木蝴蝶揮發(fā)性成分對H22荷瘤小鼠實體瘤抑制作用及其機制初步研究

李楠楠，孟憲生, 2, 3，包永睿, 2, 3，王 帥, 2, 3，李天驕, 2, 3

(1. 遼寧中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院；2. 遼寧省組分中藥工程技術(shù)研究中心；3. 遼寧省現(xiàn)代中藥研究工程實驗室，遼寧 大連 116600)

木蝴蝶揮發(fā)性成分對H22荷瘤小鼠實體瘤抑制作用及其機制初步研究

李楠楠1，孟憲生1, 2, 3，包永睿1, 2, 3，王 帥1, 2, 3，李天驕1, 2, 3

(1. 遼寧中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院；2. 遼寧省組分中藥工程技術(shù)研究中心；3. 遼寧省現(xiàn)代中藥研究工程實驗室，遼寧 大連 116600)

目的探討木蝴蝶揮發(fā)性成分抗肝腫瘤作用及其可能的作用機制。方法本研究采用H22實體瘤模型，隨機分為空白組、模型組、陽性對照組(環(huán)磷酰胺100 mg·kg-1)、木蝴蝶揮發(fā)性成分低、中、高劑量(17.5、35、70 mg·kg-1)組，灌胃給藥12 d，計算腫瘤抑制率、胸腺及脾指數(shù)及血清中IL-2、IL-6的含量。HE染色法觀察小鼠實體瘤生長情況。采用0～1.0 g·L-1的木蝴蝶揮發(fā)性成分處理人肝癌SMMC-7721細胞，分別采用MTT法檢測其對細胞增殖的影響，TUNEL法檢測其對肝癌細胞凋亡的影響，RT-PCR法檢測其對Bax、Bcl-2、caspase-3 mRNA表達的影響。結(jié)果木蝴蝶揮發(fā)性成分高劑量的抑瘤率為42.08%；與模型組相比，木蝴蝶揮發(fā)性成分能明顯提高小鼠的胸腺指數(shù)、IL-2及IL-6水平。木蝴蝶揮發(fā)性成分體外能明顯抑制人肝癌細胞SMMC-7721的增殖，誘導(dǎo)細胞凋亡，減少Bcl-2 mRNA的表達，增加Bax、caspase-3 mRNA的表達。結(jié)論木蝴蝶揮發(fā)性成分具有明顯的體內(nèi)、體外抗肝腫瘤作用，其作用機制可能與增強機體免疫力、促進腫瘤細胞凋亡有關(guān)。

孟憲生(1964-)，男，博士，教授，博士生導(dǎo)師，研究方向：中藥組分配伍、代謝組學(xué)及藥品質(zhì)量分析，通訊作者，E-mail：mxsvvv@163.com

木蝴蝶揮發(fā)性成分；抗肝腫瘤；H22荷瘤小鼠；SMMC-7721；凋亡；作用機制

木蝴蝶為紫蔵科植物木蝴蝶Oroxylumindcum(L.)Vent.的干燥成熟種子，具有清肺利咽、疏肝和胃的功效[1]。木蝴蝶主要含有黃酮及其苷類、揮發(fā)油等化學(xué)成分[2-3]，具有抗氧化[4-5]、抗腫瘤[6]等多種藥理作用。對于木蝴蝶中黃酮類成分及其藥理作用的研究較多，但是對木蝴蝶揮發(fā)性成分及其藥理作用的研究很少。本實驗前期研究發(fā)現(xiàn)，木蝴蝶揮發(fā)性成分也具有明顯的抗腫瘤活性，說明木蝴蝶揮發(fā)性成分也是木蝴蝶發(fā)揮抗腫瘤作用的藥效組分之一。為了明確木蝴蝶發(fā)揮抗腫瘤作用的物質(zhì)基礎(chǔ)，以及對該藥材更好地開發(fā)和應(yīng)用，本研究采用H22小鼠實體瘤模型和人肝癌SMMC-7721細胞模型來驗證木蝴蝶揮發(fā)性成分的體內(nèi)、體外藥效，采用ELISA、TUNEL、RT-PCR等方法研究其抗腫瘤的作用機制，為木蝴蝶做為抗腫瘤藥物的進一步研究和臨床應(yīng)用提供實驗依據(jù)和理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1細胞與實驗動物人肝癌SMMC-7721細胞株，由中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細胞庫提供。小鼠肝癌H22瘤株，購自上海拜力生物有限公司。SPF級昆明種小鼠，♂，體質(zhì)量(20±2)g，購于遼寧長生生物技術(shù)有限公司，合格證號為：SCXK(遼)2010-0001。

1.2藥品、試劑與儀器木蝴蝶揮發(fā)性成分：采用超臨界流體萃取法和一級分離的方法，取木蝴蝶藥材100 g(粉碎)，操作壓力28 MPa，操作溫度4℃，分離壓力5 MPa，分離溫度50℃，流量25 Hz，提取時間2 h。環(huán)磷酰胺(江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司，批號：140620)；小鼠白細胞介素-2(IL-2)酶聯(lián)免疫檢測試劑盒(上海朗頓生物科技有限公司，批號：20150406CR)；小鼠白細胞介素-6(IL-6)酶聯(lián)免疫檢測試劑盒(上海朗頓生物科技有限公司，批號：20151017GH)；DMEM培養(yǎng)基、胰蛋白酶、胎牛血清、雙抗(美國Gibco公司)；二甲基亞砜(DMSO)(Sigma公司)；TUNEL試劑盒(全式金生物，北京)。SUNRISE酶標儀(瑞士TECAN公司)。

1.3細胞培養(yǎng)人肝癌SMMC-7721細胞使用含有10% FBS和1%青鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基，H22小鼠腫瘤細胞株使用含有10% FBS和1%青鏈霉素的RPMI 1640培養(yǎng)基，置于37℃、5% CO2、95%相對飽和濕度的培養(yǎng)箱內(nèi)進行常規(guī)培養(yǎng)及傳代，取對數(shù)生長期的細胞進行后續(xù)實驗。

1.4H22荷瘤小鼠動物模型的建立及給藥取對數(shù)生長期狀態(tài)良好的H22細胞懸液，用生理鹽水調(diào)整細胞密度，腹腔注射到小鼠體內(nèi)，在小鼠體內(nèi)傳4代用于建立荷瘤小鼠實體瘤模型[7]。取第4代腹水制成細胞懸液(腹水需為乳白色液體)，臺盼藍拒染法檢測細胞活性，存活率≥95%。將腹水接種于小鼠右腋下，隨機分模型組、木蝴蝶揮發(fā)性成分低、中、高劑量組(按17.5、35、70 mg·kg-1生藥材)、陽性藥組(環(huán)磷酰胺 100 mg·kg-1)。空白組給予等體積的生理鹽水，每日1次，每次0.2 mL，連續(xù)灌胃12 d，最后一次給藥2 h后，撤掉墊料，禁食不禁水，稱取各組小鼠體重，次日處死小鼠，解剖取瘤、脾、胸腺，稱重量，計算各組抑瘤率、脾指數(shù)和胸腺指數(shù)。抑瘤率/%=(1-給藥組平均瘤重/模型組平均瘤重)×100%；脾指數(shù)=小鼠脾重量/小鼠體重×100；胸腺指數(shù)=小鼠胸腺重量/小鼠體重×100。

1.5HE染色法評價木蝴蝶揮發(fā)性成分對H22荷瘤小鼠實體瘤抑瘤率的影響實體瘤瘤組織以10%福爾馬林溶液固定，脫水、透明、浸蠟、包埋、切片和貼片，HE染色和封片，光鏡觀察瘤組織結(jié)構(gòu)改變、腫瘤細胞密度、細胞凋亡及壞死程度。

1.6ELISA法檢測H22荷瘤小鼠血清中IL-2、IL-6的含量按照試劑盒操作說明書，酶標儀450 nm下測定每組的吸光度，建立標準曲線，根據(jù)標準曲線計算各組IL-2、IL-6的含量。

1.7MTT法檢測木蝴蝶揮發(fā)性成分對肝癌細胞增殖的影響將對數(shù)生長期的人肝癌SMMC-7721細胞接種于96 孔板中，每孔0.5×103～1×104個細胞，待細胞貼壁后密度約大于80%后，按0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 g·L-1濃度加入木蝴蝶揮發(fā)性成分，以含 0.1% DMSO完全培養(yǎng)基為對照組。每組濃度設(shè)5個復(fù)孔，給藥24、48、72 h后，換新鮮培養(yǎng)基，并加入MTT試劑,繼續(xù)培養(yǎng)4 h后，加入DMSO，搖床15 min后，酶標儀492 nm處檢測吸光度 (OD)值。按照公式計算木蝴蝶揮發(fā)性成分對肝癌細胞的抑制率。細胞的抑制率/%=(1-OD給藥組/OD空白組)×100%。

1.8TUNEL法檢測木蝴蝶揮發(fā)性成分對肝癌細胞凋亡的影響將處于對數(shù)生長期的人肝癌SMMC-7721細胞接種在6孔板中，貼壁后，加入使用完全培養(yǎng)基配制的1 g·L-1濃度的木蝴蝶揮發(fā)性成分，對照組加完全培養(yǎng)基，藥物作用24 h 后，按照TUNEL試劑盒操作說明書操作，0.2%的TritonX-100透化5 min后PBS沖洗，加PE后37℃孵育1 h后PBS沖洗，加DAPI避光染色5 min，置熒光顯微鏡下觀察，并計算細胞凋亡率。

1.9木蝴蝶揮發(fā)性成分對Bax、Bcl-2、caspase-3mRNA表達的影響將處于對數(shù)生長期的人肝癌SMMC-7721細胞接種在6孔板中，貼壁后加入使用完全培養(yǎng)基配制的1 g·L-1的木蝴蝶揮發(fā)性成分，對照組加完全培養(yǎng)基，藥物作用48 h 后消化收集細胞，TRIzol法提取總RNA。應(yīng)用TransScript First-Strand cDNA Synthesis SuperMix反轉(zhuǎn)錄試劑盒(北京全式金生物)，按照試劑盒說明書操作，將總RNA逆轉(zhuǎn)錄成第一鏈cDNA，反應(yīng)體系20 μL。反應(yīng)條件如下：25℃孵育10 min，42℃孵育30 min(反轉(zhuǎn)錄反應(yīng))，85℃加熱5 min(反轉(zhuǎn)錄酶失活)。以β-actin為內(nèi)參基因，應(yīng)用2×EasyTaq PCR SuperMix試劑盒進行PCR反應(yīng)擴增目的基因，反應(yīng)體系20 μL。引物序列如下：β-actin：F 5′-TGCTGTCCCTGTATGCCTCT-3′，R 5′-TTTGATGTCACGCACGATTT-3′；Bax：F 5′-TCATGGGCTGGACATTGGAC-3′，R 5′-GAGACAGGGACATCAGTCGC-3′；Bcl-2：F 5′-GTGAAGTCAACATGCCTGCC-3′，R 5′-ACAGCCTGCACTTTGTTTC-3′；caspase-3：F 5′-CCTGGTTCATCCAGTCGCTT-3′，R 5′-TCTGTTGCCACCTTTCGGTT-3′。

2 結(jié)果

2.1木蝴蝶揮發(fā)性成分對H22荷瘤小鼠實體瘤抑瘤率的影響由Tab 1體內(nèi)藥效實驗可知，與模型組比較，木蝴蝶揮發(fā)性成分高、中劑量組、陽性對照

Fig 1 HE staining for solid tumor in H22 tumor-bearing mice(×100)

A：Model; B：Positive; C：Volatile components 70 mg·kg-1; D：Volatile components 35 mg·kg-1; E：Volatile components 17.5 mg·kg-1

組H22荷瘤小鼠實體瘤體積均明顯減小，且差異具有顯著性(P<0.01，P<0.05)，抑瘤率分別為42.08%、25.39%、60.00%。木蝴蝶揮發(fā)性成分低劑量組H22荷瘤小鼠實體瘤瘤重與模型組比較差異無顯著性。

Tab 1 Inhibitory effect of volatile components in Oroxyli Semenonon tumor weight in tumor-bearing mice(±s, n=10)

*P<0.05,**P<0.01vsmodel

2.2木蝴蝶揮發(fā)性成分對H22荷瘤小鼠脾臟、胸腺指數(shù)的影響與模型組相比，木蝴蝶揮發(fā)性成分高、中劑量能明顯提高小鼠的胸腺指數(shù)，差異具有顯著性(P<0.01，P<0.05)，木蝴蝶揮發(fā)性低劑量組、陽性對照組與模型組相比，差異無顯著性。與空白組相比，木蝴蝶揮發(fā)性高劑量組差異無顯著性。與模型組比較，木蝴蝶揮發(fā)性成分高、中、低劑量組的脾指數(shù)差異均無顯著性，陽性對照組能明顯降低小鼠的脾指數(shù)(P<0.01)。見Tab 2。

Tab 2 Effect of volatile components on thymus index andspleen index in H22 tumor-bearing mice (±s, n=10)

*P<0.05,**P<0.01vsmodel

2.3HE染色法評價木蝴蝶揮發(fā)性成分對H22荷瘤小鼠實體瘤的影響如Fig 1所示，模型組腫瘤細胞排列緊密，細胞密度大，未見大片壞死及凋亡細胞。其他組腫瘤細胞增殖密度均有不同程度的減小，而且可見不同程度的壞死及凋亡細胞區(qū)域，其細胞質(zhì)高度凝集固縮，有類圓形凋亡小體出現(xiàn)。

2.4木蝴蝶揮發(fā)性成分對H22荷瘤小鼠血清IL-2、IL-6水平的影響如Tab 3所示，與空白組比較，模型組小鼠血清中IL-2、IL-6水平明顯降低，且差異具有顯著性(P<0.01)。與模型組比較，木蝴蝶揮發(fā)性成分高、中、低劑量組小鼠血清中IL-2、IL-6水平明顯升高，且差異均具有顯著性，陽性對照組小鼠血清中IL-2、IL-6水平未見明顯升高。

Tab 3 Effect of volatile components on IL-2, IL-6 levelsin H22 tumor-bearing mice(±s, n=10)

*P<0.05,**P<0.01vsmodel

2.5木蝴蝶揮發(fā)性成分對肝癌細胞增殖的影響在給藥時間相同時，隨著藥物濃度的增大，木蝴蝶揮發(fā)性成分對細胞的增殖抑制作用也增加；在給藥濃度相同時，隨著藥物作用時間的延長，抑制作用更為明顯，當濃度為1 g·L-1時，48 h細胞的抑制率為80.73%(Fig 2)。

2.6木蝴蝶揮發(fā)性成分對肝癌細胞凋亡的影響如Fig 3所示，與模型組比較，木蝴蝶揮發(fā)性成分、陽性對照組均能誘導(dǎo)細胞凋亡，且差異均具有顯著性(P<0.01)，24 h凋亡率分別為18.16%、18.67%。木蝴蝶揮發(fā)性成分組與陽性對照組之間凋亡率差異無顯著性。

2.7木蝴蝶揮發(fā)性成分對Bax、Bcl-2、caspase-3mRNA表達的影響如Fig 4所示，與模型組比較，木蝴蝶揮發(fā)性成分、陽性對照組均能增加Bax、caspase-3 mRNA的表達，降低Bcl-2 mRNA 的表達，且差異具有顯著性(P<0.01，P<0.05)。

Fig 2 Inhibitory effect of volatile components onhuman hepatoma cell line SMMC-7721

Fig 3 Apoptosis-inducing effect of volatile componentson human hepatoma cell line SMMC-7721

A：Model; B：Volatile components; C：Positive; D：Apoptosis rate.**P<0.01vsmodel group

3 討論

肝癌是全世界最常見的惡性腫瘤之一，我國的肝癌發(fā)病率和死亡率均占腫瘤中的第2位[8]。惡性腫瘤具有發(fā)病率高、治愈率低、致死率高等特點，對人類的生命健康構(gòu)成嚴重威脅[9]。目前，臨床針對惡性腫瘤主要應(yīng)用順鉑、環(huán)磷酰胺等化療藥物，雖然有很明顯的抑制腫瘤作用，但是也存在著對機體毒副作用大、耐藥性等缺點。近年來，中醫(yī)藥在治療惡性腫瘤方面不斷的研究和探索，發(fā)現(xiàn)很多傳統(tǒng)中藥具有價格低廉、毒副作用小等特點，中藥與化療藥物聯(lián)合應(yīng)用時不僅提高化療藥物療效，而且提高腫瘤患者的生存質(zhì)量，在惡性腫瘤治療方面有廣闊的應(yīng)用前景。

Fig 4 Expression of Bax, Bcl-2, caspase-3 mRNAin human hepatoma cell line SMMC-7721

*P<0.05,**P<0.01vsmodel group

木蝴蝶具有抗炎、抗氧化等藥理作用[10]。近年研究發(fā)現(xiàn)，木蝴蝶對腫瘤細胞如人乳腺癌MCF-7細胞、結(jié)腸癌細胞HCT-8等具有明顯的抑制作用，且顯示出有效、低毒的優(yōu)點。為了研究木蝴蝶中揮發(fā)性成分的藥理作用，本研究采用H22小鼠實體瘤的體內(nèi)模型和人肝癌SMMC-7721細胞體外模型，研究其抗肝腫瘤作用。結(jié)果顯示，木蝴蝶揮發(fā)性成分的抑瘤率大于30%，細胞抑制率大于60%，綜合小鼠的精神活動、臟器指數(shù)等指標，說明木蝴蝶揮發(fā)性成分具有較好的體內(nèi)、體外抗肝腫瘤活性，是木蝴蝶發(fā)揮抗腫瘤作用的藥效組分之一，具有進一步研究的價值。

腫瘤的發(fā)生、發(fā)展與機體的免疫功能失調(diào)密切相關(guān)[11]。胸腺和脾臟是機體重要的免疫器官，惡性腫瘤發(fā)生時，機體免疫器官會發(fā)生明顯的變化。其中，會出現(xiàn)脾臟腫大、胸腺萎縮現(xiàn)象，而且其程度與腫瘤發(fā)展病程相關(guān)[12]。IL-2和IL-6是機體免疫功能調(diào)節(jié)的重要細胞因子,能促進T細胞的增殖和活化，刺激NK細胞增殖，增強免疫細胞對腫瘤細胞的殺傷力。本研究結(jié)果表明，木蝴蝶揮發(fā)性成分可以提高荷瘤小鼠的胸腺指數(shù)、提高荷瘤小鼠血清中IL-2、IL-6水平，說明木蝴蝶揮發(fā)性成分可以有效增強荷瘤小鼠脾臟和胸腺的免疫功能，提高機體免疫力，從而發(fā)揮抗肝腫瘤的作用。

近年研究表明，Bcl-2、Bax、caspase-3是與腫瘤細胞凋亡明確相關(guān)的基因，在細胞凋亡的調(diào)控中扮演著重要角色[13]?？沟蛲龌駼cl-2和促凋亡基因Bax是調(diào)控細胞凋亡的Bcl-2基因家族的重要成員，與促凋亡因子caspase-3的活化程度相關(guān)[14]。本研究結(jié)果表明，木蝴蝶揮發(fā)性成分可以增加肝癌SMMC-7721細胞中Bax、caspase-3 mRNA的表達，降低Bcl-2 mRNA 的表達，說明木蝴蝶揮發(fā)性成分可以調(diào)控凋亡相關(guān)基因的表達，促進腫瘤細胞凋亡。

綜上所述，木蝴蝶揮發(fā)性成分具有明顯的體內(nèi)、體外抗肝腫瘤活性，其作用機制可能與其增強機體免疫力、促進腫瘤細胞凋亡有關(guān)。本研究明確木蝴蝶發(fā)揮藥效的物質(zhì)基礎(chǔ)，為木蝴蝶的進一步開發(fā)和臨床應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)，為木蝴蝶揮發(fā)性成分作為新的抗肝腫瘤藥物的開發(fā)奠定基礎(chǔ)。

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EffectsofvolatilecomponentsinOroxyliSemenonH22bearingmiceanditspossiblemechanisms

LI Nan-nan1, MENG Xian-sheng1,2,3, BAO Yong-rui1,2,3, WANG Shuai1,2,3, LI Tian-jiao1,2,3

(1.SchoolofPharmacy,LiaoningUniversityofTraditionalChineseMedicine; 2.ComponentMedicineEngineeringResearchCenterofLiaoningProvince; 3.LiaoningProvinceModernChineseMedicineResearchEngineeringLaboratory,Dalian116600,China)

AimTo study the inhibitory effect of volatile components in Oroxyli Semen on liver cancer and its possible mechanisms.MethodsH22bearing mouse model was used, the mice were divided into six groups: blank, model, positive (cytoxan, 100 mg·kg-1), low-, mid-, and high-dose (17.5, 35, and 70 mg·kg-1) volatile components groups, and then the mice were ig given once daily for consecutive 12 d. Then the tumor growth inhibitory rate, spleen and thymus indexes were calculated; the serum levels of IL-2, IL-6 were determined. HE staining was used to study of the apoptosis of the solid tumor. After treatment of SMMC-7721 cells with 0～1 g·L-1of volatile components for 24, 48 and 72 h, MTT assay was used to examine the proliferation. TUNEL method was applied to detect cell apoptosis, and RT-PCR method to detect Bax, Bcl-2, caspase-3 mRNA experssion.ResultsThe inhibitory rate of volatile components high-dose on H22bearing mice was 42.08%. The thymus index and the contents of serum IL-2 and IL-6 of H22bearing mice were significantly higher than those in model group. Volatile components could significantly inhibit proliferation and induce apoptosis of SMMC-7721 cells, down-regulate the expression of Bcl-2 mRNA, and up-regulate the expression of Bax, caspase-3 mRNA.ConclusionsThe volatile components in Oroxyli Semen have obvious anti-tumor activityinvitroandinvivo, and its mechanism may be related to enhancing immune system and promoting tumor cell apoptosis.

volatile components in Oroxyli Semen; anti-tumor; H22bearing mice; SMMC-7721; apoptosis; mechanism

A

1001-1978(2017)11-1600-06

R-332；R284.1；R329.25；R392.12；R735.702.2；R979.1

時間：2017-10-10 10:05 網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://kns.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20171010.1005.048.html

10.3969/j.issn.1001-1978.2017.11.024

2017-07-15,

2017-08-20

國家科技部“重大新藥創(chuàng)制”科技重大專項(No 20132X09507005-004)

李楠楠(1991-)，女，博士生，研究方向：中藥藥效組分與作用機制，E-mail：linannan-999@163.com；