Veriflow LS李斯特菌屬快速檢測(cè)技術(shù)性能驗(yàn)證

目的：與美國農(nóng)業(yè)部微生物實(shí)驗(yàn)室指南8.08章參考方法進(jìn)行對(duì)比，驗(yàn)證Veriflow LS李斯特菌屬定性檢測(cè)方法的性能。方法及結(jié)果：本次性能驗(yàn)證研究采用了6種不同環(huán)境樣品和食品基質(zhì)來驗(yàn)證Veriflow LS方法對(duì)于檢測(cè)低菌量李斯特菌的能力。在每個(gè)非配對(duì)的對(duì)比試驗(yàn)中，陽性檢出率的結(jié)果顯示，Veriflow LS的檢測(cè)結(jié)果與參考方法無顯著性差異。參考方法對(duì)Veriflow LS檢測(cè)過的樣品的確認(rèn)的結(jié)果顯示，Veriflow LS檢測(cè)結(jié)果無假陽性和假陰性。同時(shí)對(duì)51個(gè)李斯特菌屬和35個(gè)非李斯特菌屬進(jìn)行了包容性驗(yàn)證和排他性驗(yàn)證，結(jié)果顯示包容性和排他性均為100%?？偨Y(jié)：Veriflow LS是一個(gè)靈敏、選擇性強(qiáng)、耐用的環(huán)境表面（不銹鋼、混凝土、塑料和陶瓷的表面）和即食食品基質(zhì)（熱狗和熟火雞肉）中李斯特菌屬的檢測(cè)方法。

前言

李斯特菌屬（Listeria）既包括默氏李斯特菌等無致病性的李斯特菌，還包括伊氏李斯特菌、威爾斯李斯特菌、格氏李斯特菌和單增李斯特菌等具有致病性的種屬，其中單增李斯特菌對(duì)人類的危害最大，能夠引起人體食物中毒，引發(fā)骨髓炎、腦膜炎、心肌炎、孕婦流產(chǎn)以及產(chǎn)褥感染等。李斯特菌屬廣泛存在于自然界中，在4℃的環(huán)境中仍可生長繁殖，故而已引起公共衛(wèi)生和食品安全領(lǐng)域的廣泛重視。正因如此，李斯特菌屬的快速檢測(cè)對(duì)于預(yù)防由該菌屬引發(fā)的食物中毒和食源性疾病具有重要的指導(dǎo)意義。傳統(tǒng)的李斯特菌屬檢測(cè)手段是培養(yǎng)法，包括預(yù)增菌（24h）、選擇性增菌（24h）、選擇性平板（48h）、生化反應(yīng)等過程，是檢驗(yàn)的“金標(biāo)準(zhǔn)”，但其費(fèi)時(shí)費(fèi)力、成本高、專業(yè)性強(qiáng)，顯然無法滿足快速檢測(cè)的需求。目前李斯特菌屬快速檢測(cè)方法主要有免疫方法和熒光PCR法，雖都可有效縮短檢測(cè)時(shí)間，但前者在致病菌檢測(cè)時(shí)存在較高的假陽性和假陰性，而后者的前處理通常操作復(fù)雜（需要核酸提?。?，對(duì)操作人員的要求高，成本高且存在氣溶膠引起的假陽性。因此，市場(chǎng)亟需一種更為簡(jiǎn)便、高效且特異性強(qiáng)的李斯特菌屬快速檢測(cè)方法。

Veriflow LS是基于DNA分子技術(shù)開發(fā)的李斯特菌屬的快速檢測(cè)系統(tǒng)，適用于環(huán)境表面和食品基質(zhì)的檢測(cè)，只需22小時(shí)的前增菌、60～90分鐘的擴(kuò)增和3分鐘的層析檢測(cè)，即可得出檢驗(yàn)結(jié)果。該方法將PCR技術(shù)與垂直流層析系統(tǒng)結(jié)合，無需提取核酸，具有高特異性和高靈敏度，同時(shí)采用專利的酶系統(tǒng)有效降低了假陽性和假陰性。本次實(shí)驗(yàn)將Veriflow LS系統(tǒng)方法與傳統(tǒng)方法進(jìn)行對(duì)比，驗(yàn)證了Veriflow LS系統(tǒng)方法的性能。

1 方法原理

將采集的樣品增菌，然后取增菌液用于PCR擴(kuò)增，最后將擴(kuò)增產(chǎn)物直接加入到層析卡盒的加樣窗內(nèi)，僅需等待3分鐘即可產(chǎn)生反應(yīng)信號(hào)。拉動(dòng)檢測(cè)卡盒上的開關(guān)，觀察檢測(cè)結(jié)果。檢測(cè)結(jié)果為陽性時(shí)，靶標(biāo)分析物被捕獲并固定在測(cè)試膜上，在陽性線處生成視覺信號(hào)，在測(cè)試卡盒標(biāo)記的“T”端，分析物聚集產(chǎn)生清晰的紅色檢測(cè)線；控制線同時(shí)在“C”區(qū)顯現(xiàn)，表明實(shí)驗(yàn)的操作是正確的。兩條紅線表明樣品為李斯特屬陽性，而一條質(zhì)控線則表明樣品為李斯特屬陰性。

2 實(shí)驗(yàn)器材及樣品

對(duì)比方法（參考方法）：美國農(nóng)業(yè)部微生物實(shí)驗(yàn)室指南8.08章參考方法。

樣品基質(zhì)：不銹鋼表面、混凝土表面、塑料表面、陶瓷表面、熱狗和熟火雞肉。Veriflow LS所需器材：Veriflow LS李斯特菌屬檢測(cè)試劑盒（含PCR試劑、層析檢測(cè)卡等）、IS PCR儀、移液器、金屬浴加熱器（95±2℃）。

菌種：各菌株分別來自ATCC、BEI、佛蒙特大學(xué)、賓夕法尼亞大學(xué)、NCTC和NCIMB。所有菌株都經(jīng)參考方法確認(rèn)。

3 實(shí)驗(yàn)方法

3.1 實(shí)驗(yàn)用菌懸液準(zhǔn)備

單核增生李斯特菌：將菌種培養(yǎng)物增菌并添到樣品中，使樣品的陽性率在20%～80%即可用于Veriflow LS耐用性測(cè)試和批次間穩(wěn)定性測(cè)試。具體步驟如下：菌株接種于BHI肉湯中至穩(wěn)定期（含量約為1.5×109CFU/mL），稀釋，取稀釋因子為108的稀釋液100μL加入到50mL的李斯特肉湯中，混勻，從中取5mL加入到100mL李斯特肉湯中并于35±1℃培養(yǎng)22h。陰性對(duì)照菌：腸球菌ATCC 29212用BHI肉湯增菌直至穩(wěn)定期，用于Veriflow LS耐用性和批次間穩(wěn)定性測(cè)試。包容性測(cè)試菌株：51株李斯特菌屬菌株分別增菌，釋至50×LOD值（約為5.0×105CFU/mL），不經(jīng)增菌直接上機(jī)檢測(cè)。排他性菌株：35株排他性菌株增菌至穩(wěn)定期，該濃度用于Veriflow LS排他性測(cè)試。

3.2 Veriflow LS檢測(cè)流程

增菌方法：取樣品與適量李斯特肉湯混合，均質(zhì)，35±2℃培養(yǎng)22h。樣品準(zhǔn)備和PCR擴(kuò)增：取增菌好的樣品500μL增菌液加入到配套的采樣管中，滅活10min后，移取5μL加到PCR試劑管中，放入擴(kuò)增儀中并運(yùn)行對(duì)應(yīng)程序。層析檢測(cè)：在已完成擴(kuò)增的PCR管子中加入4滴緩沖液B，層析檢測(cè)卡加樣窗內(nèi)，等待約3min，即可打開層析檢測(cè)卡視窗獲取結(jié)果（2h內(nèi)打開有效）。結(jié)果判讀：檢測(cè)卡視窗內(nèi)只有1條紅線（控制線），表明樣品為李斯特菌屬陰性；檢測(cè)卡視窗內(nèi)有2條紅線（控制線和陽性線），則表明樣品為李斯特菌屬陽性。

3.3 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

3.3.1 耐用性驗(yàn)證

Veriflow LS系統(tǒng)參數(shù)改變時(shí)，低菌量陽性樣和陰性樣（非李斯特菌屬）的檢測(cè)和分析一定程度上會(huì)偏離標(biāo)準(zhǔn)參數(shù)，因此要進(jìn)行耐用性驗(yàn)證。驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)采用了析因設(shè)計(jì)（見表1），變更的參數(shù)分別為：滅活時(shí)間（8或12min±30s）、IS緩沖液B添加量（3滴或5滴）和LS層析檢測(cè)卡層析時(shí)間（1.5或2.5min±15s）。

3.3.2 批次間穩(wěn)定性測(cè)試endprint

本次實(shí)驗(yàn)采用了3個(gè)獨(dú)立生產(chǎn)的批次，批次號(hào)分別為ML0032、ML0035和ML0037，每個(gè)批次分別在0個(gè)月、6個(gè)月和12個(gè)月的時(shí)間點(diǎn)（通過加速老化完成）進(jìn)行了如表2所示的驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)。每個(gè)時(shí)間點(diǎn)分別采用10個(gè)含0～9個(gè)目標(biāo)菌（10個(gè)樣品中部分不含目標(biāo)菌）的樣品和5個(gè)含非目標(biāo)菌樣品進(jìn)行驗(yàn)證，具體實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)見表2。

3.3.3 特異性測(cè)試（包容性和排他性測(cè)試）

用準(zhǔn)備好的包容性和排他性菌株菌懸液，不經(jīng)增菌，按照Veriflow操作說明書進(jìn)行分析檢測(cè)。（注：所有包容性驗(yàn)證菌株的培養(yǎng)物都已經(jīng)過參考方法確認(rèn)。）

3.3.4 獨(dú)立方法對(duì)比實(shí)驗(yàn)

實(shí)驗(yàn)?zāi)康臑楸容^Veriflow LS檢測(cè)方法和參考方法在檢測(cè)環(huán)境表面樣品與即食食品樣品中李斯特菌屬的性能差異。由于Veriflow LS和參考方法的前增菌培養(yǎng)基不同，本次實(shí)驗(yàn)對(duì)所有樣品基質(zhì)都采用獨(dú)立的非配對(duì)方法進(jìn)行分析檢測(cè)。（注：每個(gè)Veriflow LS檢測(cè)過的樣品都經(jīng)參考方法確認(rèn)并確保Veriflow LS檢測(cè)結(jié)果無假陽性或假陰性）。本次實(shí)驗(yàn)的每種樣品都采用了30個(gè)樣品進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，其中5個(gè)樣品未添加目標(biāo)菌（濃度為0CFU/采樣量），20個(gè)添加了低含量目標(biāo)菌（濃度為0.2～2CFU/采樣量），另外5個(gè)添加了高含量目標(biāo)菌（濃度為2～5CFU/采樣量），并且每種樣品都添加不同李斯特菌。設(shè)計(jì)低含量添加樣品的目的是使20個(gè)樣品中部分樣品的結(jié)果為陽性，部分結(jié)果樣品的結(jié)果為陰性，比例在5/20～15/20之間，以比較兩種方法的結(jié)果是否存在陽性檢出率上的差異。

環(huán)境表面樣品：將兩種檢測(cè)方法（Verilow LS和參考方法）所采用的各類環(huán)境表面分別添加不同的李斯特菌以獲得不同程度污染的表面。不銹鋼表面和混凝土表面采樣方法：10×10cm的表面添加0.25mL菌懸液并用Hygeina海綿棒采樣。陶瓷和塑料表面采樣方法：2.5×2.5cm表面添加0.10mL菌懸液并用Hygeina Q-Swab拭子采樣。除添加李斯特菌之外，不銹鋼表面還添加了高于目標(biāo)菌（李斯特菌）含量10倍的競(jìng)爭(zhēng)性菌—糞腸球菌ATCC 29212。取樣前所有表面都在室溫（24±2℃）下自然風(fēng)干16～24h，菌懸液都采用TSA培養(yǎng)基進(jìn)行計(jì)數(shù)。采樣完成后，可按照兩種方法各自的操作說明進(jìn)行后續(xù)檢測(cè)。

即食食品樣品：兩種食品基質(zhì)添加了不同的李斯特菌。對(duì)每種食品基質(zhì)添加陽性培養(yǎng)物稀釋液后在4±1℃下放置48～72h，將樣品分成適當(dāng)份數(shù)并分裝于均質(zhì)袋中，增菌并進(jìn)行后續(xù)檢測(cè)。（添加的李斯特菌在50±2℃下熱應(yīng)激10min便已失去50%的活力）。用MPN法對(duì)樣品中李斯特菌含量進(jìn)行計(jì)數(shù)。采樣完成后，按照兩種方法各自的操作說明進(jìn)行后續(xù)檢測(cè)。

3.3.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

POD：在一定基質(zhì)和一定待測(cè)物濃度下，定性分析方法獲得陽性分析結(jié)果數(shù)的比例。POD值與濃度有關(guān)，POD的計(jì)算公式為POD=陽性結(jié)果數(shù)量/試驗(yàn)總數(shù)。以下幾個(gè)POD值分別為：PODR（參考方法POD），PODC（被評(píng)估方法POD），在95%的置信區(qū)間內(nèi)評(píng)估POD值，包括PODR、PODC。

dPOD：兩個(gè)POD值之差，dPODC=PODC-PODR，計(jì)算dPODC的95%的置信區(qū)間。若置信區(qū)間不包括0，則兩種方法存在顯著性差異，反之則不存顯著性差異。

4 結(jié)果

4.1 耐用性和批次間穩(wěn)定性結(jié)果

耐用性測(cè)試結(jié)果（見表1）顯示，在不同參數(shù)（包括滅活時(shí)間、緩沖液B添加滴數(shù)和層析卡層析時(shí)間）結(jié)合改變下，Veriflow系統(tǒng)性能不受影響，并且所有結(jié)果用參考方法進(jìn)行陽性確認(rèn)后都為真陽性。這些結(jié)果表明，一些系統(tǒng)參數(shù)的改變不會(huì)對(duì)系統(tǒng)的性能產(chǎn)生影響。

批次間穩(wěn)定性結(jié)果（見表2）顯示批次間穩(wěn)定性良好，每個(gè)批次和時(shí)間點(diǎn)的層析檢測(cè)卡具有一致的性能表現(xiàn)。這一結(jié)果同時(shí)也表明，Veriflow LS具有至少12個(gè)月的穩(wěn)定保質(zhì)期。

4.2 包容性和排他性測(cè)試

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，Veriflow LS準(zhǔn)確無誤地檢測(cè)出了51株不同的李斯特菌屬。另外，排他性結(jié)果顯示，Veriflow LS系統(tǒng)能夠準(zhǔn)確無誤辨別李斯特菌屬之外的雜菌。（注：屎腸球菌ATCC 19434在非選擇性增菌培養(yǎng)基增菌后上機(jī)檢測(cè)出現(xiàn)了假陽性，但采用選擇性增菌培養(yǎng)基（ISLB）增菌后上機(jī)檢測(cè)則為陰性。）

4.3 環(huán)境樣品結(jié)果比較

4種表面上分別添加3個(gè)不同濃度（不添加菌、低菌量和高菌量）的不同菌，采樣，最后用各自的方法進(jìn)行檢測(cè)。添加低菌量表面的檢測(cè)對(duì)比結(jié)果顯示，Veriflow LS系統(tǒng)方法和參考方法在不銹鋼表面樣品分別檢出12和8個(gè)陽性樣本，混凝土表面樣品分別檢出15和14個(gè)陽性樣本，陶瓷表面樣品分別檢出8和11個(gè)陽性樣本，塑料表面樣品兩種方法則分別檢出了8和11個(gè)陽性樣本。4種表面中，未添加李斯特菌屬的表面兩種方法的結(jié)果均為陰性，添加高菌量的表面兩種方法的結(jié)果均為陽性。所有Veriflow LS的結(jié)果都經(jīng)參考方法確認(rèn)，無假陽性和假陰性。同時(shí)，POD的分析結(jié)果顯示，Veriflow LS系統(tǒng)和參考方法的結(jié)果均不存在顯著性差異。

4.4 即食食品樣品結(jié)果對(duì)比

添加3個(gè)不同濃度李斯特菌屬的即食食品分析結(jié)果顯示：Veriflow LS系統(tǒng)方法和參考方法在20個(gè)低污染的熟火雞肉樣品（0.22CFU/125g）中分別檢出了8例和7例陽性，20個(gè)低污染的熱狗樣品中各自都檢出了13例陽性。兩種即食食品中，未添加李斯特菌屬的樣品兩種方法的結(jié)果均為陰性，添加高菌量的樣品兩種方法的結(jié)果均為陽性。所有Veriflow LS的結(jié)果都經(jīng)參考方法確認(rèn)，無假陽性和假陰性結(jié)果。同時(shí)，POD的分析結(jié)果（見表3）顯示，Veriflow LS系統(tǒng)的結(jié)果和參考方法的結(jié)果不存在顯著性差異。

5 討論與結(jié)論

本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與傳統(tǒng)參考方法相比較，Veriflow LS檢測(cè)系統(tǒng)在檢測(cè)環(huán)境（不銹鋼、混凝土、塑料和陶瓷的表面）和即食食品（熱狗和熟火雞肉）中李斯特菌屬時(shí)具有很好的特異性、準(zhǔn)確性和可靠性。6種基質(zhì)的POD值數(shù)據(jù)分析均顯示，Veriflow LS系統(tǒng)方法的和參考方法的性能不存在顯著性差異。高特異性（包容性和排他性）也是本次驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)成功的關(guān)鍵之一，特異性試驗(yàn)的結(jié)果顯示，Veriflow LS系統(tǒng)能準(zhǔn)確無誤的識(shí)別出樣品李斯特菌屬而不受其他非李斯特屬的雜菌的干擾，有效提高檢出率。

Veriflow LS李斯特菌屬檢測(cè)系統(tǒng)無需復(fù)雜的前增菌過程，也無需復(fù)雜的前處理（無需DNA提純），且經(jīng)多種表面樣品（海綿棒或拭子采樣）和食品基質(zhì)的驗(yàn)證，具有良好的準(zhǔn)確度，可為終端用戶提供靈活便捷的使用體驗(yàn)。同時(shí)，相較于參考方法中冗長的實(shí)驗(yàn)流程（參考方法需3～4天的檢測(cè)時(shí)間），Veriflow LS檢測(cè)系統(tǒng)能節(jié)省大量的時(shí)間—只需24小時(shí)的前增菌和2小時(shí)的擴(kuò)增時(shí)間即可獲得準(zhǔn)確的結(jié)果。批次間的穩(wěn)定性測(cè)試也表明，Veriflow LS的試劑盒是具有重復(fù)性好、耐用和生產(chǎn)質(zhì)量穩(wěn)定等優(yōu)點(diǎn)的李斯特菌屬檢測(cè)試劑盒。本次實(shí)驗(yàn)的結(jié)果也表明，操作簡(jiǎn)單的Veriflow LS檢測(cè)系統(tǒng)可以提供一種靈敏、可靠和易用的環(huán)境樣品和食品基質(zhì)中的李斯特菌屬的檢測(cè)方法。endprint