缺鐵脅迫柑橘砧木幼苗的光合特性和葉綠體超微結構

姚宇潔，姜存?zhèn)}

（華中農(nóng)業(yè)大學微量元素研究中心/農(nóng)業(yè)部長江中下游耕地保育重點實驗室，武漢 430070）

缺鐵脅迫柑橘砧木幼苗的光合特性和葉綠體超微結構

姚宇潔，姜存?zhèn)}*

（華中農(nóng)業(yè)大學微量元素研究中心/農(nóng)業(yè)部長江中下游耕地保育重點實驗室，武漢 430070）

【目的】通過研究枳殼與枳橙砧木在缺鐵和正常鐵濃度處理下的反應，重點揭示兩種柑橘砧木光合特性、葉綠體超微結構等對鐵敏感性的差異?！痉椒ā恳愿涕俚蔫讱ふ枘竞丸壮日枘緦嵣鐬樵囼灢牧?，設置缺鐵 (–Fe，0 μmol/L) 和正常鐵 (+Fe，37.3 μmol/L) 2個處理進行營養(yǎng)液培養(yǎng)，測定了缺鐵脅迫對兩種砧木苗期鐵元素含量與積累量、光合色素含量、葉片糖含量的影響，并進行了葉綠體超微結構的電鏡掃描。【結果】缺鐵脅迫顯著降低了兩種砧木鐵元素含量與積累量、葉片光合色素含量，且枳橙砧木光合色素含量下降幅度較大。與對照相比，缺鐵后枳殼砧木葉片的糖類物質(zhì)含量降低，且達到顯著差異水平；而枳橙砧木葉片可溶性糖、蔗糖含量顯著升高，淀粉和果糖含量顯著下降。另外，缺鐵脅迫條件下，兩種柑橘砧木片層結構模糊，嗜餓體數(shù)目增加。并且，缺鐵后枳殼砧木葉綠體長度、厚度比對照分別降低了22.1%、26.4%，枳橙砧木則分別下降了55.1%、40.4%?！窘Y論】缺鐵脅迫下，枳橙砧木幼苗的鐵元素含量和積累量、葉片光合色素含量、葉綠體超微結構等均比枳殼砧木受到較大影響，表明枳橙砧木比枳殼砧木對鐵營養(yǎng)缺乏更加敏感。

缺鐵脅迫；柑橘砧木；光合特性；葉綠體超微結構

柑橘一般采用嫁接的方式進行繁殖，其中砧木是果樹的基礎，對接穗的生長、果實大小、產(chǎn)量、品質(zhì)及抗性都有很大影響并直接決定果園的經(jīng)濟效益[1]。在柑橘栽培中長期以枳為主導砧木，但近年研究表明，枳砧具有后期不親和、抗旱性差、不耐瘠薄、易感裂皮病等弱點，制約柑橘產(chǎn)量和品質(zhì)的提升[2]；枳橙為枳與甜橙的雜種，是一種優(yōu)良的擬推廣砧木，具有生長較快、耐寒、抗衰退病等優(yōu)點[3]。

鐵是植物必需的微量元素之一，在植物體的光合作用、呼吸作用、固氮作用等生理代謝過程的電子傳遞或酶促反應中發(fā)揮著重要的作用[4]。鐵雖不是葉綠素的成分，但它是葉綠素合成過程中某些酶或酶輔基的活化劑，影響著葉綠素的形成，從而影響植株的光合作用。葉綠體膜結構和類囊體結構是保證植物光能吸收與轉換的前提，類囊體垛疊緊密，可使膜電荷保持穩(wěn)定，膜成分區(qū)域化，能更有效傳遞光能，使光合系統(tǒng)處于較佳狀態(tài)[5]，前人對多種營養(yǎng)脅迫條件下佛手、茶樹和橘橙的葉綠體超微結構進行了研究，探討了不同營養(yǎng)脅迫對葉綠體發(fā)育影響的差異[6–8]。然而，有關柑橘枳橙砧木和枳殼砧木缺鐵脅迫下葉綠體超微結構變化差異的研究較少。因此，本研究以柑橘枳殼、枳橙砧木苗為材料，采用營養(yǎng)液培養(yǎng)試驗，探討缺鐵脅迫對兩種柑橘砧木苗期生長、光合色素含量及葉綠體超微結構變化等的影響，比較兩種砧木對缺鐵脅迫的敏感性，以期為選取適宜的柑橘砧木提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗設計

試驗于2016年5月1日開始，在華中農(nóng)業(yè)大學資源與環(huán)境學院盆栽場進行，選用江西贛南苗圃基地的枳殼砧木 [Poncirus trifoliate(L.) Raf.]、枳橙砧木 [C.sinensisOsb. ×Poncirus trifoliateRaf.] 實生苗，選取生長狀況良好且長勢較一致的植株，先用自來水將根系附著的泥土沖洗干凈，再用一級水沖洗，然后移栽到盛有3.5 L營養(yǎng)液的黑色聚乙烯塑料桶中進行培養(yǎng)。

營養(yǎng)液按Hoagland and Arnon (1950) 配方，濃度為KNO32 mmol/L、Ca(NO3)21.23 mmol/L、MgSO40.5 mmol/L、Na2HPO40.14 mmol /L、NaH2PO40.32 mmol/L、H3BO310 μmol/L、MnCl24.45 μmol/L、ZnSO40.8 μmol/L、CuSO40.16 μmol/L、Na2MoO40.18 μmol/L、Fe-EDTA 37.3 μmol/L，所用試劑均為分析純。每周更換1次營養(yǎng)液，第1周采用全營養(yǎng)液的1/2量，以后均使用全量營養(yǎng)液。調(diào)節(jié)pH維持在6.0左右，每天上午和下午各通氣2 h，每種砧木設置缺鐵 (–Fe，0 μmol/L) 和正常鐵 (+Fe，37.3 μmol/L) 2個處理，每個處理3次重復。培養(yǎng)過程中要注意病蟲害的發(fā)生，并定期記錄植株生長狀況。

1.2 樣品采集與測定

1.2.1 植株各部位鐵含量 培養(yǎng)3個月后收樣，將植株分為根、莖、葉三部分，樣品先用自來水沖洗干凈，再用一級水沖洗。在105℃的烘箱中殺青30 min后再在75℃下烘干至恒重，將各部位磨碎分別放于干燥器中保存。鐵含量的測定是將樣品干灰化后使用0.1 mol/L的HCl溶液浸提，取濾液稀釋后用原子吸收分光光度法測定[9]。

1.2.2 植株葉片色素含量與糖含量測定 用酒精比色法[10]測定葉片光合色素含量，選取各植株頂端完全展開、成熟的第3～4片葉，稱取0.2 g (鮮葉，去掉中脈)，剪碎，放在50 mL比色管中，加25 mL 95%的酒精，蓋上蓋子，避光 24 h，搖勻后比色 (比色時最好在晚上，燈光暗點，否則葉綠素容易分解)，以95%的酒精為空白，在665 nm、649 nm、470 nm波長比色，并計算葉綠素含量。

總的可溶性糖、蔗糖、果糖以及淀粉的提取為采用80%乙醇在80℃水浴條件下浸提3次，根據(jù)Garcia-Luis[11]的方法進行含量測定，以蒽酮–硫酸溶液為空白對照，分別在620 nm、480 nm、620 nm、620 nm進行比色，并計算含量。

1.2.3 葉綠體超微結構的觀察 取柑橘砧木上部頂端完全展開、成熟的第3片葉葉尖到葉基的中間部位(避開葉脈)，切成1 mm × 2 mm大小的樣塊15～20塊，放入pH 7.2的磷酸緩沖液配置成的5%戊二醛溶液的固定液中，具體試驗步驟參考Lianopoulou等的方法[12]，將取回的樣品在0～4℃下固定24 h，用磷酸緩沖液洗3次，經(jīng)各級酒精脫水，丙酮過渡，最后用環(huán)氧樹脂Epom812包埋。包埋后的材料用LKB型超薄切片機切片，經(jīng)醋酸雙氧鈾和檸檬酸鉛染色后，于JEM-1010型電鏡下觀察、拍照，材料處理和電鏡觀察均在華中農(nóng)業(yè)大學電鏡平臺完成。

1.3 數(shù)據(jù)處理與分析

用Photoshop軟件測量葉綠體的長度 (縱向最遠端兩點之間的距離) 和厚度 (葉綠體橫向中部最厚處的平均值)。

數(shù)據(jù)使用SAS 8.1 (SAS Institute，Cary，NC，USA) 軟件中ANOVA過程對不同處理的各指標進行差異顯著性分析，并用LSD法作多重比較，并使用Microsoft Excel 2010進行圖表制作。

2 結果與分析

2.1 缺鐵脅迫對柑橘不同砧木幼苗生長的影響

圖1顯示，缺鐵后均嚴重影響了柑橘不同砧木生長，首先是新生葉片出現(xiàn)黃化失綠癥 (圖1)，表現(xiàn)為上部葉片脈間失綠，下部老葉仍保持綠色。隨著培養(yǎng)時間的增加，枳橙砧木新生葉片出現(xiàn)嚴重缺鐵的白化癥狀，而枳殼葉片失綠時間較晚且出現(xiàn)白化現(xiàn)象較輕。表明在植株生長方面，枳橙砧木比枳殼砧木受缺鐵脅迫的影響更大。

2.2 缺鐵脅迫對柑橘不同砧木幼苗鐵含量與積累量的影響

從表1看出，缺鐵脅迫枳橙和枳殼砧木幼苗各部位的鐵含量和鐵積累量均與正常供鐵有顯著性差異，缺鐵顯著降低兩者各部位的鐵含量和鐵積累量。與加鐵相比，缺鐵后枳殼砧木根、莖、葉各部位鐵含量分別降低了41.3%、45.5%、39.5%，積累量分別降低了43.3%、31.1%、25.2%；而枳橙砧木根、莖、葉各部位鐵含量分別降低了 67.4%、60.8%、33.0%，積累量分別降低了37.1%、42.4%、28.2%。結果表明，無論是枳橙幼苗還是枳殼幼苗，葉片的鐵含量和鐵積累量下降幅度均最大。另外，缺鐵處理使枳橙砧木根、莖中鐵含量降低幅度大于枳殼相應部位，說明缺鐵脅迫下枳橙砧木比枳殼的鐵吸收能力更弱。

2.3 缺鐵脅迫對枳殼和枳橙砧木葉片光合色素含量的影響

植物葉片是光合作用的主要器官，且在光合反應中吸收光能的主要色素為葉綠素。因此，葉片中葉綠素含量的高低是反映植物葉片光合能力大小的一個重要指標。由圖2可知，正常鐵處理下，枳殼砧木的葉片光合色素含量均低于枳橙砧木，且兩者的葉綠素a達到了顯著差異；缺鐵后枳殼與枳橙的葉片光合色素含量均顯著降低，但兩個品種間差異不明顯。缺鐵條件下，枳殼砧木的葉綠素a、葉綠素b、類胡蘿卜素、總葉綠素含量分別降低了53.8%、45.6%、70.5%、48.3%，而枳橙砧木則分別降低了60.8%、49.0%、63.3%、56.7%，表明枳橙砧木光合色素含量下降幅度較大，說明缺鐵脅迫對枳橙砧木的葉片光合色素的影響大于對枳殼砧木的影響。

圖1 供鐵和不供鐵處理的柑橘砧木生長狀況Fig. 1 Growth of circus stocks under iron supply and iron deficiency

表1 供鐵和不供鐵處理枳殼、枳橙砧木各部位鐵含量與積累量Table 1 Effects of the Fe treatments on the Fe contents and accumulation in different parts of trifoliate and citrange orange

圖2 缺鐵和供鐵處理枳橙砧木和枳殼砧木葉片光合色素含量Fig. 2 Photosynthetic pigment in leaves of citrange and trifoliate orange rootstock seedlings under iron supply and iron deficiency

2.4 缺鐵脅迫對枳殼和枳橙砧木葉片糖類物質(zhì)含量的影響

糖類在植物代謝中占有極重要的地位，它們在植物體內(nèi)的分布不僅反映植物體內(nèi)碳水化合物的運轉情況，而且也是呼吸作用的基質(zhì)和光合作用貯能的重要形式。由表2可看出，在缺鐵脅迫下，枳殼砧木葉片的不同糖類物質(zhì)含量均顯著降低，可溶性糖、蔗糖、果糖與淀粉含量分別降低了35.9%、81.9%、23.3%、37.8%；枳橙砧木葉片可溶性糖、蔗糖含量分別升高了35.9%、69.1%，而果糖與淀粉含量在缺鐵脅迫下分別下降了42.9%、28.8%。

2.5 缺鐵脅迫對枳殼和枳橙砧木葉片葉綠體超微結構的影響

葉綠素分子中不含有鐵元素，但其合成過程中需要鐵，主要表現(xiàn)在葉綠素前體亞鐵原卟啉的合成需要氨基乙酰丙酮酸合成酶和順烏頭酸酶，鐵是這些酶的激活劑，缺鐵使酶活顯著降低，反應不能正常進行，植物缺鐵時，類囊體解體，鐵與葉綠素含量相應降低[13–14]。正常供鐵條件下，葉綠體發(fā)育良好，結構完整，呈梭形，片層結構清晰，而在缺鐵條件下，葉綠體發(fā)育較小，類囊體片層結構變模糊疏松，嗜餓體數(shù)目增加 (圖3)。通過對葉綠體結構的分析可發(fā)現(xiàn)，缺鐵脅迫下，枳殼砧木葉綠體的長度由正常供鐵的5.34 μm降為4.16 μm，降低了22.1%，枳橙砧木葉綠體長度由正常供鐵的6.15 μm降為2.76 μm，降低了55.1%(圖4)；枳殼砧木葉綠體厚度也由正常供鐵的1.74 μm降低到1.28 μm，降低了26.4%，枳橙砧木葉綠體厚度由1.46 μm降低到0.87 μm，降低了40.4%(圖4)。因此，枳橙砧木葉綠體超微結構變化較大，表明枳橙砧木對缺鐵脅迫更加敏感。

表2 缺鐵和供鐵處理枳殼砧木、枳橙砧木葉片的糖含量 (%)Table 2 Carbohydrates contents(%) in leaves of trifoliate orange and citrange rootstocks under iron deficiency and iron supply

3 討論

兩種柑橘砧木在缺鐵處理下，枳橙砧木較枳殼砧木先出現(xiàn)葉片黃化現(xiàn)象，隨缺鐵脅迫時間的增加，葉片黃化程度加深，而枳橙砧木葉片缺鐵表現(xiàn)更嚴重。葉綠素含量是反映作物光合能力的一個重要指標[15]，生長旺盛的新生組織中鐵與葉綠素的含量在缺鐵脅迫下有很好的相關性，缺鐵會降低柑橘砧木葉片葉綠素含量[16]，葉綠素含量的降低[17]可能導致光合作用受到限制。周開兵等[18]通過盆栽試驗研究了四種砧木對兩種柑橘幼樹生長的影響，發(fā)現(xiàn)正常培養(yǎng)下枳橙嫁接苗的光合色素含量高于枳殼嫁接柑橘苗。本試驗中，在正常鐵處理下，枳橙砧木的葉片光合色素含量都高于枳殼砧木。Martínez-Cuenca等[19]研究發(fā)現(xiàn)缺鐵脅迫會顯著降低枳橙砧木的植株生長及光合作用；Pestana等[20]研究枳橙、枳柚和南莊橙三種砧木在缺鐵脅迫下，其生物量、葉綠素含量均顯著降低，其中枳橙對缺鐵耐受性最強。由前人對不同砧木的研究結果可看出枳殼、枳橙砧木耐鐵性較強，本試驗發(fā)現(xiàn)在缺鐵脅迫下，兩種柑橘砧木葉片中的色素含量均顯著降低，但枳橙砧木較枳殼色素含量下降幅度更大。

圖3 缺鐵對枳殼、枳橙砧木葉片葉綠體超微結構 (左) 及類囊體片層結構 (右) 的影響Fig. 3 Effects of the iron deficiency on chloroplast ultrastructure (left) and thylakoid lamella (right) of trifoliate orange and citrange rootstocks

圖4 缺鐵和供鐵處理枳殼砧木、枳橙砧木葉綠體的長度和厚度Fig. 4 Chloroplast length and thickness of trifoliate orange and citrange rootstocks under iron supply and iron deficiency

礦質(zhì)養(yǎng)分的供給水平對植物碳水化合物的代謝影響各異，大多數(shù)礦質(zhì)元素在適量時，能促進糖類物質(zhì)的輸出并促進植株生長。Chen等[21]研究發(fā)現(xiàn)缺鐵脅迫會降低葡萄葉片可溶性糖、淀粉、蔗糖和果糖含量，與Arulanantham等[22]、王雙明等[23]分別在甜菜、小白菜上的研究結果一致，均認為是缺鐵抑制了植物光合作用和碳水化合物的代謝。在本試驗缺鐵脅迫下，枳殼砧木葉片可溶性糖、蔗糖、果糖、淀粉含量均顯著降低，枳橙砧木葉片中的果糖與淀粉含量顯著下降，而可溶性糖、蔗糖含量增加。淀粉是植物中最重要的儲存性多糖，它的降低可能是由于光合作用受到缺鐵脅迫的抑制。光合作用產(chǎn)物的運輸形式主要是蔗糖，枳橙砧木葉片中蔗糖的增加可能是由于光合產(chǎn)物運輸受阻，造成一定的積累，而蔗糖的利用降解減弱可能會造成果糖含量的降低。結果表明，兩種柑橘砧木在不同碳水化合物合成與轉運過程中有一定差異，但還需對碳水化合物代謝進行更深入的研究。

葉綠體是葉片進行光合作用的場所，葉綠體形態(tài)與結構異常直接影響其光合作用，進而影響其生長及生理指標的變化。前人在水稻[24]和擬南芥[25]研究中發(fā)現(xiàn)，葉綠體變小或數(shù)目減少會抑制光合速率；葉綠體結構的破壞[26]會限制光合速率。Bernal等[27]研究發(fā)現(xiàn)，鐵、鋅脅迫對大豆葉綠體結構的影響程度較大；謝深喜等[28]研究發(fā)現(xiàn)，隨水分脅迫強度的增加，枳殼、枳橙葉綠體逐漸發(fā)生形狀變化、雙層膜損壞、結構解體、基粒片層結構被破壞等現(xiàn)象；劉磊超等[29]研究發(fā)現(xiàn)，缺硼脅迫下枳橙砧木葉片細胞器變形解體，細胞形態(tài)也發(fā)生了改變，細胞內(nèi)的多種細胞器消失；肖家欣等[30]研究發(fā)現(xiàn)，缺鐵脅迫下枳殼砧木葉片細胞葉綠體及線粒體均出現(xiàn)明顯的解體，葉綠體膜及類囊體片層模糊，質(zhì)體小球明顯增多，無淀粉粒。本研究通過對枳殼與枳橙兩種砧木葉片的顯微結構分析，發(fā)現(xiàn)在缺鐵脅迫下兩種砧木的葉綠體變小，嗜餓體數(shù)目增加，類囊體片層結構變模糊疏松。并且，枳橙砧木葉綠體結構受到抑制的程度比枳殼砧木較為嚴重，其葉綠體長度與厚度降低程度更大，嗜餓小體數(shù)目明顯增加且已占據(jù)葉綠體內(nèi)大部分空間。

4 結論

缺鐵脅迫下，柑橘砧木各部位的鐵含量和積累量顯著降低，枳殼和枳橙柑橘砧木新生葉片均出現(xiàn)失綠黃化現(xiàn)象，且枳橙砧木葉片缺素癥狀更嚴重；與對照相比，兩種砧木光合色素含量均降低，而枳橙砧木光合色素含量下降幅度較大，說明缺鐵對枳橙砧木葉片光合色素的破壞程度大于枳殼砧木。缺鐵后，枳殼砧木葉片可溶性糖、蔗糖、果糖與淀粉含量顯著降低，枳橙砧木果糖、淀粉含量也顯著減少，而可溶性糖與蔗糖在葉片中積累造成含量上升。另外，兩種砧木葉綠體長度、厚度在缺鐵脅迫時顯著下降，葉綠體發(fā)育變小，嗜餓體數(shù)目增加，類囊體片層結構變模糊疏松，但缺鐵對枳橙砧木的葉綠體超微結構的抑制程度要高于枳殼砧木。

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Photosynthetic characteristics and chloroplast ultrastructure of citrus rootstocks under iron deficiency stress

YAO Yu-jie, JIANG Cun-cang*
(Microelement Research Center, Huazhong Agricultural University/Key Laboratory of Arable Land Conservation of Ministry of Agriculture, Wuhan 430070, China)

【Objectives】Response of photosynthetic characteristics and chloroplast ultrastructure of different Fe sensitivity citrus rootstocks to different iron (Fe) treatments was studied.【Methods】A hydroponic experiment was carried out with –Fe (0 μmol/L) and +Fe (37.3 μmol/L), and citrange and trifoliate orange rootstocks were selected as research materials. The contents of Fe, photosynthetic pigment and carbohydrates and chloroplast ultrastructure of samples were analyzed.【Results】The results showed that Fe deficiency significantly decreased the contents and accumulation of Fe, photosynthetic pigment contents in both rootstocks, and the photosynthetic pigment content in citrange rootstock was decreased in a larger extent. The iron deficiency significantly decreased carbohydrates contents in leaves of trifoliate orange, and the contents of total soluble sugar and glucose in leaves of citrange were significantly increased under Fe-deficiency, however, the contents of fructose and starch in leaves of citrange were significantly decreased with no Fe supply. Lamellae structure in chloroplast became fuzzy, and the numbers of plastoglobulus were increased without the Fe application.Compared with the Fe-sufficiency treatment，the chloroplast length and the chloroplast thickness of trifoliate were decreased by 22.1% and 26.4%, and those of the citrange orange were decreased by 55.1% and 40.4%.【Conclusions】The content and accumulation of iron, the content of photosynthetic pigment and the ultrastructure of chloroplast of citrange rootstocks were more sensitive to Fe deficiency.

iron deficiency; citrus rootstock; photosynthetic characteristics; ultrastructure of chloroplast

2017–01–20 接受日期：2017–03–28

國家自然科學基金項目（41271320）；公益性行業(yè)（農(nóng)業(yè)）科研專項（201303095）資助。

姚宇潔（1992—），女，河北邢臺人，碩士研究生，主要從事植物養(yǎng)分利用及機理研究。E-mail：yaoyujie@webmail.hzau.edu.cn。 *通信作者 E-mail：jcc2000@mail.hzau.edu.cn