外加VC6T(VPA、CHIR 99021、616452和tranylcypromine)4種小分子化合物成功將鼠的體細(xì)胞重編程為iPSCs，從而實(shí)現(xiàn)了利用小分子化合物取代Sox2、Klf4 及c-Myc 3種關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子。2013年，通過改進(jìn)技術(shù)，我國的Hou等[22]成功利用6種小分子化合物VC6TF(VPA、CHIR99021、616452、Tranylcypromine、FSK和DZNep)徹底取代了4種關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，實(shí)現(xiàn)了在小分子化合物水平的重編程，將鼠的體細(xì)胞重編程為iPSCs，其中DZNep在啟動內(nèi)源性O(shè)ct4的表達(dá)中發(fā)揮至關(guān)重要的作用。

3 重編程iPSCs的轉(zhuǎn)導(dǎo)方法

3.1病毒轉(zhuǎn)導(dǎo) Takahashi等[1]首次通過反轉(zhuǎn)錄病毒將4種關(guān)鍵的轉(zhuǎn)錄因子導(dǎo)入到鼠的體細(xì)胞，成功實(shí)現(xiàn)了iPSCs在DNA水平的重編程。2008年，Stadtfeld等[23]采用腺病毒包裝4種轉(zhuǎn)錄因子，將其高效導(dǎo)入到鼠的體細(xì)胞，實(shí)現(xiàn)iPSCs的成功構(gòu)建。同年，Hanna等[5]通過慢病毒包裝，將4種轉(zhuǎn)錄因子導(dǎo)入到鼠的B淋巴細(xì)胞，成功誘導(dǎo)出iPSCs。次年，F(xiàn)usaki等[24]首次報(bào)道采用Sendai病毒成功實(shí)現(xiàn)了對人的體細(xì)胞重編程，Sendai病毒為RNA病毒，介導(dǎo)的重編程不會引起宿主基因插入，從而提高了iPSCs構(gòu)建的安全性。

3.2脂質(zhì)體轉(zhuǎn)導(dǎo) 2012年，Park等[25]采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染技術(shù)，將包含4種轉(zhuǎn)錄因子的2種重組載體pCX-OKS-2A及pCX-c- Myc共轉(zhuǎn)染導(dǎo)入鼠的胚胎成纖維細(xì)胞，實(shí)現(xiàn)非病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)的重編程，極大提高了構(gòu)建iPSCs的安全性，但是轉(zhuǎn)導(dǎo)效率要明顯低于病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)。

3.3核酸轉(zhuǎn)導(dǎo) 2009年，Gonzalez等[26]首次報(bào)道采用核酸轉(zhuǎn)導(dǎo)技術(shù)，將融合4種轉(zhuǎn)錄因子基因的pCAG-OSKM重組載體導(dǎo)入鼠的胚胎成纖維細(xì)胞，成功將其重編程為iPSCs。2010年，Jia等[27]同樣采用核酸轉(zhuǎn)導(dǎo)技術(shù)，將含有4種轉(zhuǎn)錄因子的小環(huán)導(dǎo)入人的體細(xì)胞，構(gòu)建出安全有效的iPSCs。

3.4納米高分子材料轉(zhuǎn)導(dǎo) 2011年，Montserrat等[28]首次報(bào)道利用納米高分子多聚β氨基酯，將融合4種轉(zhuǎn)錄因子Oct4、Sox2、Klf4、c-Myc和GFP報(bào)告基因的重組載體pCAG-OSKMG導(dǎo)入的成纖維細(xì)胞，成功構(gòu)建出iPSCs。

4 體內(nèi)重編程誘導(dǎo)iPSCs的研究

以上研究均是在體外進(jìn)行的體細(xì)胞重編程，隨著技術(shù)的發(fā)展，目前可以實(shí)現(xiàn)在體內(nèi)完成定向重編程[29]，這樣獲得的iPSCs相比體外重編程的iPSCs更加接近胚胎干細(xì)胞(ES cells)的狀態(tài)，并且比ES細(xì)胞具有更好的可塑性和原始性。目前還可以直接將供體細(xì)胞導(dǎo)入到體內(nèi)，在機(jī)體微環(huán)境和外源化合物的共同作用下，直接重編為目的細(xì)胞[30-34]。

5 展望

iPSCs的誕生，使干細(xì)胞在再生醫(yī)學(xué)方面的應(yīng)用得到巨大突破，不僅解決了免疫排斥問題，同時(shí)也規(guī)避了道德論理等問題。隨著iPSCs研究的發(fā)展，用來誘導(dǎo)iPS細(xì)胞的供體細(xì)胞變得越來越廣泛和多樣化。雖然目前構(gòu)建iPSCs的效率和安全性有了較大的提高，但是距離廣譜的臨床應(yīng)用還有很大差距，需要進(jìn)一步改進(jìn)技術(shù)。在提高安全性方面，可以側(cè)重蛋白質(zhì)結(jié)合小分子化合物的重編程；在提高效率方面，可以改變轉(zhuǎn)錄因子的添加順序[35]，調(diào)整轉(zhuǎn)錄因子最佳濃度比例[13]，改善轉(zhuǎn)導(dǎo)時(shí)間[36]，優(yōu)化培養(yǎng)條件[37]等。也可以探索影響重編程的關(guān)鍵信號通路，通過siRNA干擾使其在本體基因水平沉默，這樣既不會引起外源基因插入，同時(shí)干擾效率也較高。相信在不久將來，通過不斷的改進(jìn)重編程技術(shù)和方法，iPSCs會被廣泛用于干細(xì)胞治療，造福人類。

[參 考 文 獻(xiàn)]

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