抗腫瘤藥物紫杉醇對腺樣囊性癌細(xì)胞侵襲力以及明膠酶水平的影響

●徐磊 舒曉宏

抗腫瘤藥物紫杉醇對腺樣囊性癌細(xì)胞侵襲力以及明膠酶水平的影響

●徐磊1舒曉宏2

目的：通過對不同濃度的紫杉醇使用分析，對進(jìn)行含有紫杉醇抗腫瘤藥物對腺樣囊性癌細(xì)胞侵襲力以及明膠酶水平的影響。方法：使用Bristol-Myers Squibb公司生產(chǎn)的紫杉醇，使用0.01mg/L、0.06mg/L以及0.1mg/L的不同濃度紫杉醇，對人ACC-M細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)。研究紫杉醇對腺樣囊性癌細(xì)胞侵襲力以及明膠酶水平的影響。結(jié)果：未受紫杉醇處理的對照組細(xì)胞，粘附率達(dá)99.5%，而在不同程度下的紫杉醇實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞粘附率都有所下降，其結(jié)果分別為86.2%、72.8%和59.5%，所產(chǎn)生結(jié)果與紫杉醇的濃度比例成正比關(guān)系。結(jié)論：通過實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明，紫杉醇的濃度對ACC-M黏附性以及明膠酶活性等都有明顯的抑制作用。

腺樣囊性癌；紫杉醇；明膠酶

調(diào)查顯示腺樣囊性癌是一種侵襲力強(qiáng)，易發(fā)生轉(zhuǎn)移的口腔和面部惡性腫瘤，經(jīng)過多方查找與研究試驗(yàn)表明，紫杉醇對癌細(xì)胞有控制治療作用，是當(dāng)下一種高效抗癌藥物[1]。

1 資料與方法

1.1 一般資料

由Bristol-Myers Squibb公司生產(chǎn)的紫杉醇；大連醫(yī)科大學(xué)中心實(shí)驗(yàn)室提供的人高轉(zhuǎn)移腺樣囊性癌細(xì)胞株（ACC-M）；廣州鼎國生物有限公司提供的侵襲小室（boyden 小室）；廣州基因公司提供的細(xì)胞外基質(zhì)凝膠(ECM)，MILLIPORE公司的聚碳酸酯膜Isopore，日本SANYO的BB5060/BB16 二氧化碳培養(yǎng)箱，瀘南科學(xué)儀器聯(lián)營廠的BFX5-320 型低速離心機(jī)，上述實(shí)驗(yàn)用藥都符合醫(yī)學(xué)規(guī)定。

1.2 方法

1.2.1 紫杉醇處理后ACC-M黏附性的檢測

利用96孔培養(yǎng)板分別注入ECM,干燥封閉，輕洗3次。加入不同濃度的紫杉醇的ACC-M細(xì)胞懸浮液100ul,培養(yǎng)2h后進(jìn)行3次輕洗，洗去未黏附成功的細(xì)胞，然后100ul0.4g/L的MTT孵育4h，加入200ul的DMSO再對每個(gè)孔A450mmOD檢測，通過細(xì)胞黏附率結(jié)果，可以對不同濃度下的紫杉醇和無紫杉醇的黏附率形成對比組。

1.2.2 紫杉醇處理下ACC-M侵襲力

在改良的boyden上下小室間涂上含有5ug/10ulfibronectin的聚碳酸酯膜，并ECM用4℃的RPMI1640稀釋，分兩次涂在膜的表面，每10min給5ug/10ul,下室加入含有10%FCS的RPMI1640，上室加入300ul 5?105ml的ACC-M細(xì)胞懸液，進(jìn)行培養(yǎng)2h，當(dāng)細(xì)胞貼壁后換含有不同濃度紫杉醇培育10h，再用棉簽擦拭上室的ECM細(xì)胞，取出微孔膜、固定、染色，隨機(jī)選取五個(gè)視野，采集數(shù)據(jù)，取平均值，重復(fù)三次，最后對不同濃度下紫杉醇侵襲數(shù)量、遷移數(shù)量和不含紫杉醇的細(xì)胞組進(jìn)行對照。

1.2.3 明膠酶活性測定

在6孔每個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)板中，加入ECM30.0ug/60ul,進(jìn)行干燥與紫外線消毒，進(jìn)行24h培養(yǎng)前再加入5.0?105/mlACC-M細(xì)胞的懸浮液1.5ml。然后在不同濃度的紫杉醇培養(yǎng)液培養(yǎng)24h，再將1.5ml無血清RPPMI1640培養(yǎng)72h，取其細(xì)胞上清液。利用“空斑法”對上清培養(yǎng)液的明膠酶活性進(jìn)行測定，將通過Gelatin Type溶解濃度為4mg/ml的Tris-Cl緩沖液，瓊脂糖與Tris-Cl溶解配成2%的溶液，兩種溶液各取3ml鋪在培養(yǎng)皿中，凝固，打孔，分別注入不同濃度的紫杉醇的培養(yǎng)液上清液，置于培養(yǎng)箱內(nèi)72h，之后用1%的鹽水沖洗，0.1%的考馬斯量藍(lán)R250溶液染色20min，脫色，測量空周圍空斑的直徑，以代表明膠酶活性，此實(shí)驗(yàn)重復(fù)五次，對數(shù)據(jù)記錄。

1.3 療效判定

顯效：臨床實(shí)驗(yàn)表明，紫杉醇對乳腺癌和卵巢癌已起到明顯控制作用；有效：針對腺樣囊性癌癥，紫杉醇對其侵襲力起到轉(zhuǎn)移效果，但未起到根治作用；總有效率=顯效+有效/總比例?100%。實(shí)驗(yàn)顯示，不同濃度的紫杉醇對腺樣囊性癌細(xì)胞，產(chǎn)生的結(jié)果也各有不同，其產(chǎn)生的結(jié)果與含紫杉醇劑量成正比。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

所得數(shù)據(jù)用SPSS11.0統(tǒng)計(jì)軟件得出各組的平均值，行4組間兩兩對比t檢驗(yàn)，P＜0.05為有顯著差異。

2 結(jié)果

對照組的細(xì)胞未受紫杉醇的處理，其黏附率達(dá)99.5%，含有不同濃度紫杉醇處理下的ACC-M黏附率明顯下降，分別為86.2%、72.8%、59.5%詳情見表1。

表1 不同濃度紫杉醇處理下ACC-M黏附性比較

通過實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，紫杉醇在對抑制ACC-M的侵襲力等方面都有具有明顯的效果，其結(jié)果也與紫杉醇呈明顯的劑量關(guān)系，詳情可以參考相關(guān)文獻(xiàn)。

3 討論

腺樣囊性癌細(xì)胞利用自身特點(diǎn)貫穿于整個(gè)轉(zhuǎn)移的過程中，想要抑制腫瘤控制侵襲力是關(guān)鍵，每個(gè)癌細(xì)胞在侵襲運(yùn)動(dòng)中，細(xì)胞骨架參與整個(gè)信息的傳遞，通過對構(gòu)架改造來影響行為的運(yùn)變能力。微觀蛋白與微觀系統(tǒng)是紫杉醇的核心，能夠誘導(dǎo)和促進(jìn)微管蛋白聚合，防止解散，穩(wěn)定微管等作用。在實(shí)驗(yàn)中顯示紫杉醇對ACC-M有明顯下調(diào)能力，對其分析這與微管系統(tǒng)的破壞存有密切聯(lián)系[2]。

本研究采用空斑法、ELISA對ACC-M明膠酶的表達(dá)及活性進(jìn)行評價(jià)，結(jié)果顯示，紫杉醇對明膠酶的酶原合成存在有效的影響，通過微管系統(tǒng)的破壞對細(xì)胞骨架失調(diào)起阻斷影響，可以導(dǎo)致細(xì)胞黏附能力減弱，整合素分子聚集成局部黏附斑受阻?？瞻叻ㄑ芯勘砻鳎?xì)胞培養(yǎng)上清液中的明膠酶活性雖紫杉醇的濃度升高而降低，但低濃度紫杉醇作用下的數(shù)據(jù)顯示，目前對明膠酶活性受抑制的機(jī)制還需要進(jìn)一步研究。

綜上所述，在0.1至0.01mg/L濃度范圍內(nèi)，紫杉醇能夠?qū)CC-M的粘附力、運(yùn)動(dòng)以及侵襲力，有著明顯下降的表達(dá)及活性,實(shí)驗(yàn)表明紫杉醇對ACC-M的侵襲起到有效的控制能力。

（作者單位：1煙臺毓璜頂醫(yī)院藥學(xué)部；2大連醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院）

[1]林耿冰.紫杉醇抑制腺樣囊性癌體外侵襲力及其機(jī)制的初步研究[D].福建醫(yī)科大學(xué),2003.

[2]劉浩,俞光巖.紫杉醇抗涎腺腺樣囊性癌遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的實(shí)驗(yàn)研究[J].現(xiàn)代口腔醫(yī)學(xué)雜志,2002,14(03)∶193-194+289.

舒曉宏，博士，教授，博士生導(dǎo)師。