苦豆子總黃酮對乙肝病毒復(fù)制的影響

＊.新疆維吾爾自治區(qū)昌吉州人民醫(yī)院，新疆 昌吉 800；.新疆維吾爾自治區(qū)藥物研究所，新疆 烏魯木齊 80004；.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和學(xué)院醫(yī)藥生物技術(shù)研究所，北京 00050

苦豆子總黃酮對乙肝病毒復(fù)制的影響

趙義勇1楊巧麗2李壯3劉燕2黃華2＊
1.新疆維吾爾自治區(qū)昌吉州人民醫(yī)院，新疆 昌吉 831100；2.新疆維吾爾自治區(qū)藥物研究所，新疆 烏魯木齊 830004；3.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和學(xué)院醫(yī)藥生物技術(shù)研究所，北京 100050

目的觀察苦豆子總黃酮提取物(KDH)在體內(nèi)、外對乙肝病毒復(fù)制的影響。方法采用乙型肝炎病毒HBV轉(zhuǎn)染人肝癌細胞HepG2的2.2.15細胞系，檢測KDH對乙肝病毒DNA(HBV-DNA)復(fù)制及表面抗原(HBsAg)、e抗原(HBeAg)分泌的影響；采用鴨乙肝病毒DHBV感染的雛鴨模型觀察KDH對鴨乙型肝炎的治療作用。結(jié)果KDH (125-500)μg/mL濃度在2.2.15細胞培養(yǎng)中對HBV-DNA的復(fù)制有明顯的抑制作用，其500μg/mL濃度對HBsAg、HBeAg的分泌有一定的抑制作用；其25mg/kg劑量口服可持續(xù)降低鴨乙肝模型血清中DHBV-DNA水平。結(jié)論KDH可有效干預(yù)乙肝病毒的復(fù)制。

苦豆子；總黃酮；乙肝病毒；

乙型肝炎是世界性的性流行病，我國是高地方性流行區(qū)，在全球3.5億HBV感染者中，中國人占三分之一。在乙肝患者漫長的治療中，應(yīng)用抗乙肝藥物控制和緩解病情，對延長生存期和改善生活質(zhì)量起著至關(guān)重要的作用。臨床經(jīng)驗表明，長期治療和多方位的藥效是使病情獲得持續(xù)緩解的有效途徑。我國傳統(tǒng)的中醫(yī)中藥在治療乙型肝炎的應(yīng)用中有其獨到之處，一些經(jīng)典復(fù)方，如茵陳蒿湯、小柴胡湯等，在臨床常用于急、慢性肝炎的對癥治療，在緩解癥狀、改善病情方面起到了積極的作用[1]。一般認為，中藥主要是通過調(diào)節(jié)機體的免疫功能而發(fā)揮間接的抗病毒作用，但近年來的研究表明，中藥不僅能通過調(diào)節(jié)免疫功能幫助機體清除病毒，還可能直接抑制病毒復(fù)制。據(jù)報道，許多單味藥材的提取物，如葉下珠、黃芪、扯根菜、臺灣細葉油柑等藥材的提取物，可有效抑制乙肝病毒的復(fù)制[2-5]。此外，一些民間驗方有直接抑制乙肝病毒的作用，如復(fù)方六月雪、愈肝膠囊等[6-7]。在當今抗乙肝藥物的研究中，傳統(tǒng)中藥的優(yōu)勢受到越來越多的關(guān)注，從中藥寶庫中尋找天然抗病毒活性部位或活性成分，已成為發(fā)掘新藥的重要途徑之一。

苦豆子(SophoraalopecuroidesL.)為豆科槐屬多年生草本植物，廣泛分布于我國西北地區(qū)，是維吾爾醫(yī)的傳統(tǒng)用藥，主要以地上部分或種子入藥。研究報道，苦豆子中含有豐富的化學(xué)成分，其中主要的兩大類為生物堿類和黃酮類[8-9]，以往對其生物堿類成分研究較多[10]，并發(fā)現(xiàn)了一些有效成分[11-13]，而對其黃酮類成分的研究較少，尤其是對黃酮類成分生物活性的研究還未見報道。本課題采用大孔樹脂和聚酰胺樹脂聯(lián)用的方法[14]對新疆地產(chǎn)苦豆子藥材中的黃酮類成分進行分離純化，得到苦豆子總黃酮提取物(KDH)，并進行體內(nèi)、外抗乙肝病毒活性的初步研究，現(xiàn)將結(jié)果報告如下。

1 儀器與材料

1.1 樣品 KDH(出膏率2.5%)由新疆維吾爾自治區(qū)藥物研究所提供，制備方法：取苦豆子種子粗粉，加8倍量的70%乙醇提取3次，每次1h，合并提取液，提取液過濾、放冷、離心，上清液減壓濃縮至無醇味，并用蒸餾水定容至溶液濃度為0.4g(生藥)/mL，取上述濃縮液調(diào)pH值為7，上大孔樹脂-聚酰胺混合柱，柱徑高比為1∶7，用4 BV水洗脫去除水溶性雜質(zhì)，再用5 BV 50%乙醇洗脫，收集乙醇洗脫液，減壓濃縮，50℃烘干。拉米夫定原料藥(3TC，批號NDS0061105，北京諾德恒信化工技術(shù)有限公司)，4℃保存。

1.2 細胞及動物 乙型肝炎病毒(HBV)DNA克隆轉(zhuǎn)染人肝癌細胞(Hep G2)的2.2.15細胞由中國醫(yī)科院生物技術(shù)研究所病毒室提供。用含胎牛血清10%，3%谷氨酰胺1%，G418 380μg/mL，卡那霉素50U/mL的Eagle’s MEM培養(yǎng)液，在37℃ 5% CO2溫箱中培養(yǎng)，大約每周傳代1次。鴨乙型肝炎病毒DNA(DHBV-DNA)強陽性血清，采自上海麻鴨，-70℃保存；1日齡北京鴨，購自北京前進種鴨場。

1.3 儀器 LIOHTCYCLER2.0型PCR全自動熒光定量系統(tǒng)(美國通用羅氏公司)；TGL-16M高速臺式冷凍離心機(長沙湘儀離心機儀器有限公司)；HH-CP-01型二氧化碳培養(yǎng)葙(上海?，攲嶒炘O(shè)備有限公司)；BHC-1300ⅡA/B3生物安全柜(蘇凈集團安泰公司)；MDF-382E低溫冰箱(SANYO Electric)；BIO-RAO 3550型酶標儀、γ-計數(shù)儀(美國DPC公司)；

1.4 試劑 MEM培養(yǎng)基(GiBco，Invitrogen Corporation)；胰酶(北京三博遠志生物技術(shù)有限公司)；小牛血清、HEPES(中國醫(yī)科院生物醫(yī)學(xué)工程研究所)；乙肝病毒核酸定量檢測試劑盒cPCR-熒光探針(中山大學(xué)達安基因股份有限公司)；HBsAg、HBeAg固相放射免疫測定盒(中國同位素公司北方免疫試劑研究所)；放射性同位素α-32PdCTP(亞輝生物醫(yī)學(xué)工程公司，比活度：111 TBq/nmol)；探針標記用隨機引物試劑盒(Promerga公司)；缺口翻譯試劑盒(Promega Co.)；Sephadex G-50、Ficoll PVP(Pharmacia公司)；SDS(Merck公司)；魚精DNA、牛血清白蛋白(中國科學(xué)院生物物理所)；0.45μm硝酸纖維素膜(Amersham公司)。

2 方法與結(jié)果[15]

2.1 熒光定量PCR法檢測 對HBV-DNA表達的抑制作用 KDH用含DMSO的營養(yǎng)液配成4000μg/mL的原液，4℃保存，臨用時以2.2.15細胞培養(yǎng)液稀釋成所需濃度。取2.2.15細胞接種96孔培養(yǎng)板，待細胞長成單層時，取原液以培養(yǎng)液作2倍稀釋，取(2000～250)μg/mL四個濃度加樣，每濃度4孔，于37℃ 5% CO2條件培養(yǎng)，第4天各組換相應(yīng)濃度的藥液，同時設(shè)細胞對照。第8天顯微鏡下觀察細胞病變情況，完全破壞為4；75%為3；50%為2；25%為1；無病變?yōu)?。觀察計算最大無毒濃度(TC0)和半數(shù)有毒濃度(TC50)。該部分研究重復(fù)了2批實驗，2批實驗結(jié)果表明KDH在2.2.15細胞培養(yǎng)內(nèi)的毒性：TC50和TC0分別為1000μg/mL和500μg/mL。

2.2.15細胞(約50萬個/mL)接種96孔板培養(yǎng)板，每孔100(L，37℃ 5% CO2條件下培養(yǎng)48h左右加藥，KDH TC0及以下的兩個2倍稀釋度，每濃度3孔，設(shè)細胞對照組，于37℃、5% CO2條件培養(yǎng)，第3天換1次藥液，繼續(xù)培養(yǎng)，加藥第6d收取細胞，用試劑盒提取DNA，實時熒光定量PCR檢測HBV- DNA表達量(拷貝/mL)，計算樣品對HBV-DNA的抑制率，結(jié)果苦豆子提取物(125-500)μg/mL濃度在2.2.15細胞中可明顯降低HBV-DNA表達量。結(jié)果見表1。

表1 KDH對HBV-DNA表達量的影響

2.2 斑點雜交法檢測對HBV DNA復(fù)制的抑制作用 2.2.15細胞接種96孔細胞培養(yǎng)板(約10 萬個/mL)，每孔200μL，37℃、5% CO2條件培養(yǎng)，觀察細胞長成單層后，KDH取無毒濃度及其以下的4個2倍稀釋度，共5個濃度組，每濃度3孔, 同時設(shè)細胞對照組。加樣后于37℃，5% CO2條件培養(yǎng)，第3天換原濃度樣品溶液繼續(xù)培養(yǎng)，于第6d取各樣品組及細胞對照組的上清液和細胞，按分子克隆實驗技術(shù)方法提取其HBV-DNA，進行斑點雜交、放射自顯影，測量各雜交點的A值后，計算抑制率，并按Reed&Muench法計算半數(shù)抑制濃度(IC50)，結(jié)果表明苦豆子提取物在2.2.15細胞中對HBV-DNA的復(fù)制有明顯的抑制作用。結(jié)果見表2。

HBV DNA抑制百分率(%)=(細胞對照組A值-給藥組A值)/細胞對照組A值×100。

表2 KDH對HBV-DNA的抑制作用

2.3 對2.2.15細胞分泌HBeAg、HBsAg的抑制作用 每毫升10萬個2.2.15細胞接種96孔細胞培養(yǎng)板, 每孔200μL，37℃ 5% CO2培養(yǎng)24h，樣品取最大無毒濃度及以下4個2倍稀釋度，共5個濃度，每濃度4孔，37℃ 5% CO2條件下培養(yǎng)，每4天換原濃度藥液培養(yǎng)，第8天時收獲培養(yǎng)液，-20℃冰凍保存。

實驗設(shè)HBsAg、HBeAg 陽性和陰性對照及細胞對照。用 HBsAg和HBeAg固相放射免疫試劑盒按說明書方法測定HBsAg和HBeAg, 用γ-計數(shù)儀測定每孔放射強度值，3個平行孔取均值后，計算抑制率。按Reed&Muench法計算半數(shù)有效濃度(IC50)。

抗原抑制百分率(%)=(細胞對照組放射強度值-給藥組放射強度值)/細胞對照組放射強度值×100。

結(jié)果，苦豆子總黃酮提取物最大無毒濃度對在2.2.15細胞中分泌HBsAg和HBeAg有一定的抑制作用。結(jié)果見表3、4。

表3 KDH在2.2.15細胞中第8d對HBsAg的抑制作用

表4 KDH在2.2.15細胞中第8天對HBeAg的抑制作用

2.4 對鴨乙肝模型的治療效應(yīng) 取1日齡北京鴨，自鴨腿脛靜脈注射上海麻鴨DHBV-DNA陽性鴨血清，0.2 mL/只，感染7d后隨機分組進行藥物治療實驗，每組6只，苦豆子提取物組以25 mg/kg劑量口服給藥，病毒對照(DHBV)組給予等體積的生理鹽水，陽性對照組給予50 mg/kg的3TC，每天給藥2次，連續(xù)10d，分別于DHBV感染后第7天即用藥前(T0)，用藥第5天(T5)，用藥第10天(T10)和停藥后第3天(P3)，自鴨腿脛靜脈取血，分離血清，-70℃保存待檢。取上述待檢鴨血清，同時點膜，測定鴨血清中DHBV-DNA水平的動態(tài)。按缺口翻譯試劑盒說明書方法，用32P標記DHBV-DNA探針，作鴨血清斑點雜交，放射自顯影膜片斑點在酶標儀(490nm)測定吸光度A，以A值作為標本DHBV-DNA水平值，計算每組動物不同時間(T5、T10)和停藥后第3天(P3)血清DHBV-DNA的抑制率，比較各組鴨血清DHBV-DNA的抑制率的動態(tài)。

DNA抑制率=(給藥前(T0)A值-給藥后(T5，T10，P3)A值)/給藥前(T0)A值×100%

結(jié)果，3組動物在實驗期體重水平無統(tǒng)計學(xué)差異。結(jié)果如圖1所示。KDH在給藥期及停藥后3d對DHBV-DNA有持續(xù)的抑制作用，且停藥3d后抑制率下降不明顯，而3TC在停藥后抑制率明顯下降，提示KHD的抑制作用比較穩(wěn)定。結(jié)果如圖2所示。

3 討論

2.2.15細胞模型和鴨乙肝模型是目前抗乙肝病毒藥物篩選和評價的主要手段，隨著這兩種模型在中藥抗HBV研究中的應(yīng)用，許多傳統(tǒng)中藥的提取部位或化學(xué)成分被證實有抗HBV活性，為從天然產(chǎn)物中尋找抗病毒藥物提供了有效途徑。在藥用植物成分中，研究報道較多的主要有黃酮類、糖苷類和生物堿類[16-17]。

由于苦豆子中的生物堿類含量很高，在過去幾十年，對苦豆子的研究開發(fā)一直集中于其生物堿類成分，其黃酮類成分的生物活性則從未引起關(guān)注。隨著對中草藥抗病毒物質(zhì)基礎(chǔ)的認識不斷深入，黃酮類成分在該領(lǐng)域的重要性得到公認，并且已發(fā)現(xiàn)許多植物黃酮類成分具有廣譜抗病毒活性[18]。由此推測，苦豆子中的黃酮類成分有可能是潛在的抗病毒活性物質(zhì)。

研究對苦豆子總黃酮提取物展開體內(nèi)、外抗病毒作用的研究，旨在為進一步探明苦豆子黃酮類單體成分的抗HBV活性奠定基礎(chǔ)。研究顯示苦豆子總黃酮在細胞培養(yǎng)中明顯抑制HBV-DNA的表達，并呈現(xiàn)一定的量效關(guān)系，其IC50值約為269.2μg/mL，表明其體外抗病毒活性較強。體內(nèi)實驗中苦豆子總黃酮在給藥期可明顯降低鴨血清中DHBV-DNA水平，其抑制作用雖不及陽性對照藥拉米夫定，但可平穩(wěn)持續(xù)至停藥后第3天；而拉米夫定對病毒的抑制率在給藥期間較高，停藥后則大幅下降，提示苦豆子總黃酮對鴨乙肝的治療效應(yīng)比西藥更為穩(wěn)定。上述研究結(jié)果初步印證了課題組的預(yù)期，苦豆子中的黃酮類成分也是其重要的抗病毒物質(zhì)基礎(chǔ)。目前從苦豆子中分離得到的黃酮類化合物已有5種[19]，這些黃酮類成分的抗HBV活性及作用機理還有待進一步研究。

在2.2.15細胞培養(yǎng)中，熒光定量PCR和斑點雜交法檢測均表明苦豆子總黃酮(125～500)μg/mL濃度明顯抑制HBV-DNA的表達；放射免疫法測定其500μg/mL濃度對HBsAg、HBeAg的分泌也有一定的抑制作用；在鴨乙肝模型治療實驗中，苦豆子總黃酮提取物以25mg/kg劑量口服可持續(xù)降低模型動物血清中DHBV-DNA水平。該結(jié)果提示苦豆子總黃酮提取物在體內(nèi)、外均可有效干預(yù)乙肝病毒的復(fù)制。

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TheInhibitoryEffectoftheTotalFlavonoidsErtractsfromSophoraalopecuroidesL.onReplicaionofHepatitisBVirus

ZHAO Yiyong1YANG Qiaoli2LI Zhuang3LIU Yan2HUANG Hua2*

1.The Hospital of Changji Hui Autonomous Prefecture，Changji 831100，China；2.The XinJiang Institute of Materia Medic, Urumqi 830004，China；3.Institute of Medicinal Biothechnology Chinese Academy of Medical Sciences，Beijing 100050，China

ObjectiveTo observe the effect of KDH on the replicaion of hepatitis B virus.MethodsHBV-transfected HepG 2.2.15 cells as the vitro model, The antiviraI activity of KDH was examined by detecting the levels of HBsAg and HBeAg in the supernatant and extracellular HBV-DNA. Andinvivomodel, BeiJing brown spotted ducks infected with the DHBV-DNA were randomly divided into three groups: model group, positive group, KDH group. Blood was collected respectively to determine the content of DHBV-DNA, before and at the fifth, tenth day during treatment, and at the third day after finishing the treatment.ResultsKDH at the concentration of(125～500)μg/mL showed an inhibitory effect on HBV-DNA, The KDH 500μg·mL-1dose suppressed HBsAg and HBeAg expressions. And, The KDH 25mg/kg dose of oral sustainably reduced DHBV-DNA levels in the serum of duck hepatitis B virus model.ConclusionThe study suggested that KDH has a strong effect against HBV replication.

SophoraalopecuroidesL.; Total Flavonoid; Hepatitis B Virus

R285

A

1007-8517(2017)17-0021-04

2017-07-07 編輯：陶希睿)

趙義勇(1967-)，男，漢族，本科，研究方向為臨床藥學(xué)。E-mail:zhaoyiyong@sina.cn

黃華(1965-)，女，漢族，碩士研究生，研究員，研究方向為中藥藥理學(xué)研究。E-mail:huangh6505@163.com