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    TGF—β1抑制劑Decorin對子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞HBC—1B遷移、侵襲轉(zhuǎn)移能力的影響

    2017-10-27 16:47:01蔡玉刁海丹
    中國當(dāng)代醫(yī)藥 2017年26期
    關(guān)鍵詞:癌細(xì)胞上皮陰性

    蔡玉+刁海丹

    [摘要]目的 研究轉(zhuǎn)化生長因子-β1(TGF-β1)及其抑制劑Decorin對子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞遷移、侵襲轉(zhuǎn)移能力的影響。方法 將子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞HEC-1B進(jìn)行體外培養(yǎng),實(shí)驗(yàn)設(shè)陰性對照組(未經(jīng)TGF-β1及Decorin處理)、TGF-β1組(TGF-β1的處理濃度為10 ng/ml)、Decorin 組(Decorin的處理濃度為100 ng/ml)、TGF-β1及Decorin組(TGF-β1的處理濃度為10 ng/ml,Decorin的處理濃度為100 ng/ml),TGF-β1及Decorin分別作用于人子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞HEC-1B后,MTT法檢測其對子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞的增殖抑制作用。Transwell實(shí)驗(yàn)檢測TGF-β1及Decorin對子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞遷移、侵襲轉(zhuǎn)移能力的影響。結(jié)果 Decorin明顯抑制子宮內(nèi)膜癌HEC-1B細(xì)胞的體外增殖,與陰性對照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與陰性對照組HEC-1B細(xì)胞的遷移數(shù)和侵襲數(shù)比較,TGF-β1組明顯更高(P<0.01),TGF-β1及Decorin組細(xì)胞的遷移數(shù)和侵襲數(shù)略高(P>0.05) ,而TGF-β1及Decorin組HEC-1B細(xì)胞的遷移數(shù)和侵襲數(shù)較TGF-β1組明顯減少(P<0.05)。結(jié)論 體外TGF-β1能夠增強(qiáng)子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞HEC-1B的遷移、侵襲轉(zhuǎn)移能力,而TGF-β1抑制劑Decorin可抑制子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞的增殖和侵襲轉(zhuǎn)移。

    [關(guān)鍵詞]子宮內(nèi)膜癌;侵襲轉(zhuǎn)移能力;TGF-β1;核心蛋白聚糖

    [中圖分類號] R737.33 [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A [文章編號] 1674-4721(2017)09(b)-0004-04

    The influence of TGF-β1 inhibitor-Decorin on the invasion and migration ability of HEC-1B for endometrial cancer cell

    CAI Yu DIAO Hai-dan

    Department of Gynecology,the Third People′s Hospital of Dalian City in Liaoning Province,Dalian 116033,China

    [Abstract] Objective To study the influence of TGF-β1 inhibitor Decorin on the invasion and migration ability of HEC-1B for endometrial cancer cell.Methods Endometrial cancer cell HEC-1B was cultured in vitro.Negative control group (without TGF-β1 and Decorin treatment) ,TGF-β1 group (10 ng/ml of treatment concentration for TGF-β1) and Decorin group (100 ng/ml of treatment concentration for Decorin),TGF-β1 and Decorin group (treatment concentration of TGF-β1 was 10 ng/ml,Decorin treatment concentration of Decorin was 100 ng/ml) were established.After TGF-β1 and Decorin actting on endometrial cancer cell HEC-1B respectively,MTT method was used to detect the proliferation and inhibition role of TGF-β1 and Decorin on endometrial cancer cell HEC-1B.The influence of TGF-β1 and Decorin on the invasion and migration ability of HEC-1B for endometrial cancer cell was examined by Transwell experimention.Results Decorin inhibited obviously the proliferation in vitro endometrial cancer cell HEC-1B and there was a statistical difference compared with negative control group (P<0.05).Compared with migration number and invasion number of HEC-1B cell in negative control group,it was obviously higher in TGF-β1 group (P<0.01) and it was slightly higher in TGF-β1 and Decorin group (P>0.05),and the migration number and invasion number of HEC-1B cell in TGFβ1 and Decorin group was obviously reduced compared with TGF-β1 group (P<0.05).Conclusion TGF-β1 in vitro can enhance the invasion and migration ability of endometrial cancer cell HEC-1B,while TGF-β1 inhibitor—Decorin can inhibit the proliferation and invasion and migration of endometrial carcinoma cell.endprint

    [Key words]Endometrial cancer;Invasion and migration ability;Transforming growth factor-β1;Decorin

    子宮內(nèi)膜癌是女性生殖器官最常見的惡性腫瘤之一,近年來發(fā)病率呈明顯上升趨勢[1-2]。局部復(fù)發(fā)及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移是子宮內(nèi)膜癌預(yù)后的關(guān)鍵步驟[3]。近年研究發(fā)現(xiàn)[4-5],上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial to mensenchymal transition,EMT)是上皮性癌侵襲轉(zhuǎn)移的重要機(jī)制,通過下調(diào)上皮黏附分子的表達(dá)使細(xì)胞間接觸力降低同時(shí)細(xì)胞流動(dòng)性增強(qiáng),從而使惡性細(xì)胞得以向遠(yuǎn)處播散。EMT的發(fā)生是一個(gè)復(fù)雜的過程,其中包括多條信號通路,其中最主要的是轉(zhuǎn)化生長因子-β1(TGF-β1)信號通路[6]。已經(jīng)證實(shí),TGF-β1在體內(nèi)、外培養(yǎng)的大多數(shù)上皮細(xì)胞、上皮來源的腫瘤細(xì)胞中均具有誘導(dǎo)EMT的作用[7-9]。近20年來的研究數(shù)據(jù)說明核心蛋白聚糖(Decorin)是TGF-β1的天然抑制劑,可抑制多種腫瘤細(xì)胞的生長及侵襲[10],但Decorin能否抑制子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞的生長及侵襲,目前尚無報(bào)道。本研究擬檢測 TGF-β1抑制劑Decorin 對子宮內(nèi)膜癌HEC-1B細(xì)胞遷移、侵襲轉(zhuǎn)移能力的影響,為子宮內(nèi)膜癌治療提供理論依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    人子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞株HEC-1B購自中科院上海細(xì)胞庫。TGF-β1購自PeproTech公司,重組人核心蛋白聚糖Decorin購自R&D公司,胰蛋白酶購自Gibco公司,DMEM/F12培養(yǎng)基、胎牛血清(FBS)購自美國Hyclone公司。Transwell小室購自Corning公司,人工基底膜基質(zhì)凝膠(Matrigel)購自BD公司。

    1.2 方法

    1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) HEC-1B細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清、100 U/ml青霉素和100 U/ml鏈霉素的DMEM/F12培養(yǎng)液中,于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng),每48小時(shí)換液1次,0.25%胰蛋白酶消化傳代。倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞的生長及形態(tài)的變化。細(xì)胞呈單層貼壁生長,選用對數(shù)生長期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

    1.2.2 實(shí)驗(yàn)分組 取對數(shù)生長期HEC-1B細(xì)胞,每種細(xì)胞均設(shè)4組:陰性對照組(未經(jīng)TGF-β1及Decorin處理)、TGF-β1組(TGF-β1的終處理濃度為10 ng/ml)、Decorin組(Decorin的終處理濃度為100 ng/ml)、TGF-β1和Decorin組(終處理濃度分別為10、100 ng/ml),置37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng),24 h后換液,48 h后終止培養(yǎng),收集細(xì)胞。

    1.2.3 MTT法檢測細(xì)胞增殖抑制能力 取5×104/ml的HEC-1B細(xì)胞接種于96孔培養(yǎng)板,每孔100 μl,每孔細(xì)胞數(shù)約為5×103個(gè),置37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h,后分為4組,分別加入TGF-β1及 Decorin,繼續(xù)培養(yǎng)48 h。終止培養(yǎng)前加MTT(5 g/L),每孔20 μl,37℃再培養(yǎng)4 h,吸出上清液,加DMSO 150 μl/孔,低速振蕩至紫色結(jié)晶完全消失,然后在酶標(biāo)儀上490 nm處測定吸光度值。按下列公式計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率:細(xì)胞增殖抑制率(%)=[1-(實(shí)驗(yàn)組A值-空白對照孔A值)/(陰性對照組A值-空白對照孔A值)]×100%。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。未接種細(xì)胞,只含5%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基、MTT和DMSO的溶劑對照組為空白對照孔。

    1.2.4 細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)和侵襲實(shí)驗(yàn) 取陰性對照組、TGF-β1組,TGF-β1和Decorin組作用24 h后細(xì)胞,PBS洗滌細(xì)胞,加入0.25%胰酶消化細(xì)胞,予含0.1%胎牛血清的培養(yǎng)基重懸細(xì)胞,制備單細(xì)胞懸液。

    1.2.4.1 細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn) Transwell上室加入上述各組100 μl細(xì)胞懸液,細(xì)胞密度為1×105/ml,下室加入600 μl含10%胎牛血清的完全培養(yǎng)基。于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 h后,取出小室,擦去上室內(nèi)側(cè)面未遷移細(xì)胞,用甲醇固定20 min,室溫下0.1%結(jié)晶紫染色25 min,于顯微鏡下每個(gè)小室隨意選取5個(gè)視野進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù),求平均值。每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

    1.2.4.2 細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn) 將無血清培養(yǎng)基和Matrigel按照8∶1稀釋,取50 μl稀釋的Matrigel鋪在Transwell小室的上室內(nèi),涂勻,放入37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中2 h,吸凈未干的Matrigel。之后的步驟同細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)。在顯微鏡下取5個(gè)視野進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)后取平均值,得出每個(gè)視野的侵襲細(xì)胞數(shù)。每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

    1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

    采用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS 16.0分析數(shù)據(jù),計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示,采用方差分析,以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    2結(jié)果

    2.1 各組子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞HEC-1B的增殖能力的比較

    以終濃度分別為0、10 ng/ml TGF-β1,100 ng/ml Decorin、10 ng/ml TGF-β1+100 ng/ml Decorin分別作用于HEC-1B細(xì)胞48 h,MTT檢測細(xì)胞增殖/活力。結(jié)果顯示,100 ng/ml Decorin作用后細(xì)胞活力/活細(xì)胞數(shù)有所下降,與陰性對照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(表1),提示Decorin能明顯抑制HEC-1B細(xì)胞增殖。

    2.2 各組子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞HEC-1B遷移、侵襲能力的比較

    與陰性對照組的HEC-1B細(xì)胞遷移數(shù)[(84.4±3.48)/HP]比較,TGF-β1組的HEC-1B細(xì)胞遷移數(shù)[(109±7.54)/HP]明顯更高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),TGF-β1+Decorin組[(91.4±8.21)/HP]略高(P>0.05),而TGF-β1+Decorin組的細(xì)胞遷移數(shù)明顯低于TGF-β1組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。endprint

    與陰性對照組的HEC-1B細(xì)胞侵襲數(shù)[(29.8±6.89)/HP]比較,TGF-β1組的HEC-1B細(xì)胞侵襲數(shù)[(65.2±5.23)/HP]明顯升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01), TGF-β1+Decorin組[(38.6±9.31)/HP]略高(P>0.05),而TGF-β1+Decorin組的細(xì)胞侵襲數(shù)明顯低于TGF-β1組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

    3討論

    在腫瘤的復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移過程中,多種細(xì)胞因子參與并起重要作用。近年來越來越多的研究表明,EMT使腫瘤細(xì)胞間黏附性減弱,運(yùn)動(dòng)能力增強(qiáng),在一系列信號分子的調(diào)控下,幫助細(xì)胞向周圍組織滲入或向遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。EMT指具有極性及緊密黏附力的上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)化為無極性、流動(dòng)性強(qiáng)的間質(zhì)細(xì)胞的病理生理過程,主要表現(xiàn)為上皮細(xì)胞的極性喪失及間質(zhì)細(xì)胞遷移能力獲得,是腫瘤細(xì)胞遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵環(huán)節(jié)[11]。TGF-β信號通路、Wnt信號通路、Hh途徑、Notch信號途徑、核因子(NF)-κB等途徑參與EMT的調(diào)控[12-13]。TGF-β是一種多功能的細(xì)胞因子,與惡性腫瘤細(xì)胞的侵襲、轉(zhuǎn)移關(guān)系密切,參與多種惡性腫瘤轉(zhuǎn)移過程[14-16]。Miettinen等最早發(fā)現(xiàn),TGF-β能誘導(dǎo)正常的乳腺上皮細(xì)胞發(fā)生EMT,獲得類似成纖維細(xì)胞的形態(tài)。張琳等[7]的研究發(fā)現(xiàn)在乳腺癌中,5 μg/L TGF-β1作用乳腺癌細(xì)胞72 h后,可誘導(dǎo)EMT。李鵬等[8]的研究發(fā)現(xiàn),用10 ng/ml TGF-β處理Ishikawa和HEC-1A細(xì)胞48 h后,采用蛋白印跡法檢測EMT相關(guān)標(biāo)志蛋白E-cad、N-cad、Vim蛋白的表達(dá),結(jié)果發(fā)現(xiàn),兩種細(xì)胞中上皮生物標(biāo)志物鈣粘蛋白(E-cad)表達(dá)水平均下降,間質(zhì)生物標(biāo)志物神經(jīng)鈣粘蛋白(N-cad)、波形蛋白(Vim)表達(dá)水平均升高,提示在ER陽性的Ishikawa細(xì)胞和ER陰性的HEC-1A細(xì)胞中,TGF-β均能誘發(fā)EMT。解剛強(qiáng)等[9]采用外源性人重組TGF-β1及其受體拮抗劑LY2109761作用于人胃癌細(xì)胞株SGC7901,顯示TGF-β1可誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞發(fā)生EMT,增強(qiáng)其侵襲能力,這種作用可被其受體拮抗劑LY2109761所抑制。本研究采用10 ng/ml TGF-β1作用于HEC-1B細(xì)胞24 h,Transwell實(shí)驗(yàn)顯示,TGF-β1組穿膜細(xì)胞數(shù)較對照組明顯增多(P<0.05),提示TGF-β1可明顯增強(qiáng)HEC-1B細(xì)胞的遷移侵襲能力,與上述研究結(jié)果一致。

    Decorin是一種廣泛分布于人體組織中的小分子蛋白多糖,是細(xì)胞外基質(zhì)的重要組成部分。目前研究發(fā)現(xiàn)DCN 基因是一種抑癌基因,具有抑制實(shí)體腫瘤生長或轉(zhuǎn)移的能力[10,17]。其抗腫瘤機(jī)制尚未明確,研究顯示Decorin是具有TGF-β活性的天然負(fù)反饋調(diào)節(jié)因子,Decorin可通過抑制TGF-β細(xì)胞通路作用,并誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞自噬,進(jìn)而抑制神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞U87MG的侵襲及轉(zhuǎn)移[18],亦可通過穩(wěn)定和提高E-cad蛋白的表達(dá)水平抑制結(jié)腸癌的生長和轉(zhuǎn)移[19]。Goldoni等[20]發(fā)現(xiàn),Decorin 可有效抑制乳腺癌細(xì)胞在原發(fā)灶的生長和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移,提出Decorin 可作為乳腺癌靶向治療的候選藥物之一。Decorin能否阻斷TGF-β誘導(dǎo)子宮內(nèi)膜癌的EMT,目前尚無研究。本研究用100 ng/ml Decorin作用于人子宮內(nèi)膜腺癌HEC-1B 細(xì)胞系,觀察其對細(xì)胞增殖及侵襲力的影響。本實(shí)驗(yàn)MTT結(jié)果提示,該濃度Decorin作用HEC-1B細(xì)胞48 h后,抑制率為11.1%。本文進(jìn)一步研究顯示,分別用Decorin和TGF-β1作用于HEC-1B細(xì)胞24 h后,TGF-β1組穿膜細(xì)胞數(shù)較對照組明顯增多(P<0.05),Decorin和TGF-β1聯(lián)合用藥組穿膜細(xì)胞數(shù)較對照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),Decorin和TGF-β1聯(lián)合用藥組與TGF-β1組比較穿膜細(xì)胞數(shù)明顯較少,兩組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。上述數(shù)據(jù)表明,應(yīng)用TGF-β1抑制劑Decorin后,HEC-1B細(xì)胞的細(xì)胞增殖率、遷移數(shù)及侵襲數(shù)均明顯下降,提示Decorin通過對TGF-β1的拮抗作用,降低了TGF-β1增強(qiáng)的侵襲能力,抑制了HEC-1B細(xì)胞的生長、遷移和侵襲。

    本實(shí)驗(yàn)證實(shí)Decorin能抑制人子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞的增殖,并可降低子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移能力。Decorin具體以何種機(jī)制抑制腫瘤細(xì)胞增殖及轉(zhuǎn)移,將是下一步的研究方向。

    [參考文獻(xiàn)]

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    (收稿日期:2017-08-09 本文編輯:許俊琴)endprint

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