一種不動(dòng)桿菌/鮑曼不動(dòng)桿菌快速鑒定方法

●陳浩寧

一種不動(dòng)桿菌/鮑曼不動(dòng)桿菌快速鑒定方法

●陳浩寧

鮑曼不動(dòng)桿菌是目前臨床最常見的多重耐藥菌，但現(xiàn)有全自動(dòng)細(xì)菌鑒定儀無法將鮑曼不動(dòng)桿菌從不動(dòng)桿菌中鑒別出來。本研究基于鮑曼不動(dòng)桿菌特異性ITS序列和不動(dòng)桿菌高度保守rA序列建立多重PCR技術(shù)，可以有效地從不動(dòng)桿菌中篩選出鮑曼不動(dòng)桿菌，該方法在細(xì)菌耐藥機(jī)制和醫(yī)院內(nèi)感染的流行病學(xué)研究中具有重要使用價(jià)值。

不動(dòng)桿菌;鮑曼不動(dòng)桿菌;PCR

鮑曼不動(dòng)桿菌(Acinetobacter baumannii)是不動(dòng)桿菌屬中最重要的一個(gè)臨床分離病原菌，占臨床分離不動(dòng)桿菌的80%～90%[1]。與此同時(shí)，不動(dòng)桿菌屬中數(shù)個(gè)種與鮑曼不動(dòng)桿菌生化反應(yīng)非常相似，目前臨床自全動(dòng)細(xì)菌鑒定儀無法有效區(qū)分，故只能統(tǒng)一稱為醋酸鈣—鮑曼復(fù)合不動(dòng)桿菌[2]。目前臨床感染主要以鮑曼不動(dòng)桿菌為主，其耐藥性也最顯著，其他不動(dòng)桿菌在流行病學(xué)和耐藥機(jī)制與鮑曼不動(dòng)桿菌存在較明顯差異[3]。因此有必要建立一種快速簡便的技術(shù)，準(zhǔn)確鑒定鮑曼不動(dòng)桿菌，為醫(yī)院內(nèi)感染防治提供指導(dǎo)。

1 材料和方法

1.1 菌株

隨機(jī)選取本院分離醋酸鈣—鮑曼復(fù)合不動(dòng)桿菌40株，置于35℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)16h用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2 細(xì)菌DNA模板制備

使用陳方圓等[4]報(bào)道煮沸法制備模板：挑取單個(gè)菌落，與100μl滅菌雙蒸水中混勻，煮沸10min后離心10 min，吸取上清即為模板。

1.3 引物合成

根據(jù)鮑曼不動(dòng)桿菌ITS序列和不動(dòng)桿菌rA序列設(shè)計(jì)多重PCR引物。鮑曼不動(dòng)桿菌ITS基因擴(kuò)增引物為Ab-ITSF：5’-CATTATCACGGTAATTAGTG-3’ 和 Ab-ITS-R：5’-AGAGCACTGTGCACTTAAG-3’，預(yù)測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物長度為208bp。不動(dòng)桿菌rA基因擴(kuò)增引物為rA-F：5’-CCTGAATCTTCTGGTAAAAC-3’和rA-R：5’-GTTTCTGGGCTGCCAAA CATTAC-3’，預(yù)測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物長度為425bp。引物交由蘇州泓迅生物技術(shù)公司合成。

1.4 PCR擴(kuò)增

在PCR反應(yīng)管中依次加入如下成份：PCR預(yù)混液(南京Vazyme公司)12.5μl，上下游引物各0.5μl，模板2μl，最終加滅菌雙蒸水至25μl。PCR擴(kuò)增條件為94℃預(yù)變性5min，94℃變性10s，55℃退火30s，72℃延伸30s，重復(fù)循環(huán)35次，最終72℃延伸10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物通過1%濃度瓊脂糖電泳分析結(jié)果。

2 結(jié)果

經(jīng)1%濃度瓊脂糖電泳后，40株醋酸鈣—鮑曼復(fù)合不動(dòng)桿菌均擴(kuò)增出425 bp不動(dòng)桿菌rA條帶，其中4株未擴(kuò)增出208 bp鮑曼不動(dòng)桿菌ITS條帶，其他各株均擴(kuò)增出該條帶(見圖1)。結(jié)果表明，該4株菌不是鮑曼不動(dòng)桿菌，全自動(dòng)細(xì)菌鑒定儀所鑒定的醋酸鈣—鮑曼復(fù)合不動(dòng)桿菌中有10%菌為其他不動(dòng)桿菌，而非鮑曼不動(dòng)桿菌。

圖1 PCR擴(kuò)增結(jié)果 M：標(biāo)準(zhǔn)DNA分子量標(biāo)記

3 討論

不動(dòng)桿菌屬目前至少包含有33種基因型，其中醋酸鈣不動(dòng)桿菌、鮑曼不動(dòng)桿菌、不動(dòng)桿菌菌屬3型以及不動(dòng)桿菌菌屬13TU的基因型和表型高度的相似性，無法采用常規(guī)方法鑒別。目前臨床感染的不動(dòng)桿菌中，以鮑曼不動(dòng)桿菌的耐藥性增強(qiáng)最為迅速，對(duì)患者的威脅最大[5]。同時(shí)不同種不動(dòng)桿菌的流行病學(xué)仍有較大差異，其耐藥性的獲得機(jī)制也存在差異，因此有必要進(jìn)一步對(duì)臨床檢出的醋酸鈣-鮑曼不動(dòng)桿菌復(fù)合體做進(jìn)一步鑒別，為鮑曼不動(dòng)桿菌耐藥機(jī)制研究提供合格的研究樣本[6]。本研究中建立多重PCR法操作簡便，可以迅速完成對(duì)臨床標(biāo)本的鑒定工作，在鮑曼不動(dòng)桿菌流行病學(xué)研究和醫(yī)院內(nèi)感染研究中具有重要作用。

(作者單位：江蘇大學(xué)附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科)

[1]羅蘭.陸堅(jiān).馬翠萍.聶曉英.廖康.耐亞胺培南鮑曼不動(dòng)桿菌醫(yī)院內(nèi)感染流行的分子機(jī)制研究.中國微生態(tài)學(xué)雜志2004,16(4)：218-220.

[2]芮曉艷.胡杰貴.熊自忠.耐亞胺培南鮑曼不動(dòng)桿菌碳青霉烯酶檢測(cè)及同源性分析.安徽醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)2012,47(2)：154-157.

[3]李永麗.應(yīng)春妹.陳藝升.ERIC-PCR技術(shù)在鮑曼不動(dòng)桿菌基因分型中的應(yīng)用評(píng)估.檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)2013,28(7)：621-624.

[4]陳方圓.馬笑雪.蔡景鈺.王斯.羅恩杰.多重耐藥性金黃色葡萄球菌(MRSA)的臨床藥物治療及耐藥機(jī)制研究.微生物學(xué)雜志2010,30(1)：71-74.

[5]PaganoM,Martins AF, Machado AB, Barin J, Barth AL.Carbapenem-susceptible Acinetobacter baumannii carrying the ISAba1 upstream blaOXA-51-like gene in Porto Alegre, southern Brazil. Epidemiology and infection 2013, 141(2)：330-333.

[6]Ma Z, Zhou L, Wang H, Luo L.Investigation on the genomic diversity of OXA from isolated Acinetobacter baumannii. International journal of clinical and experimental medicine 2015, 8(3)：4429-4432.

陳浩寧(1987～)，男，初級(jí)檢驗(yàn)師，碩士，研究方向?yàn)榕R床檢驗(yàn)診斷學(xué)。