TGF—β1抑制劑Decorin對子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞HBC—1B遷移、侵襲轉(zhuǎn)移能力的影響

蔡玉+刁海丹

[摘要]目的 研究轉(zhuǎn)化生長因子-β1（TGF-β1）及其抑制劑Decorin對子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞遷移、侵襲轉(zhuǎn)移能力的影響。方法 將子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞HEC-1B進(jìn)行體外培養(yǎng)，實(shí)驗(yàn)設(shè)陰性對照組（未經(jīng)TGF-β1及Decorin處理）、TGF-β1組（TGF-β1的處理濃度為10 ng/ml）、Decorin 組（Decorin的處理濃度為100 ng/ml）、TGF-β1及Decorin組（TGF-β1的處理濃度為10 ng/ml，Decorin的處理濃度為100 ng/ml），TGF-β1及Decorin分別作用于人子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞HEC-1B后，MTT法檢測其對子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞的增殖抑制作用。Transwell實(shí)驗(yàn)檢測TGF-β1及Decorin對子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞遷移、侵襲轉(zhuǎn)移能力的影響。結(jié)果 Decorin明顯抑制子宮內(nèi)膜癌HEC-1B細(xì)胞的體外增殖，與陰性對照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。與陰性對照組HEC-1B細(xì)胞的遷移數(shù)和侵襲數(shù)比較，TGF-β1組明顯更高（P<0.01），TGF-β1及Decorin組細(xì)胞的遷移數(shù)和侵襲數(shù)略高（P>0.05） ，而TGF-β1及Decorin組HEC-1B細(xì)胞的遷移數(shù)和侵襲數(shù)較TGF-β1組明顯減少（P<0.05）。結(jié)論 體外TGF-β1能夠增強(qiáng)子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞HEC-1B的遷移、侵襲轉(zhuǎn)移能力，而TGF-β1抑制劑Decorin可抑制子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞的增殖和侵襲轉(zhuǎn)移。

[關(guān)鍵詞]子宮內(nèi)膜癌；侵襲轉(zhuǎn)移能力；TGF-β1；核心蛋白聚糖

[中圖分類號] R737.33 [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A [文章編號] 1674-4721（2017）09（b）-0004-04

The influence of TGF-β1 inhibitor-Decorin on the invasion and migration ability of HEC-1B for endometrial cancer cell

CAI Yu DIAO Hai-dan

Department of Gynecology，the Third People′s Hospital of Dalian City in Liaoning Province，Dalian 116033，China

[Abstract] Objective To study the influence of TGF-β1 inhibitor Decorin on the invasion and migration ability of HEC-1B for endometrial cancer cell.Methods Endometrial cancer cell HEC-1B was cultured in vitro.Negative control group （without TGF-β1 and Decorin treatment） ，TGF-β1 group （10 ng/ml of treatment concentration for TGF-β1） and Decorin group （100 ng/ml of treatment concentration for Decorin），TGF-β1 and Decorin group （treatment concentration of TGF-β1 was 10 ng/ml，Decorin treatment concentration of Decorin was 100 ng/ml） were established.After TGF-β1 and Decorin actting on endometrial cancer cell HEC-1B respectively，MTT method was used to detect the proliferation and inhibition role of TGF-β1 and Decorin on endometrial cancer cell HEC-1B.The influence of TGF-β1 and Decorin on the invasion and migration ability of HEC-1B for endometrial cancer cell was examined by Transwell experimention.Results Decorin inhibited obviously the proliferation in vitro endometrial cancer cell HEC-1B and there was a statistical difference compared with negative control group （P<0.05）.Compared with migration number and invasion number of HEC-1B cell in negative control group，it was obviously higher in TGF-β1 group （P<0.01） and it was slightly higher in TGF-β1 and Decorin group （P>0.05），and the migration number and invasion number of HEC-1B cell in TGFβ1 and Decorin group was obviously reduced compared with TGF-β1 group （P<0.05）.Conclusion TGF-β1 in vitro can enhance the invasion and migration ability of endometrial cancer cell HEC-1B，while TGF-β1 inhibitor—Decorin can inhibit the proliferation and invasion and migration of endometrial carcinoma cell.endprint

[Key words]Endometrial cancer；Invasion and migration ability；Transforming growth factor-β1；Decorin

子宮內(nèi)膜癌是女性生殖器官最常見的惡性腫瘤之一，近年來發(fā)病率呈明顯上升趨勢[1-2]。局部復(fù)發(fā)及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移是子宮內(nèi)膜癌預(yù)后的關(guān)鍵步驟[3]。近年研究發(fā)現(xiàn)[4-5]，上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial to mensenchymal transition，EMT）是上皮性癌侵襲轉(zhuǎn)移的重要機(jī)制，通過下調(diào)上皮黏附分子的表達(dá)使細(xì)胞間接觸力降低同時(shí)細(xì)胞流動(dòng)性增強(qiáng)，從而使惡性細(xì)胞得以向遠(yuǎn)處播散。EMT的發(fā)生是一個(gè)復(fù)雜的過程，其中包括多條信號通路，其中最主要的是轉(zhuǎn)化生長因子-β1（TGF-β1）信號通路[6]。已經(jīng)證實(shí)，TGF-β1在體內(nèi)、外培養(yǎng)的大多數(shù)上皮細(xì)胞、上皮來源的腫瘤細(xì)胞中均具有誘導(dǎo)EMT的作用[7-9]。近20年來的研究數(shù)據(jù)說明核心蛋白聚糖（Decorin）是TGF-β1的天然抑制劑，可抑制多種腫瘤細(xì)胞的生長及侵襲[10]，但Decorin能否抑制子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞的生長及侵襲，目前尚無報(bào)道。本研究擬檢測 TGF-β1抑制劑Decorin 對子宮內(nèi)膜癌HEC-1B細(xì)胞遷移、侵襲轉(zhuǎn)移能力的影響，為子宮內(nèi)膜癌治療提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

人子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞株HEC-1B購自中科院上海細(xì)胞庫。TGF-β1購自PeproTech公司，重組人核心蛋白聚糖Decorin購自R&D公司，胰蛋白酶購自Gibco公司，DMEM/F12培養(yǎng)基、胎牛血清（FBS）購自美國Hyclone公司。Transwell小室購自Corning公司，人工基底膜基質(zhì)凝膠（Matrigel）購自BD公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) HEC-1B細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清、100 U/ml青霉素和100 U/ml鏈霉素的DMEM/F12培養(yǎng)液中，于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每48小時(shí)換液1次，0.25%胰蛋白酶消化傳代。倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞的生長及形態(tài)的變化。細(xì)胞呈單層貼壁生長，選用對數(shù)生長期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)分組 取對數(shù)生長期HEC-1B細(xì)胞，每種細(xì)胞均設(shè)4組：陰性對照組（未經(jīng)TGF-β1及Decorin處理）、TGF-β1組（TGF-β1的終處理濃度為10 ng/ml）、Decorin組（Decorin的終處理濃度為100 ng/ml）、TGF-β1和Decorin組（終處理濃度分別為10、100 ng/ml），置37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)，24 h后換液，48 h后終止培養(yǎng)，收集細(xì)胞。

1.2.3 MTT法檢測細(xì)胞增殖抑制能力 取5×104/ml的HEC-1B細(xì)胞接種于96孔培養(yǎng)板，每孔100 μl，每孔細(xì)胞數(shù)約為5×103個(gè)，置37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，后分為4組，分別加入TGF-β1及 Decorin，繼續(xù)培養(yǎng)48 h。終止培養(yǎng)前加MTT（5 g/L），每孔20 μl，37℃再培養(yǎng)4 h，吸出上清液，加DMSO 150 μl/孔，低速振蕩至紫色結(jié)晶完全消失，然后在酶標(biāo)儀上490 nm處測定吸光度值。按下列公式計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率：細(xì)胞增殖抑制率（%）=[1-（實(shí)驗(yàn)組A值-空白對照孔A值）/（陰性對照組A值-空白對照孔A值）]×100%。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。未接種細(xì)胞，只含5%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基、MTT和DMSO的溶劑對照組為空白對照孔。

1.2.4 細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)和侵襲實(shí)驗(yàn) 取陰性對照組、TGF-β1組，TGF-β1和Decorin組作用24 h后細(xì)胞，PBS洗滌細(xì)胞，加入0.25%胰酶消化細(xì)胞，予含0.1%胎牛血清的培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，制備單細(xì)胞懸液。

1.2.4.1 細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn) Transwell上室加入上述各組100 μl細(xì)胞懸液，細(xì)胞密度為1×105/ml，下室加入600 μl含10%胎牛血清的完全培養(yǎng)基。于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，取出小室，擦去上室內(nèi)側(cè)面未遷移細(xì)胞，用甲醇固定20 min，室溫下0.1%結(jié)晶紫染色25 min，于顯微鏡下每個(gè)小室隨意選取5個(gè)視野進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，求平均值。每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.4.2 細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn) 將無血清培養(yǎng)基和Matrigel按照8∶1稀釋，取50 μl稀釋的Matrigel鋪在Transwell小室的上室內(nèi)，涂勻，放入37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中2 h，吸凈未干的Matrigel。之后的步驟同細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)。在顯微鏡下取5個(gè)視野進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)后取平均值，得出每個(gè)視野的侵襲細(xì)胞數(shù)。每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS 16.0分析數(shù)據(jù)，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，采用方差分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1 各組子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞HEC-1B的增殖能力的比較

以終濃度分別為0、10 ng/ml TGF-β1，100 ng/ml Decorin、10 ng/ml TGF-β1+100 ng/ml Decorin分別作用于HEC-1B細(xì)胞48 h，MTT檢測細(xì)胞增殖/活力。結(jié)果顯示，100 ng/ml Decorin作用后細(xì)胞活力/活細(xì)胞數(shù)有所下降，與陰性對照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）（表1），提示Decorin能明顯抑制HEC-1B細(xì)胞增殖。

2.2 各組子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞HEC-1B遷移、侵襲能力的比較

與陰性對照組的HEC-1B細(xì)胞遷移數(shù)[（84.4±3.48）/HP]比較，TGF-β1組的HEC-1B細(xì)胞遷移數(shù)[（109±7.54）/HP]明顯更高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），TGF-β1+Decorin組[（91.4±8.21）/HP]略高（P>0.05），而TGF-β1+Decorin組的細(xì)胞遷移數(shù)明顯低于TGF-β1組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。endprint

與陰性對照組的HEC-1B細(xì)胞侵襲數(shù)[（29.8±6.89）/HP]比較，TGF-β1組的HEC-1B細(xì)胞侵襲數(shù)[（65.2±5.23）/HP]明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）， TGF-β1+Decorin組[（38.6±9.31）/HP]略高（P>0.05），而TGF-β1+Decorin組的細(xì)胞侵襲數(shù)明顯低于TGF-β1組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。

3討論

在腫瘤的復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移過程中，多種細(xì)胞因子參與并起重要作用。近年來越來越多的研究表明，EMT使腫瘤細(xì)胞間黏附性減弱，運(yùn)動(dòng)能力增強(qiáng)，在一系列信號分子的調(diào)控下，幫助細(xì)胞向周圍組織滲入或向遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。EMT指具有極性及緊密黏附力的上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)化為無極性、流動(dòng)性強(qiáng)的間質(zhì)細(xì)胞的病理生理過程，主要表現(xiàn)為上皮細(xì)胞的極性喪失及間質(zhì)細(xì)胞遷移能力獲得，是腫瘤細(xì)胞遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵環(huán)節(jié)[11]。TGF-β信號通路、Wnt信號通路、Hh途徑、Notch信號途徑、核因子（NF）-κB等途徑參與EMT的調(diào)控[12-13]。TGF-β是一種多功能的細(xì)胞因子，與惡性腫瘤細(xì)胞的侵襲、轉(zhuǎn)移關(guān)系密切，參與多種惡性腫瘤轉(zhuǎn)移過程[14-16]。Miettinen等最早發(fā)現(xiàn)，TGF-β能誘導(dǎo)正常的乳腺上皮細(xì)胞發(fā)生EMT，獲得類似成纖維細(xì)胞的形態(tài)。張琳等[7]的研究發(fā)現(xiàn)在乳腺癌中，5 μg/L TGF-β1作用乳腺癌細(xì)胞72 h后，可誘導(dǎo)EMT。李鵬等[8]的研究發(fā)現(xiàn)，用10 ng/ml TGF-β處理Ishikawa和HEC-1A細(xì)胞48 h后，采用蛋白印跡法檢測EMT相關(guān)標(biāo)志蛋白E-cad、N-cad、Vim蛋白的表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，兩種細(xì)胞中上皮生物標(biāo)志物鈣粘蛋白（E-cad）表達(dá)水平均下降，間質(zhì)生物標(biāo)志物神經(jīng)鈣粘蛋白（N-cad）、波形蛋白（Vim）表達(dá)水平均升高，提示在ER陽性的Ishikawa細(xì)胞和ER陰性的HEC-1A細(xì)胞中，TGF-β均能誘發(fā)EMT。解剛強(qiáng)等[9]采用外源性人重組TGF-β1及其受體拮抗劑LY2109761作用于人胃癌細(xì)胞株SGC7901，顯示TGF-β1可誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞發(fā)生EMT，增強(qiáng)其侵襲能力，這種作用可被其受體拮抗劑LY2109761所抑制。本研究采用10 ng/ml TGF-β1作用于HEC-1B細(xì)胞24 h，Transwell實(shí)驗(yàn)顯示，TGF-β1組穿膜細(xì)胞數(shù)較對照組明顯增多（P<0.05），提示TGF-β1可明顯增強(qiáng)HEC-1B細(xì)胞的遷移侵襲能力，與上述研究結(jié)果一致。

Decorin是一種廣泛分布于人體組織中的小分子蛋白多糖，是細(xì)胞外基質(zhì)的重要組成部分。目前研究發(fā)現(xiàn)DCN 基因是一種抑癌基因，具有抑制實(shí)體腫瘤生長或轉(zhuǎn)移的能力[10，17]。其抗腫瘤機(jī)制尚未明確，研究顯示Decorin是具有TGF-β活性的天然負(fù)反饋調(diào)節(jié)因子，Decorin可通過抑制TGF-β細(xì)胞通路作用，并誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞自噬，進(jìn)而抑制神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞U87MG的侵襲及轉(zhuǎn)移[18]，亦可通過穩(wěn)定和提高E-cad蛋白的表達(dá)水平抑制結(jié)腸癌的生長和轉(zhuǎn)移[19]。Goldoni等[20]發(fā)現(xiàn)，Decorin 可有效抑制乳腺癌細(xì)胞在原發(fā)灶的生長和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，提出Decorin 可作為乳腺癌靶向治療的候選藥物之一。Decorin能否阻斷TGF-β誘導(dǎo)子宮內(nèi)膜癌的EMT，目前尚無研究。本研究用100 ng/ml Decorin作用于人子宮內(nèi)膜腺癌HEC-1B 細(xì)胞系，觀察其對細(xì)胞增殖及侵襲力的影響。本實(shí)驗(yàn)MTT結(jié)果提示，該濃度Decorin作用HEC-1B細(xì)胞48 h后，抑制率為11.1%。本文進(jìn)一步研究顯示，分別用Decorin和TGF-β1作用于HEC-1B細(xì)胞24 h后，TGF-β1組穿膜細(xì)胞數(shù)較對照組明顯增多（P<0.05），Decorin和TGF-β1聯(lián)合用藥組穿膜細(xì)胞數(shù)較對照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），Decorin和TGF-β1聯(lián)合用藥組與TGF-β1組比較穿膜細(xì)胞數(shù)明顯較少，兩組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。上述數(shù)據(jù)表明，應(yīng)用TGF-β1抑制劑Decorin后，HEC-1B細(xì)胞的細(xì)胞增殖率、遷移數(shù)及侵襲數(shù)均明顯下降，提示Decorin通過對TGF-β1的拮抗作用，降低了TGF-β1增強(qiáng)的侵襲能力，抑制了HEC-1B細(xì)胞的生長、遷移和侵襲。

本實(shí)驗(yàn)證實(shí)Decorin能抑制人子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞的增殖，并可降低子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移能力。Decorin具體以何種機(jī)制抑制腫瘤細(xì)胞增殖及轉(zhuǎn)移，將是下一步的研究方向。

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（收稿日期：2017-08-09 本文編輯：許俊琴）endprint