沉默細(xì)胞周期檢測點(diǎn)激酶l基因?qū)θ税螂装┘?xì)胞增殖和凋亡的影響

姜明哲，李國忠

(天津市第五中心醫(yī)院，天津300450)

沉默細(xì)胞周期檢測點(diǎn)激酶l基因?qū)θ税螂装┘?xì)胞增殖和凋亡的影響

姜明哲，李國忠*

(天津市第五中心醫(yī)院，天津300450)

目的探討沉默細(xì)胞周期檢測點(diǎn)激酶l(Chk1)基因?qū)θ税螂装┘?xì)胞增殖和凋亡的影響。方法培養(yǎng)人膀胱癌T24細(xì)胞，根據(jù)轉(zhuǎn)染物的不同，將細(xì)胞分為siRNA-Chk1組、siRNA-對照序列組和空白對照組，利用實(shí)時熒光定量PCR檢測各組細(xì)胞中Chk1基因表達(dá)，MTT法檢測各組細(xì)胞增殖能力，利用流式細(xì)胞術(shù)檢測各組細(xì)胞凋亡，利用流式細(xì)胞術(shù)檢測各組細(xì)胞周期，利用Western blot法檢測各組細(xì)胞中Chk1、Cdc25C和Cyclin B1蛋白表達(dá)。結(jié)果與空白對照組和siRNA-對照序列組比較，siRNA-Chk1組細(xì)胞中Chk1 mRNA相對表達(dá)量降低(F=43.813，P=0.000)；與空白對照組和siRNA-對照序列組比較，siRNA-Chk1組細(xì)胞24 h、48 h、72 h和96 h時吸光度A值均降低(P<0.05)；與空白對照組和siRNA-對照序列組比較，siRNA-Chk1組細(xì)胞凋亡率顯著增加(F=90.736，P=0.000)；流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果顯示，siRNA-Chk1組G0/G1期和S期高于siRNA-對照序列組和空白對照組，而G2/M期低于siRNA-對照序列組和空白對照組(P<0.05)；與空白對照組和siRNA-對照序列組比較，siRNA-Chk1組細(xì)胞中Chk1、Cdc25C和Cyclin B1蛋白相對表達(dá)量均降低(P<0.05)。結(jié)論特異性沉默Chk1基因可抑制人膀胱癌T24細(xì)胞增殖，加速細(xì)胞凋亡，其機(jī)制可能與抑制Chk1/Cdc25C/CyclinB1通路而減少細(xì)胞G2/M期阻滯有關(guān)。

膀胱癌；細(xì)胞周期檢測點(diǎn)激酶l；細(xì)胞增殖；細(xì)胞凋亡

細(xì)胞周期檢測點(diǎn)激酶1(checkpoint kinase 1，Chk1)作為高度保守的一種絲氨酸/蘇氨酸激酶，在維持正常的細(xì)胞周期及基因組穩(wěn)定、調(diào)控細(xì)胞凋亡中具有重要作用[1]，有研究指出[2]，Chk1在多種惡性腫瘤中表達(dá)上調(diào)，與腫瘤發(fā)生及進(jìn)展過程密切相關(guān)。本研究擬利用小干擾RNA(siRNA)技術(shù)特異性沉默人膀胱癌T24細(xì)胞中Chk1基因，從分子細(xì)胞學(xué)角度探討其對細(xì)胞增殖和凋亡的影響，以期為膀胱癌機(jī)制研究提供基礎(chǔ)資料。

1 資料與方法

1.1主要試劑和設(shè)備

人膀胱癌T24細(xì)胞購自中科院上海生物細(xì)胞研究所，RPMI-1640培養(yǎng)液、胎牛血清購自美國Gibco公司，0.25%胰蛋白酶、磷酸鹽緩沖液(PBS)購自武漢博士德生物公司，Trizol總RNA提取試劑盒、Lipfectamine 2000脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑盒購自美國Intrivigen公司，逆轉(zhuǎn)錄和PCR試劑盒購自日本TaKaRa公司，siRNA-Chk1和siRNA-對照序列均由上海吉瑪制藥技術(shù)公司設(shè)計合成，Chk1及內(nèi)參引物均由上海生工生物公司設(shè)計合成，四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)細(xì)胞增殖檢測試劑盒購自碧云天生物技術(shù)公司，Annexin V-FITC細(xì)胞凋亡檢測試劑盒購自廣州威佳科技有限公司，碘化丙啶(PI)染液購自美國Sigma公司，細(xì)胞周期檢測試劑盒購自上海研謹(jǐn)生物科技有限公司，兔抗Chk1多克隆抗體購自美國Santa Cruz公司，兔抗Chk1介導(dǎo)的細(xì)胞分裂周期蛋白25C(Cdc25C)多克隆抗體購自美國Abzoom公司，兔抗人周期素B1(Cyclin B1)抗體購自上海萬疆生物技術(shù)公司，實(shí)時熒光定量PCR儀購自美國ABI公司，凝膠電泳成像分析系統(tǒng)購自美國Bio-rad公司。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)和分組處理 取人膀胱癌T24細(xì)胞，置于含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液中，于含5% CO2的37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。取對數(shù)生長期細(xì)胞，接種于6孔板中，繼續(xù)培養(yǎng)，待細(xì)胞融合度達(dá)80%左右時，利用Lipfectamine 2000脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑盒對細(xì)胞進(jìn)展轉(zhuǎn)染，根據(jù)轉(zhuǎn)染物的不同，對細(xì)胞進(jìn)行分組：①siRNA-Chk1組：轉(zhuǎn)染Chk1基因的干擾序列：正義鏈：5’-CCGGCTGCAAATAGTAGTTCCTGA ACTCGAGTTCAGGAACTACTATTTGCAGTTTTTG-3’，反義鏈：5’-AATTCAAAAACTGCAAATAGTAGTTCCTGAACT-CGAGTTCAGGAACTACTATTT-GCAG-3’；②siRNA-對照序列組：轉(zhuǎn)染Chk1基因的對照序列：正義鏈：5’-GATCCCCGTTCTCCGAACGTGTCACGTTTCAAG-3’，反義鏈：5’-AGAACGTGACACGTTCGGAGAATTTTTTGG-AAA-3’；③空白對照組：不作任何處理。轉(zhuǎn)染后繼續(xù)在含5% CO2的37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，完成后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.2利用實(shí)時熒光定量PCR檢測各組細(xì)胞中Chk1基因表達(dá) 取各組轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)48 h細(xì)胞，利用細(xì)胞裂解液裂解后，用總RNA提取試劑盒獲得細(xì)胞中總RNA，利用紫外分光光度計檢測總RNA純度，以A260/A280≥1.80作為合格樣品完成后續(xù)實(shí)驗(yàn)。將總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，以cDNA為模板進(jìn)行PCR。引物序列：Chk1引物：上游：5’-ATGCTCGCTGGAGAATTGC-3’，下游：5’-ATAAGGAAAGACCTGTGCGG-3’；GAPDH引物：5’-ACGGATTTGGTCGTATTGGG-3’，下游：5’-TGATTTTGGAGGGATGTCGC-3’。PCR反應(yīng)條件：94℃ 1 min，92℃ 30 s，56℃ 30 s，74℃ 30 s，連續(xù)進(jìn)行38次循環(huán)，每個樣品均設(shè)置6個平行反應(yīng)復(fù)孔。用2-△△Ct法對各組細(xì)胞中Chk1基因相對表達(dá)量進(jìn)行分析。

1.2.3MTT法檢測各組細(xì)胞增殖能力 取各組細(xì)胞，胰酶消化，加入到96孔板中，調(diào)整細(xì)胞密度為2×105個/孔，繼續(xù)于含5% CO2的37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。分別于培養(yǎng)12 h、24 h、48 h、72 h和96 h時，向各孔加入MTT液20 μl，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，棄去上清，加入二甲基亞砜液150 μl，利用酶標(biāo)儀于490 nm波長處檢測各孔吸光度A值，重復(fù)檢測6次，取均值。

1.2.4利用流式細(xì)胞術(shù)檢測各組細(xì)胞凋亡 取各組轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)48 h細(xì)胞，胰酶消化，采用2 000×g離心力離心5 min，收集1×106個細(xì)胞，冷PBS沖洗3次，用1×結(jié)合緩沖液500 μl重新懸浮細(xì)胞，分別將Annexin V-FITC 5 μl和PI液5 μl加入各管，室溫下避光孵育15 min，于60 min內(nèi)上機(jī)檢測，計數(shù)凋亡細(xì)胞比例，各組重復(fù)檢測6次，取均值。

1.2.5利用流式細(xì)胞術(shù)檢測各組細(xì)胞周期 取各組轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)48 h細(xì)胞，胰酶消化，采用2 000×g離心力離心5 min，收集1×106個細(xì)胞，用PBS緩沖液沖洗3次，于4℃下用70%無水乙醇過夜固定。離心后棄去上清，加入PBS靜置20 min，離心后棄去上清，將核糖核酸酶5 μl加入，37℃靜置60 min，將50 μl的PI加入，室溫下避光染色25 min，利用流式細(xì)胞儀對細(xì)胞周期進(jìn)行檢測。

1.2.6利用Western blot法檢測各組細(xì)胞中Chk1、Cdc25C和Cyclin B1蛋白表達(dá) 取各組轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)48 h細(xì)胞，利用細(xì)胞裂解液裂解后，提取總蛋白，用BCA法檢測蛋白純度并定量。取50 μg總蛋白，進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，電轉(zhuǎn)移至PVDF膜，用5%脫脂奶粉進(jìn)行封閉120 min，加入一抗兔抗Chk1多克隆抗體、兔抗Cdc25C多克隆抗體和兔抗人Cyclin B1抗體(稀釋比例：1∶1 200、1∶800、1∶1 000)，4℃條件下過夜孵育，用TBST漂洗3次，將二抗加入，室溫下孵育60 min，用TBST漂洗3次，加入化學(xué)發(fā)光試劑盒進(jìn)行避光顯色，拍照。用Image J圖像分析軟件對條帶進(jìn)行分析，獲得各組細(xì)胞中Chk1、Cdc25C和Cyclin B1蛋白相對表達(dá)量。

1.3統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1各組細(xì)胞中Chk1基因表達(dá)

siRNA-Chk1組、siRNA-對照序列組和空白對照組細(xì)胞中Chk1 mRNA相對表達(dá)量分別為(1.22±0.20)、(2.10±0.13)和(2.14±0.23)，與空白對照組和siRNA-對照序列組比較，siRNA-Chk1組細(xì)胞中Chk1 mRNA相對表達(dá)量降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=43.813，P=0.000)。

2.2各組細(xì)胞增殖能力比較

MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與空白對照組和siRNA-對照序列組比較，siRNA-Chk1組細(xì)胞24 h、48 h、72 h和96 h時吸光度A值均降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見圖1。

2.3各組細(xì)胞凋亡率比較

siRNA-Chk1組、siRNA-對照序列組和空白對照組細(xì)胞凋亡率分別為(15.2±2.5)%、(2.8±1.8)%和(2.5±0.9)%，與空白對照組和siRNA-對照序列組比較，siRNA-Chk1組細(xì)胞凋亡率顯著增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=90.736，P=0.000)，見圖2。

圖1 不同時點(diǎn)各組細(xì)胞增殖能力比較

圖2 流式細(xì)胞術(shù)檢測各組細(xì)胞凋亡情況(A：siRNA-Chk1組、siRNA-對照序列組和空白對照組)

2.4各組細(xì)胞周期比較

流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果顯示，siRNA-Chk1組G0/G1期和S期高于siRNA-對照序列組和空白對照組，而G2/M期低于siRNA-對照序列組和空白對照組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見表1。

表1 各組細(xì)胞周期比例比較

注：與空白對照組比較，aP<0.05；與siRNA-對照序列組比較，bP<0.05

2.5各組細(xì)胞中Chk1、Cdc25C和CyclinB1蛋白表達(dá)比較

與空白對照組和siRNA-對照序列組比較，siRNA-Chk1組細(xì)胞中Chk1、Cdc25C和Cyclin B1蛋白相對表達(dá)量均降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見表2和圖3。

表2 各組細(xì)胞中Chk1、Cdc25C和Cyclin B1蛋白表達(dá)比較

注：與空白對照組比較，aP<0.05；與siRNA-對照序列組比較，bP<0.05

圖3 各組細(xì)胞中Chk1、Cdc25C和Cyclin B1蛋白表達(dá)

3 討論

膀胱癌作為預(yù)后較差的泌尿系統(tǒng)腫瘤，病因和發(fā)病機(jī)制較為復(fù)雜，有研究指出[3]，膀胱癌細(xì)胞較強(qiáng)的增殖能力是導(dǎo)致患者轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)的重要因素。Chk1位于人類11q24染色體，由13個外顯子組成，作為細(xì)胞周期檢測點(diǎn)中的主要蛋白，在調(diào)節(jié)細(xì)胞周期中發(fā)揮重要作用，是DNA損傷修復(fù)及保證基因完整性的關(guān)鍵基因[4]。正常生理狀態(tài)下，Chk1可將細(xì)胞阻滯在G2/M期檢測點(diǎn)，進(jìn)行包括周期阻滯、錯配修復(fù)、周期恢復(fù)等一系列的級聯(lián)反應(yīng)，使細(xì)胞基因完整及周期保持穩(wěn)定[5]。而細(xì)胞增殖及凋亡平衡打破，本應(yīng)停止增殖或發(fā)生凋亡的細(xì)胞仍進(jìn)入細(xì)胞周期無限制增殖是導(dǎo)致腫瘤發(fā)生的根本原因[6]。研究表明[7]，Chk1低表達(dá)于正常細(xì)胞，但卻高表達(dá)于多種惡性腫瘤組織中，參與了惡性腫瘤發(fā)生及進(jìn)展過程。本研究利用siRNA技術(shù)特異性沉默人膀胱癌T24細(xì)胞中Chk1基因，熒光定量PCR和Western blot檢測結(jié)果均顯示，siRNA-Chk1組細(xì)胞中Chk1基因和蛋白相對表達(dá)量均降低，提示人膀胱癌T24細(xì)胞中Chk1基因被成功沉默。

MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與空白對照組和siRNA-對照序列組比較，siRNA-Chk1組細(xì)胞24 h、48 h、72 h和96 h時吸光度A值均降低，提示siRNA-Chk1組細(xì)胞增殖能力降低，說明特異性沉默Chk1基因可有效降低人膀胱癌T24細(xì)胞增殖能力。本研究顯示，與空白對照組和siRNA-對照序列組比較，siRNA-Chk1組細(xì)胞凋亡率顯著增加，說明特異性沉默Chk1基因可有效增加人膀胱癌T24細(xì)胞凋亡水平，進(jìn)一步對細(xì)胞周期進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，siRNA-Chk1組G0/G1期和S期高于siRNA-對照序列組和空白對照組，而G2/M期低于siRNA-對照序列組和空白對照組，說明特異性沉默Chk1基因可減弱人膀胱癌T24細(xì)胞G2/M期阻滯，使G2/M期細(xì)胞比例降低，有研究指出[8]，Chk1基因高表達(dá)可使腫瘤細(xì)胞停留在G2/M期，從而有利于細(xì)胞的自我修復(fù)，加速細(xì)胞增殖。而特異性沉默Chk1基因可阻滯這一過程。研究表明[9]，Chk1/Cdc25C/CyclinB1是調(diào)控細(xì)胞G2/M期阻滯的主要通路。有研究指出[10]，MMEQ可上調(diào)Chk1及Cdc25c基因表達(dá)，從而誘導(dǎo)膀胱癌TSGH8301細(xì)胞阻滯在G2/M期。本研究結(jié)果顯示，與空白對照組和siRNA-對照序列組比較，siRNA-Chk1組細(xì)胞中Chk1、Cdc25C和Cyclin B1蛋白相對表達(dá)量均降低，說明特異性沉默Chk1基因可能通過抑制Chk1/Cdc25C/CyclinB1通路而減少人膀胱癌T24細(xì)胞G2/M期阻滯。

綜上所述，特異性沉默Chk1基因可抑制人膀胱癌T24細(xì)胞增殖，加速細(xì)胞凋亡，其機(jī)制可能與抑制Chk1/Cdc25C/CyclinB1通路而減少細(xì)胞G2/M期阻滯有關(guān)。

[1]Smits VA,Gillespie DA.DNA damage control:regulation and functions of checkpoint kinase 1[J].FEBS J,2015,282(19):3681.

[2]張 瑤.細(xì)胞周期監(jiān)測點(diǎn)激酶1與DNA損傷應(yīng)答信號通路在腫瘤中的研究進(jìn)展[J].腫瘤研究與臨床,2016,28(4):279.

[3]王杰燚,陳紅微,田小柯,等.miRNA和膀胱癌發(fā)生發(fā)展的研究進(jìn)展[J].中國老年學(xué)雜志,2017,37(5):1257.

[4]馮少勇,張雁鋼,張 利,等.細(xì)胞周期點(diǎn)激酶l/2的研究進(jìn)展[J].中華臨床醫(yī)師雜志(電子版),2015,9(10):136.

[5]鄭林峰,倪型灝.細(xì)胞周期檢測點(diǎn)激酶1研究進(jìn)展[J].浙江實(shí)用醫(yī)學(xué),2016, 21(1):76.

[6]Peng G,Liao Y,Shen C.miRNA-429 inhibits astrocytoma proliferation and invasion by targeting BMI1[J].Pathol Oncol Res,2017,23(2):369.

[7]Goto H,Kasahara K,Inagaki M.Novel insights into Chk1 regulation by phosphorylation[J].Cell Struct Funct,2015,40(1):43.

[8]Peng ZG,Yao YB,Yang J,et al.Mangiferin induces cell cycle arrest at G2/M phase through ATR-Chk1 pathway in HL-60 leukemia cells[J].Genet Mol Res,2015,14(2):4989.

[9]吉曉霞,曾 穎,何 潔,等.DADS通過Chk1/Cdc25C/CyclinB1/CDK1通路誘導(dǎo)白血病HL-60細(xì)胞G2/M期阻滯[J].中國藥理學(xué)通報,2015,31(2):221.

[10]Hsu SC,Yu CC,Yang JS,et al.A novel synthetic 2-(3-methoxyphenyl)-6,7-methylenedioxoquinolin-4-one arrests the G2/M phase arrest via Cdc25c and induces apoptosis through caspase- and mitochondria-dependent pathways in TSGH8301 human bladder cancer cells[J].Int J Oncol,2012,40(3):731.

R737.14

A

2016-11-19)

*通訊作者

1007-4287(2017)10-1834-04