真菌毒素快速檢測(cè)技術(shù)

真菌毒素，又稱(chēng)霉菌毒素，是真菌在食品或飼料里生長(zhǎng)所產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物，對(duì)人類(lèi)和動(dòng)物都有害。真菌毒素可通過(guò)飲食進(jìn)入人或動(dòng)物體內(nèi)，引起人或動(dòng)物的急性或慢性中毒，進(jìn)而損害機(jī)體，造成肝臟、腎臟及神經(jīng)組織等的傷害。

真菌毒素主要包括黃曲霉毒素、嘔吐毒素、玉米赤霉烯酮赭曲霉毒素等。1960年，英國(guó)10萬(wàn)多只火雞因食用被黃曲霉毒素污染的飼料而死亡，此事件發(fā)生后，真菌毒素才逐漸引起人們的重視。受全球氣候變暖、干旱等因素的影響，食用和飼用農(nóng)產(chǎn)品受真菌毒素污染的現(xiàn)象日趨嚴(yán)重，世界各地對(duì)于真菌毒素污染的報(bào)道也日漸增多，玉米、小麥、大麥、花生等谷物以及干果、水果、中藥材、牛奶等都容易被真菌毒素污染。因此，為減少霉菌污染，真菌毒素檢測(cè)手段必不可少，本文全面介紹了真菌毒素的常規(guī)檢測(cè)和快速檢測(cè)方法。

真菌毒素的常規(guī)檢測(cè)方法

液相色譜或液質(zhì)聯(lián)用法：高效液相色譜法（High Performance Liquid Chromatography，HPLC）和液相-質(zhì)譜聯(lián)用法（LC-MS/MS）具有分辨率高、準(zhǔn)確性好、靈敏度高、檢測(cè)限低等優(yōu)點(diǎn)。目前，我國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)或行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)中使用較多的也是高效液相色譜法，其中反相高效液相色譜法較為常用，其流動(dòng)相主要為甲醇、乙腈和水或三者組成的混合溶液。HPLC可結(jié)合多種檢測(cè)器，如紫外檢測(cè)器（uv）、二極管陣列檢測(cè)器（DAD）、熒光檢測(cè)器（FLD）、質(zhì)譜檢測(cè)器（MS）以及電化學(xué)檢測(cè)器（EC）等。

薄層色譜法：又叫薄層層析法（Thin Layer Chromatography，TLC），1968年AOAC首次提出利用微柱、薄層色譜法測(cè)定花生和花生制品中的黃曲霉毒素，此后許多國(guó)家也采用此法作為標(biāo)準(zhǔn)方法，它也是我國(guó)的標(biāo)準(zhǔn)方法。TLC根據(jù)真菌毒素能在紫外區(qū)域發(fā)出特殊熒光的特點(diǎn)來(lái)檢測(cè)真菌毒素，樣品經(jīng)過(guò)提取、柱層析、洗脫、濃縮及TLC分離后，在特定波長(zhǎng)紫外燈下照射，可觀察到熒光。

氣相色譜法：一種強(qiáng)大的分離技術(shù)，被廣泛應(yīng)用于各類(lèi)物質(zhì)的精確定量檢測(cè)，但由于許多真菌毒素都是極性化合物，在進(jìn)入氣相色譜柱前需要采用一定的方式進(jìn)行衍生，因而其在真菌毒素檢測(cè)中的應(yīng)用并不廣泛，目前應(yīng)用氣相色譜法檢測(cè)最多的真菌毒素是玉米赤霉烯酮。

真菌毒素的快速檢測(cè)方法

快速檢測(cè)真菌毒素一般采用免疫分析方法，此方法的理論基礎(chǔ)為抗原抗體的特異性結(jié)合，主要包括放射免疫分析方法（RIA）、酶聯(lián)免疫法（ELISA）和免疫層析法等。但因RIA需要使用同位素標(biāo)記，有放射性污染，并且需要用到專(zhuān)門(mén)的儀器，故而，酶聯(lián)免疫法（ELISA）和免疫層析法應(yīng)用更為廣泛。

酶聯(lián)免疫技術(shù)：酶聯(lián)免疫吸附劑測(cè)定法，簡(jiǎn)稱(chēng)酶聯(lián)免疫法（ELISA），是20世紀(jì)70年代發(fā)展起來(lái)的免疫檢測(cè)技術(shù)，有直接法、間接法、雙抗體夾心法等。雖然ELISA有多種模式，但基本原理和操作方法是相同的。首先將抗原或抗體固定到某種固相載體上（現(xiàn)在多為酶標(biāo)板），并保持其免疫活性，然后將待測(cè)樣品和酶標(biāo)物（酶標(biāo)抗體或酶標(biāo)抗原）按不同步驟與固定的抗原或抗體進(jìn)行反應(yīng)，再然后將沒(méi)有發(fā)生反應(yīng)的物質(zhì)洗去，最后加入酶的底物。底物在酶的催化下顯色，最終通過(guò)顯色程度進(jìn)行定性或定量測(cè)定。ELISA可把抗原抗體免疫反應(yīng)與酶的高效催化作用原理結(jié)合起來(lái)，因此具有選擇性強(qiáng)、靈敏度高、時(shí)間短、檢測(cè)限低等特點(diǎn)。

目前，市場(chǎng)上真菌毒素類(lèi)酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒種類(lèi)與規(guī)格繁多，樣品前處理方法也較為多樣化。北京普贊生物技術(shù)有限公司（以下簡(jiǎn)稱(chēng)“普贊生物”）自成立至今一直致力于真菌毒素快速檢測(cè)方法的研究，目前已成功研制出黃曲霉毒素B1、黃曲霉毒素M1、嘔吐毒素、玉米赤霉烯酮、伏馬毒素、T2毒素、赭曲霉毒素等酶聯(lián)免疫試劑盒。與其他同類(lèi)產(chǎn)品相比，普贊生物的產(chǎn)品操作更為簡(jiǎn)便快速，40分鐘左右即可完成樣品檢測(cè)并收集結(jié)果數(shù)據(jù)，回收率可達(dá)90%～110%，產(chǎn)品靈敏度和檢測(cè)限均處于國(guó)內(nèi)領(lǐng)先地位，尤其是黃曲霉毒素B1酶聯(lián)免疫試劑盒，靈敏度可達(dá)0.01ppb。

免疫層析法：免疫層析法（immunochromatography）是近年來(lái)國(guó)內(nèi)外新興的一種快速診斷技術(shù)，其原理是將特異抗體先固定于硝酸纖維素膜的某一區(qū)帶，當(dāng)干燥的硝酸纖維素一端浸入樣品后，由于毛細(xì)管作用，樣品將沿著膜向前移動(dòng)，當(dāng)移動(dòng)至固定有抗體的區(qū)域時(shí)，樣品中相應(yīng)的抗原即與該抗體發(fā)生特異性結(jié)合，通過(guò)免疫膠體金或免疫酶染色可使該區(qū)域顯示一定的顏色，從而實(shí)現(xiàn)特異性的免疫診斷。

目前，膠體金檢測(cè)技術(shù)廣泛應(yīng)用于真菌毒素類(lèi)物質(zhì)的檢測(cè)，其具有的低成本、操作簡(jiǎn)便、快速準(zhǔn)確等特點(diǎn)已被用戶(hù)及國(guó)家相關(guān)部門(mén)認(rèn)可。組裝成條的膠體金檢測(cè)卡如圖2所示，在一長(zhǎng)條形的背板上按從左至右的順序貼上樣品墊、金標(biāo)墊、硝酸纖維素膜（NC膜）及吸水墊。NC膜上偶聯(lián)有待測(cè)物的抗原（測(cè)試線，test line，T線）以及二抗（對(duì)照線，control line，C線），將抗體偶聯(lián)納米級(jí)的金顆粒放置在金標(biāo)墊上。從樣品墊處滴加樣品，開(kāi)始反應(yīng)后，隨著樣品液的流動(dòng)，偶聯(lián)抗體的金顆粒流向抗原處，當(dāng)抗原抗體結(jié)合使偶聯(lián)的金顆粒聚焦到一定數(shù)量時(shí)，即可形成肉眼可見(jiàn)的紅色條帶。而當(dāng)加樣的液體中也含有待測(cè)物時(shí)，則固定在固相載體上的抗原與樣品中的抗原競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合待測(cè)物抗體，從而使NC上聚焦的金顆粒數(shù)目減少，進(jìn)而使紅色條帶變淺直至無(wú)色。利用以上特性，可以在很短的時(shí)間內(nèi)檢測(cè)到ng/mL級(jí)的各種真菌毒素。

免疫學(xué)檢測(cè)的基礎(chǔ)是抗原抗體的特異性識(shí)別能力，這也是檢測(cè)產(chǎn)品質(zhì)量好壞的根本技術(shù)。普贊生物經(jīng)過(guò)多年的不懈努力，不斷篩選、合成和優(yōu)化出各種真菌毒素類(lèi)特異性抗原和抗體，并研制生產(chǎn)出相應(yīng)的真菌毒素類(lèi)檢測(cè)卡，不僅具有快速、靈敏度高、特異性強(qiáng)、穩(wěn)定性好、操作簡(jiǎn)便等特點(diǎn)，而且無(wú)需任何儀器設(shè)備，結(jié)果判斷直觀可靠，適用于現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)。其中，黃曲霉毒素B1和M1檢測(cè)卡靈敏度可達(dá)到0.5ppb，赭曲霉毒素檢測(cè)卡靈敏度為5ppb，嘔吐毒素檢測(cè)卡靈敏度為200ppb，玉米赤霉烯酮檢測(cè)卡靈敏度為20ppb。

使用膠體金檢測(cè)卡進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，大部分時(shí)間都用在樣品的前處理上，所以提高樣品前處理效率可以在很大程度上緩解檢測(cè)人員的壓力并降低成本。以食用油樣品為例，植物油容易受到黃曲霉毒素污染，其中又以花生油和玉米油更為嚴(yán)重，市場(chǎng)上黃曲霉毒素B1檢測(cè)卡檢測(cè)植物油時(shí)樣品前處理流程一般為樣品收集、提取液提取、氮吹、復(fù)溶、檢測(cè)，完成整個(gè)流程一般需要0.5～1小時(shí)，并需配備氮吹儀，此外復(fù)雜的前處理往往會(huì)導(dǎo)致檢測(cè)效果不理想。普贊生物針對(duì)這些問(wèn)題研制出了食用油專(zhuān)用的黃曲霉毒素B1檢測(cè)卡，無(wú)需吹干復(fù)溶等處理，每個(gè)樣品處理只需2～5分鐘，具有精確度高、前處理簡(jiǎn)單、檢測(cè)所需時(shí)間短等優(yōu)點(diǎn)。

展望

目前，國(guó)內(nèi)外都有各類(lèi)真菌毒素快速檢測(cè)產(chǎn)品，從質(zhì)量和技術(shù)上講，國(guó)內(nèi)公司生產(chǎn)的酶聯(lián)免疫試劑盒和膠體金檢測(cè)卡與進(jìn)口產(chǎn)品的差距越來(lái)越小，甚至部分指標(biāo)已經(jīng)超越進(jìn)口產(chǎn)品，畜牧相關(guān)行業(yè)和監(jiān)管部門(mén)也已高度認(rèn)可了這兩類(lèi)檢測(cè)產(chǎn)品。雖然大部分用戶(hù)的檢測(cè)需求得到了基本滿足，但是由于各類(lèi)用戶(hù)待測(cè)樣品有所差異，所以檢測(cè)效果和效率仍不能得到最大程度的保證，也就是說(shuō)單獨(dú)的檢測(cè)卡、試劑盒產(chǎn)品還不能真正解決用戶(hù)的檢測(cè)問(wèn)題，合適且具有針對(duì)性的定制化服務(wù)水平仍待提高。endprint