人微血管內(nèi)皮細(xì)胞不同濃度的siRNA轉(zhuǎn)染效果的實(shí)驗(yàn)觀察

●蔡飛 高冬

人微血管內(nèi)皮細(xì)胞不同濃度的siRNA轉(zhuǎn)染效果的實(shí)驗(yàn)觀察

●蔡飛 高冬

目的：觀察不同濃度siRNA對人微血管內(nèi)皮細(xì)胞HMEC-1細(xì)胞轉(zhuǎn)染效果的影響，優(yōu)化HMEC-1細(xì)胞的轉(zhuǎn)染方法和siRNA用量。方法：HMEC-1細(xì)胞采用相同的細(xì)胞量接種處理后，熒光標(biāo)記的siRNA（FAM-siRNA）隨機(jī)分為高中低濃度及對照四個(gè)組，然后運(yùn)用Lipofectamine?2000 Reagent轉(zhuǎn)染試劑進(jìn)行轉(zhuǎn)染，培養(yǎng)48h后熒光顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染的效果。結(jié)果：中高濃度siRNA轉(zhuǎn)染效果較低濃度組好，且中高濃度轉(zhuǎn)染效果相同。結(jié)論：中濃度siRNA更適合HMEC-1細(xì)胞的轉(zhuǎn)染。

siRNA；HMEC-1細(xì)胞；轉(zhuǎn)染

siRNA是一種小RNA分子(約21-25核苷酸)，由RNAase Ⅲ家族中對雙鏈RNA具有特異性的酶加工而成，它能夠激發(fā)與之互補(bǔ)的目標(biāo)mRNA的沉默。轉(zhuǎn)染又是指將外源分子導(dǎo)入真核細(xì)胞的技術(shù)，隨著實(shí)驗(yàn)技術(shù)的發(fā)展RNA干擾技術(shù)已被廣泛的應(yīng)用于基因功能、基因治療、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等方面的研究中[1]。由于不同濃度siRNA對于不同細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效果表現(xiàn)不一致，而很多實(shí)驗(yàn)都是以siRNA參考用量為標(biāo)準(zhǔn)，故為了優(yōu)化實(shí)驗(yàn)方法及siRNA的用量，本實(shí)驗(yàn)通過觀察不同濃度FAM-siRNA對HMEC-1細(xì)胞轉(zhuǎn)染效果的影響，為HMEC-1細(xì)胞的相關(guān)轉(zhuǎn)染提供一個(gè)實(shí)驗(yàn)參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

人微血管內(nèi)皮細(xì)胞（human microvascular endothelial cells，HMEC-1）由本實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)并保存，胎牛血清（美國Gibco公司），MCDB-131細(xì)胞培養(yǎng)基（美國Sigma公司），opti-MEM培養(yǎng)基（美國Gibco公司）倒置熒光顯微鏡（德國Leica公司），Lipofectamine? 2000 Reagent轉(zhuǎn)染試劑（上海吉瑪），F(xiàn)AM標(biāo)記陰性對照siRNA（上海吉瑪）。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)與分組

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

HMEC-1細(xì)胞采用MCDB-131培養(yǎng)液（含10ng/mL EGF、1μg/mL氫化可的松，10%FBS）于5%CO2，37℃常規(guī)培養(yǎng)。

1.2.2 細(xì)胞接種

取對數(shù)生長期的細(xì)胞，胰酶消化收集，制成單細(xì)胞懸液，以3×104個(gè)/孔接種于24孔板上，分為4組每組3個(gè)副孔，37.5℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜。

1.3 細(xì)胞的分組及siRNA轉(zhuǎn)染(以100nm/孔為例)

1.3.1 細(xì)胞分組

將種有細(xì)胞的24孔板分為4組∶高濃度組（100nm）、中濃度組（50nm）、低濃度組（20nm）、對照組（0nm）。

1.3.2 細(xì)胞的轉(zhuǎn)染

次日各孔更換新完全培養(yǎng)基，0.5ml/孔。取FAM標(biāo)記陰性對照siRNA（FAM-siRNA）100nm+opti培養(yǎng)基50ul，吹打均勻，室溫放置5min；取轉(zhuǎn)染試劑（lipo2000）1ul+opti培養(yǎng)基50ul吹打混勻，室溫放置5min；將上述二者混勻后制成轉(zhuǎn)染復(fù)合液，室溫放置20min后，將轉(zhuǎn)染復(fù)合液100ul加入細(xì)胞中，輕搖混勻，37.5℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6h后，更換為MCDB-131 培養(yǎng)液，48h后熒光倒置顯微鏡觀察拍照。

2 結(jié)果

HMEC-1細(xì)胞通過不同濃度FAM-siRNA轉(zhuǎn)染48H后，根據(jù)肉眼觀察圖片的熒光強(qiáng)度及細(xì)胞轉(zhuǎn)染數(shù)表示其轉(zhuǎn)染的效果。如圖1所示高中低濃度與對照組相比都具有明顯的差異，中高濃度與低濃度對比同樣具有顯著差異，而中高濃度相比未見明顯差異。提示中高濃度siRNA轉(zhuǎn)染內(nèi)皮細(xì)胞HMEC-1效果更好。

3 討論

圖1 不同濃度siRNA對HMEC-1轉(zhuǎn)染48h效果

RNA干擾技術(shù)（RNA interference technlolgy）能夠利用雙鏈RNA特異性地降解具有同源序列的mRNA，阻斷相應(yīng)基因的表達(dá)。隨著RNA干擾技術(shù)的不斷發(fā)展，為腫瘤治療問題的解決提供可能[2]。而本實(shí)驗(yàn)為了優(yōu)化轉(zhuǎn)染的方法及siRNA 的用量，通過運(yùn)用不同濃度siRNA對HMEC-1細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染，發(fā)現(xiàn)低濃度siRNA轉(zhuǎn)染后與高中濃度相比較轉(zhuǎn)染細(xì)胞的數(shù)量相差明顯，而中高濃度的siRNA對于HMEC-1細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效果更好，其中中濃度的siRNA在轉(zhuǎn)染細(xì)胞數(shù)量及試劑用量上都較為適合，與眾多實(shí)驗(yàn)的用量一致，這可能是由于高濃度與中濃度轉(zhuǎn)染效果一致，而siRNA的使用量上相差較大，故從節(jié)約試劑考慮，大部分實(shí)驗(yàn)都是采用中濃度siRNA進(jìn)行轉(zhuǎn)染。本實(shí)驗(yàn)對比了高中低濃度siRNA對內(nèi)皮細(xì)胞HMEC-1進(jìn)行轉(zhuǎn)染的效果，優(yōu)化了實(shí)驗(yàn)的方法及siRNA的用量，為內(nèi)皮細(xì)胞相關(guān)siRNA轉(zhuǎn)染提供一定的參考價(jià)值，但是是否適用于所有細(xì)胞還需要進(jìn)一步研究。

（作者單位：福建中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合學(xué)院）

[1]張良鵬，吳小娟，湯紹輝．RNA干擾與肝細(xì)胞癌治療［J］．廣東醫(yī)學(xué),2012,33(6):870-872.

[2]歐陽金生，陳成水，李玉蘋，等.SiRNA CD31沉默PECAM-1對鼠源血管內(nèi)皮瘤細(xì)胞VEGF表達(dá)的影響[J].中國腫瘤生物治療雜志，2014，21（2）：160-164.