紅棗果醋醋酸菌株的分離鑒定

□ 林祥群 新疆石河子職業(yè)技術(shù)學(xué)院 劉文玉 石河子大學(xué) 顏雪琴 新疆石河子職業(yè)技術(shù)學(xué)院 魏長慶 石河子大學(xué)

紅棗果醋醋酸菌株的分離鑒定

□ 林祥群 新疆石河子職業(yè)技術(shù)學(xué)院 劉文玉 石河子大學(xué) 顏雪琴 新疆石河子職業(yè)技術(shù)學(xué)院 魏長慶 石河子大學(xué)

果醋作為一種新型保健飲料，因其營養(yǎng)豐富、風(fēng)味獨(dú)特、口感俱佳而備受廣大消費(fèi)者的歡迎。紅棗果醋就是以紅棗為主要原料，經(jīng)酒精和醋酸發(fā)酵而成，既可作為調(diào)味品，又可作為飲料直接飲用。該文從紅棗的營養(yǎng)、加工現(xiàn)狀等方面綜述紅棗果醋的研究進(jìn)展，說明紅棗果醋的開發(fā)具有廣闊的前景。

紅棗；營養(yǎng)成分；果醋；研究進(jìn)展

1 采樣說明

本研究以石河子市150團(tuán)紅棗產(chǎn)區(qū)為主要采樣地點(diǎn)，采集樣品包括紅棗種植園的土樣、紅棗樹葉以及新鮮紅棗，用富集培養(yǎng)法和平板篩選法進(jìn)行菌株的初篩，從中篩選出11株醋酸菌，搖瓶發(fā)酵法復(fù)篩，在復(fù)篩過程研究其發(fā)酵產(chǎn)酸能力，確定工作菌株L-9，然后對(duì)工作菌株的生長特性和生理生化特點(diǎn)研究，對(duì)菌株進(jìn)行鑒定，為優(yōu)質(zhì)紅棗果醋的發(fā)酵打下良好的菌種基礎(chǔ)。

2 材料與方法

2.1 材料

2.1.1 采樣原料

原料：紅棗果園土壤、紅棗果樹樹葉、市場購買的鮮棗（放置軟爛）。

對(duì)照菌株為ASI.41（A.rancens L.），本文中簡寫為A，來自石河子大學(xué)食品學(xué)院食品生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)室。

2.1.2 培養(yǎng)基

（1）初篩培養(yǎng)基：酵母膏1%、葡萄糖1%、CaCO31%、瓊脂1.5%，滅菌后加無水乙醇6%（v/v），自然pH值。

（2）復(fù)篩培養(yǎng)基：葡萄糖1%、酵母膏l(xiāng)%，滅菌后加入無水乙醇6%，自然pH值。

試管培養(yǎng)基：酵母膏1%、葡萄糖1%、CaCO30.5%、瓊脂2.0%、無水乙醇3%（v/v），自然pH值。

2.1.3 主要試劑

氫氧化鈉、氯化鉀、磷酸氫二鉀、氧化鈣、3,5-二硝基水楊酸、硝酸鈉，以上試劑均為分析純。

2.1.4 主要儀器設(shè)備

分光光度計(jì)、離心機(jī)、高壓滅菌鍋、恒溫水浴槽、顯微鏡、電子天平、恒溫恒濕搖床及酸度計(jì)等。

2 2 方法

2.2.1 菌源制備及富集培養(yǎng)

原料1：市購1 kg新鮮紅棗，放置自然軟爛，置于500 ml三角瓶中，用四層紗布封口，自然酒精發(fā)酵。用手持糖度儀測其糖度，當(dāng)糖度降到4°BX，對(duì)原料打漿涂布平板初篩培養(yǎng)基分離菌株。

從石河子醋廠采取的醋醅2 g，放入有50 mL蒸餾水的250 mL三角瓶中，30℃搖培3 d后進(jìn)行菌株篩選。

原料2：150團(tuán)紅棗種植園采集土壤，混和于無菌蒸餾水，涂布平板初篩培養(yǎng)基分離菌株。

原料3：150團(tuán)紅棗種植園采集紅棗樹葉，將樹葉用無菌手術(shù)刀剪切，放置于涂布平板初篩培養(yǎng)基分離菌株。

2.2.2 挑選醋酸菌

將稀釋涂布生長72 h的菌株中形態(tài)與醋酸菌相似的菌落接種于復(fù)篩培養(yǎng)基中，30 ℃培養(yǎng)72 h，吸取1 mL培養(yǎng)液于平板培養(yǎng)基，涂布分離，30 ℃培養(yǎng)72 h，選擇透明圈大的單菌落接種于斜面培養(yǎng)基保存。

2.2.3 醋酸菌定性試驗(yàn)

將篩選出的菌株接種于搖瓶培養(yǎng)基中，搖床30 ℃培養(yǎng)72 h后，培養(yǎng)液以15 min、4 500 r/min的轉(zhuǎn)速離心除去菌體，吸取5 mL上清夜，以0.1 mol/L氫氧化鈉中和至pH 7.0，將中和液煮沸，加入0.1 mol/L氯化鐵溶液5滴，有紅褐色沉淀產(chǎn)生者為產(chǎn)醋酸菌。

2.2.4 醋酸菌定量試驗(yàn)

將篩選出的醋酸菌分別接種于醋酸菌三角瓶培養(yǎng)基中，搖床30 ℃培養(yǎng)3 d后，采用堿式滴定法（以醋酸計(jì)）測其產(chǎn)酸量，從中篩選產(chǎn)酸量高的菌株進(jìn)行復(fù)篩。

滴定時(shí)，取2 mL發(fā)酵液于250 mL的三角瓶內(nèi)，加入50 mL蒸餾水，3～5滴0.5%的酚酞酒溶液，用標(biāo)定的0.IN的氫氧化鈉溶液滴至淺粉紅色，由耗用的氫氧化鈉溶液的體積計(jì)算樣品中的含酸量，每個(gè)處理均以3個(gè)平行樣的平均結(jié)果計(jì)算，選擇產(chǎn)酸量大的。

2.2.5 醋酸菌鑒定分類方法

菌落形態(tài)觀察：在平板培養(yǎng)基上用劃線分離方法培養(yǎng)細(xì)菌，20 ℃培養(yǎng)24 h，肉眼觀察單菌落形態(tài)。

菌體形態(tài)觀察：涂片固定培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期的細(xì)胞，革蘭氏染色，鏡檢。

培養(yǎng)特征觀察：液體培養(yǎng)基培養(yǎng)48 h，觀察。

表1 醋酸菌定量試驗(yàn)結(jié)果（單位：g/L）

表2 產(chǎn)酯試驗(yàn)結(jié)果（單位：g/L）

3 試驗(yàn)結(jié)果與分析

3.1 菌株分離純化

從軟爛紅棗中篩選出16株菌，對(duì)其編號(hào)為H1-16；從果園土壤中篩選出5株菌，編號(hào)為T1-5；從紅棗果樹樹葉中篩選出3株菌，對(duì)其編號(hào)為S1-3。

3.2 醋酸菌定性試驗(yàn)

對(duì)篩選出的24株菌進(jìn)行醋酸菌定性試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)有11株菌株為醋酸菌。

3.3 醋酸菌定量試驗(yàn)

對(duì)篩選的11株菌和對(duì)照菌株ASI.41（A.rancens L.）進(jìn)行產(chǎn)酸量試驗(yàn)。結(jié)果見表1。

由表1可以看出菌株H2、H5、H9、H11的產(chǎn)酸量均大于對(duì)照菌株A，故選擇H2、H5、H9、H11四株菌株進(jìn)行醋酸菌產(chǎn)酯試驗(yàn)。

3.4 醋酸菌產(chǎn)酯試驗(yàn)

對(duì)H2、H5、H9、H11進(jìn)行產(chǎn)酯試驗(yàn)。試驗(yàn)結(jié)果見表2。

由表2可知菌株H9的產(chǎn)酯量與對(duì)照A的產(chǎn)酯量相差不大，所以選H9作為工作菌株，進(jìn)行下一步研究。

3.5 醋酸菌鑒定分類

H9在固體培養(yǎng)基上菌落表面光滑，呈圓形，有凸起，菌落周圍有明顯的碳酸鈣溶解圈；液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)基變渾濁，有明顯的醋酸味。革蘭氏染色陰性，無芽孢，菌體短桿狀，單個(gè)或成對(duì)、成鏈排列。

4 結(jié)論

本試驗(yàn)從軟爛的紅棗、紅棗園土壤、紅棗樹樹葉中篩選出醋酸菌株24株，并對(duì)它們進(jìn)行醋酸菌定性試驗(yàn)，篩選出產(chǎn)醋酸菌11株，對(duì)所篩的21株醋酸菌進(jìn)行醋酸菌定量試驗(yàn)、產(chǎn)酯試驗(yàn)，選取菌株H9作為工作菌株，對(duì)H9進(jìn)行培養(yǎng)特征、形態(tài)特征研究，初步鑒定H9為醋酸桿菌屬（Pasteurianus-Acetobacter）巴氏醋酸桿菌。

魏長慶。