AtPHO2的CRISPR/Cas9靶向敲除及其在擬南芥中功能分析

王釗輝， 石超男， 楊天嘯， 薛亞東， 孫虎威， 唐貴良， 張戰(zhàn)輝

(河南農(nóng)業(yè)大學農(nóng)學院，河南 鄭州 450002)

AtPHO2的CRISPR/Cas9靶向敲除及其在擬南芥中功能分析

王釗輝， 石超男， 楊天嘯， 薛亞東， 孫虎威， 唐貴良， 張戰(zhàn)輝

(河南農(nóng)業(yè)大學農(nóng)學院，河南 鄭州 450002)

利用CRISPR/Cas9 基因編輯技術(shù)對AtPHO2進行精確編輯，在擬南芥轉(zhuǎn)基因后代中篩選到3個Atpho2陽性突變體。突變體中AtPHO2的表達量下降了10 倍。對獲得突變體的表型及無機磷含量變化進行分析，結(jié)果表明，突變體葉片衰老速度明顯快于野生型，突變體葉片無機磷含量是野生型的2～4倍。隨著衰老進程的推移，地上部新葉中無機磷含量逐漸增加，突變體中由于磷代謝途徑受阻而大量積累。本研究也表明，AtPHO2不僅可能通過磷代謝調(diào)控來響應非生物脅迫，而且與擬南芥的衰老進程存在緊密聯(lián)系。

擬南芥；基因組編輯技術(shù)；規(guī)律成簇短回文重復序列；泛素結(jié)合酶24；磷代謝

磷是植物生長發(fā)育過程中所必需的營養(yǎng)元素之一，不僅是核酸、磷脂等生物大分子的主要組分，而且參與了能量轉(zhuǎn)移、酶促反應、代謝調(diào)控等途徑。盡管磷元素在植物生活史的各階段中均具有不可替代作用，而且土壤中的總磷含量豐富[1-2]，但自然界中大部分磷元素處于被吸附、沉淀或有機磷狀態(tài)，不能被植物直接利用[3-4]。經(jīng)過長期的進化與自然選擇，植物在低磷或缺磷條件下會產(chǎn)生一系列應激反應，以增加磷的吸收，保證植物的正常生長發(fā)育[5]。目前，相關(guān)研究已鑒定到一定數(shù)量參與低磷或缺磷應激反應的重要基因，如SIZ1[6]，PHR1[7]，PHO2[8]，PHT1[9]，NLA[10-11]等。其中PHO2編碼1個含有UBC結(jié)構(gòu)域的泛素結(jié)合酶E2(UBC24)，負責調(diào)控磷元素的吸收與轉(zhuǎn)運[12-14]。但該基因調(diào)控擬南芥磷代謝和磷逆境響應的分子機制還不清楚。

近20 a來，隨著基因組編輯技術(shù)迅速發(fā)展，如ZFNs(Zinc Finger Nucleases)[15-17],TALENs (Transcription Activator Like Effector Nucleases)[18]，以及CRISPR/Cas9(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats / CRISPR-associated 9)[19-20]等技術(shù)相繼被開發(fā)和利用。這些編輯技術(shù)都可以特異識別靶基因序列，通過核酸酶的剪切產(chǎn)生DNA 的雙鏈斷裂，并激活細胞自身的修復機制。生物細胞在修復過程中，損傷DNA 以非同源末端連接(Non Homologous Ending Joining，NHEJ)或同源重組(Homologous Recombination，HR)兩種不同的機制進行修復，其中NHEJ 修復可以產(chǎn)生單堿基的插入缺失，或者在缺口處引入小片段的插入或缺失，最終由于發(fā)生移碼、插入缺失等突變而影響基因表達[18,21]。CRISPR/Cas9 系統(tǒng)中，sgRNA 是具有特殊結(jié)構(gòu)的小RNA，通常由RNA 聚合酶Ⅲ轉(zhuǎn)錄、U3/U6 系列啟動子驅(qū)動[22-23]，與靶位點特異性結(jié)合并引導Cas9 蛋白對靶位點的剪切。sgRNA 序列較短，便于設計和載體構(gòu)建，CRISPR/Cas9技術(shù)的這一特性，使其構(gòu)建簡便、易操作和高效率，也推動了該技術(shù)的廣泛應用[22-25]。本研究將利用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)，靶向敲除AtPHO2 基因，獲得新的crispr-Atpho2 突變體，并分析基因表達和其對磷代謝的影響，為CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)在作物遺傳改良方面提供理論和技術(shù)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料與生長環(huán)境

本研究所用植物材料為擬南芥Col-0 生態(tài)型。擬南芥種子先用75% 的乙醇預消毒3 min，再用10% 次氯酸鈉消毒10 min，最后用無菌水清洗3～5次，點播于1/2 MS培養(yǎng)基，4 ℃條件下春化3 d，然后置于植物培育箱，在24 ℃光照16 h和20 ℃黑暗8 h條件下進行培養(yǎng)。子葉完全展開時移栽到營養(yǎng)土中，置于人工氣候室，生長條件為21 ℃光照14 h和19 ℃黑暗10 h 。本研究所用大腸桿菌菌株DH 5α由作者保存。CRISPR載體pHSN401及農(nóng)桿菌菌株GV3101由中國農(nóng)業(yè)大學陳其軍等[26-27]提供(圖 1)。

注：A，CRISPR/Cas9載體pHSN401；B，擬南芥轉(zhuǎn)化輔助質(zhì)粒pSoup；C，AtPHO2-CRISPR/Cas9重組載體構(gòu)建示意圖。

Notes: A, CRISPR/Cas9 vector pHSN401; B, Helper plasmid ofArabidopsistransformation; C, The diagram ofAtPHO2-CRISPR/Cas9 recombinant vector.

圖1AtPHO2-CRISPR/Cas9基因編輯載體及重組載體構(gòu)建示意圖
Fig.1Geneeditingvectorandthediagramofrecombinantvector

1.2 AtPHO2-CRISPR/Cas9 植物雙元表達載體的構(gòu)建及擬南芥遺傳轉(zhuǎn)化

sgRNA由靶位點序列和sgRNA scaffold兩部分組成，sgRNA scaffold序列是一段特殊結(jié)構(gòu)的小RNA；而靶位點序列的組成結(jié)構(gòu)為5′-AN19NGG-3′(N代表任意堿基)，sgRNA 特異識別靶基因中的NGG序列并引導Cas9蛋白對靶基因酶切。為提高CRISPR/Cas9基因組編輯技術(shù)的基因編輯效率，根據(jù)以下原則設計靶位點序列：靶位點序列在PAM 位點上游約20 個堿基；GC含量為50%～65%；Tm值在50～60 ℃，且正/反義鏈的Tm相差不超過3 ℃；靶位點在基因或功能域的5′端；不含特殊結(jié)構(gòu)[26]。通過Cas-OFFinder (http://www.rgenome.net/cas-offinder/)對所設計的靶位點序列進行特異性檢測，篩選到AtPHO2高度特異的靶位點序列。然后，在靶序列及其互補序列的的5′分別添加attg和aaac，得到靶向敲除AtPHO2載體構(gòu)建的引物序列。根據(jù)基因編輯靶位點序列分別設計PCR檢測引物、轉(zhuǎn)基因陽性苗檢測引物、基因突變位點檢測引物和基因表達定量引物(表1，在北京奧科鼎盛生物科技有限公司和生工生物工程(上海)股份有限公司完成引物合成與測序)。

AtPHO2-CRISPR/Cas9植物雙元表達載體構(gòu)建(圖 1 C)。首先，靶位點序列的正/反向引物等量混合，65 ℃保溫5 min，退火生成5′分別含有黏性末端的雙鏈DNA片段。同時，用限制性內(nèi)切酶BsaI(NEB)對pHSN401載體進行酶切(酶切體系如表 2 )。然后，純化的酶切產(chǎn)物與退火生成的雙鏈DNA片段進行連接(表3)。連接反應產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌，挑取單克隆，PCR擴增法及測序法鑒定重組子，采用凍融法[28]將陽性重組子轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌GV3101，并進行菌落PCR驗證。GV3101在含有Kan 50 mg·L-1，Rif 30 mg·L-1，Tet 20 mg·L-1

(上海生工生物)3 種抗生素的LB培養(yǎng)基上劃線培養(yǎng)2 d，收集農(nóng)桿菌并將菌液稀釋至OD600≈0.8，以備植物遺傳轉(zhuǎn)化。用收集的菌液侵染盛花期擬南芥花序[22]，待莢果完全成熟，收獲轉(zhuǎn)基因種子(T0)。T0代種子在含抗生素潮霉素(Hyg，30 mg·L-1；Roche)的1/2 MS 培養(yǎng)基上進行篩選，陽性單株移栽到基質(zhì)中進行溫室培養(yǎng)和表型鑒定。

表1 AtPHO2-CRISPR/Cas9植物雙元表達載體構(gòu)建及鑒定引物Table 1 The primer sequences of construction and identification of AtPHO2-CRISPR/Cas9

表2 pHSN401-BsaI酶切體系Table 2 The reaction system for pHSN401-BsaI restriction enzyme cutting

表3 AtPHO2-CRISPR/Cas9雙元載體構(gòu)建的連接體系Table 3 The reaction system for AtPHO2-CRISPR/Cas9 binary vector ligation

1.3 crispr-Atpho2 突變體的篩選與突變體鑒定

利用CTAB法提取crispr-Atpho2 突變體及野生型擬南芥葉片基因組DNA[29]，通過PCR擴增的方法篩選陽性突變體。然后，對陽性突變體及野生型進行PCR 產(chǎn)物測序，鑒定AtPHO2的突變類型。

參照BARI等[13]熒光定量PCR方法分析crispr-Atpho2突變體和野生型中AtPHO2 的表達差異。利用Trizol法(康為世紀)分別提取苗齡為生長50 d的突變體及野生型植株新生葉片的總RNA，以備qRT-PCR分析。采用反轉(zhuǎn)錄試劑盒TARAKA PrimeScriptTMRT Reagent Kit with gDNA Eraser(TARAKA)對提取的總RNA 進行反轉(zhuǎn)錄，合成cDNA；以合成的cDNA為模板，以actin2為內(nèi)參，對AtPHO2 基因進行熒光定量分析。熒光定量PCR在BioRad CFX96TM(BioRad)熒光定量PCR儀上運行：95 ℃, 10 min→95 ℃, 15 s;60 ℃, 30 s;39個循環(huán)→95 ℃, 5 s→65 ℃, 5 s → 95 ℃, 5 s→4 ℃保溫。每個樣品3 次重復，用2-ΔΔCt法計算AtPHO2相對表達量。

植物組織無機磷含量測定參照AMES等[30]及CHIOU等[31]改進的鉬酸銨法進行，分析生長35 d和50 d的crispr-Atpho2突變體及野生型的無機磷含量。取新鮮的地上部分，在液氮中充分研磨，用于無機磷含量測定。每個材料設置5個生物學重復，3個技術(shù)重復。

2 結(jié)果與分析

2.1 植物AtPHO2-CRISPR/Cas9雙元表達載體構(gòu)建與驗證

本研究對AtPHO2 進行序列分析，在外顯子區(qū)段篩選到5個候選靶位點，經(jīng)過Cas-OFFinder 對候選靶位點序列的特異性分析，位于AtPHO2UBC結(jié)構(gòu)域的3′端的1個候選靶位點序列較為合適，5′端分別添加BsaI的黏性末端，作為sgRNA的靶位點序列(表 1)。

靶位點序列的正/反向引物經(jīng)過退火復性，生成雙鏈DNA 片段，通過T4DNA連接酶與BsaI酶切產(chǎn)物BsaI-pHSN401 進行連接，并轉(zhuǎn)化大腸桿菌。挑取大腸桿菌單克隆，經(jīng)過特異性引物pHSN401_VF/R檢測，結(jié)果表明，所挑取的6個單克隆均為陽性，其靶位點序列已經(jīng)與載體CRISPR/Cas9發(fā)生了重組(圖2A)。重組載體的質(zhì)粒測序及序列分析表明，構(gòu)建的載體是正確的，靶位點序列已插入到載體pHSN401(圖2B)。重組載體的質(zhì)粒-80 ℃條件下保存，以備用于農(nóng)桿菌GV3101轉(zhuǎn)化。

標注：A ,菌落PCR；V，表示空載體；泳道1～6表示菌落PCR。B,PCR測序，下劃線部分表示AtPHO2基因靶的gRNA序列。M，2kb DNA標記。

Notes: A, Colony PCR； V, vector; Lanes 1 to 6, colony PCR. B, sequence of PCR, gRNA sequence ofAtPHO2 gene is under lined. M, 2kb DNA marker.

圖2AtPHO2-CRISPR/Cas9重組載體鑒定
Fig.2IdentificationofAtPHO2-CRISPR/Cas9recombinantbinaryvector

注：M，2kb DNA；泳道1，質(zhì)粒轉(zhuǎn)化GV3101；泳道2，重組質(zhì)粒。

Notes: M, 2kb DNA marker; Lane 1, Transformed GV3101; Lane 2, Recombination plasmid.

圖3AtPHO2-CRISPR/Cas9重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌鑒定

Fig.3IdentificationofAtPHO2-CRISPR/Cas9recombinantplasmidagrobacteriumtransformation

2.2 AtPHO2-CRISPR/Cas9雙元表達載體的擬南芥遺傳轉(zhuǎn)化與crispr-Atpho2 突變體篩選

AtPHO2-CRISPR/Cas9雙元表達載體利用凍融法轉(zhuǎn)化的農(nóng)桿菌經(jīng)過抗性篩選，挑取單克隆，進行菌落PCR 檢測。檢測結(jié)果表明，所挑取的1 個單克隆中AtPHO2-CRISPR/Cas9重組子已成功導入農(nóng)桿菌中(圖 3)，可以用于擬南芥侵染。

重組子AtPHO2-CRISPR/Cas9轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌后，利用農(nóng)桿菌介導的花序浸染法進行擬南芥遺傳轉(zhuǎn)化。遺傳轉(zhuǎn)化獲得的T0代種子，在1/2 MS培養(yǎng)基上進行潮霉素抗性篩選。移栽獲得的陽性轉(zhuǎn)基因植株并放置于人工氣候室培養(yǎng)，用于陽性轉(zhuǎn)基因植株的突變位點、突變類型及表型鑒定。通過對轉(zhuǎn)基因陽性植株的PCR 產(chǎn)物測序，測序的轉(zhuǎn)基因陽性植株包含2種突變體：一種是AtPHO2靶位點處插入1 個堿基(A)，2 條同源染色體均發(fā)生突變的純合子Atpho2-2/7(圖4A及表 4)；另一種是AtPHO2僅在2條同源染色體中的一條發(fā)生突變的雜合子。為了進一步鑒定突變體雜合子的突變類型，利用LIU 等[32]開發(fā)的CRISPR/Cas9 突變體序列分析工具DSDecode(http://dsdecode.scgene.com/)對雜合子突變體進一步分析，結(jié)果表明，雜合子Atpho2-3是由于反義鏈插入1 個堿基(A)(表 4)，正義鏈未發(fā)生突變；而雜合子Atpho2-5 的正義鏈與反義鏈分別插入1 個堿基(A)與2 個堿基(AG)(表 4)。

通過對crispr-Atpho2 突變體的表型分析發(fā)現(xiàn)，突變體與野生型在幼苗期葉片的顏色及生長狀況的差異不明顯。營養(yǎng)生長向生殖生長轉(zhuǎn)變時期(35 d)，突變體植株部分葉片邊緣出現(xiàn)了明顯的黃化現(xiàn)象，野生型植株并未出現(xiàn)衰老的跡象(圖4B)。生殖生長期(50 d)的突變體植株大部分葉片出現(xiàn)了較為嚴重的黃化及壞死等磷毒害現(xiàn)象，而野生型植株葉片則呈現(xiàn)輕微的黃化現(xiàn)象(圖4B)。對生殖生長期突變體及野生型擬南芥相同葉位的葉片進行比較，同一葉位的葉片在突變體中黃化與壞死的癥狀明顯比野生型嚴重(圖4C)。

2.3 擬南芥AtPHO2表達量檢測

熒光定量PCR 分析結(jié)果表明，野生型擬南芥中AtPHO2 的相對表達量約是雜合突變體的3倍，是純合突變體相對表達量的10 倍；雜合及純合突變體表達量與野生型相比，差異均達到極顯著水平(圖 5)。進一步對突變體中純合子及雜合子AtPHO2 的表達量差異分析，結(jié)果表明，雜合子AtPHO2 的相對表達量約是純合子的3倍，差異達到極顯著水平(P<0.01)(圖5)。

注：A，crispr-Atpho2 突變體與野生型(WT)的序列對比，紅線表示PAM 位點；B，生長35 d和50 d擬南芥葉片磷毒害表型；C，生長50 d蓮座葉磷毒害表型；1～7，表示不同葉位的擬南芥葉片。

Notes: A, Blast ofcrispr-Atpho2 mutant and wild type (WT) , red line indicate the PAM sequence; B, P toxic ofcrispr-Atpho2 mutant and WT at 35 and 50 d; C, P toxic phenotype of plant leaves at 50 d; 1 to 7, indicated the leaf position ofArabidopsis.

圖4 擬南芥crispr-Atpho2突變體鑒定

注：下劃線字母表示靶位點中插入的堿基。

Notes: The underlined letters indicate the inserted base in the target site.

2.4 擬南芥無機磷含量的測定

對擬南芥突變體和野生型葉片組織的無機磷含量進行測定，結(jié)果顯示，生長35 d的擬南芥野生型葉片無機磷含量約為9 mol·g-1，crispr-Atpho2雜合以及純合突變體葉片中無機磷含量分別為25和27 mol·g-1，是野生型葉片無機磷含量的3倍左右，差異均達到極顯著水平(P<0.01)。生長50 d的野生型擬南芥葉片無機磷含量約為35 mol·g-1，crispr-Atpho2雜合以及純合突變體葉片中無機磷含量分別為60和100 mol·g-1，是野生型葉片無機磷含量的2倍和4倍，差異均達到極顯著水平(P<0.01)(圖 6)。

圖5 crispr-Atpho2 突變體AtPHO2相對表達量分析Fig.5 Detection of AtPHO2 gene expression in crispr-Atpho2 mutants

圖6 crispr-Atpho2突變體與野生型擬南芥生長35和50 d時葉片無機磷含量測定Fig.6 Pi content of crispr-Atpho2 mutant and wild type Arabidopsis on 35 and 50 d

3 結(jié)論與討論

本研究通過對野生型及crispr-Atpho2突變體的Cas9蛋白靶位點的基因組DNA的測序和表型分析，結(jié)果表明，crispr-Atpho2突變體葉片黃化及壞死等磷毒害相關(guān)表型可能是由于Cas9蛋白在AtPHO2的靶位點處進行了剪切，細胞在自我修復過程中發(fā)生插入突變引起的。進一步對crispr-Atpho2突變體及野生型擬南芥AtPHO2基因表達差異結(jié)果分析表明，crispr-Atpho2純合突變體與雜合突變體及野生型擬南芥基因表達量差異極顯著，可能是由于在突變體的基因AtPHO2靶位點中插入1 個堿基(A)，引起移碼突變，最終引起突變體及野生型AtPHO2基因表達量的差異變化。通過對擬南芥crispr-Atpho2突變體及野生型2個生育時期新鮮葉片的無機磷含量的測定發(fā)現(xiàn)，crispr-Atpho2雜合以及純合突變體的葉片無機磷含量是野生型的2～4倍。齊敏興等[33]在研究供磷水平與苜蓿光合作用時發(fā)現(xiàn)，葉面積、葉片數(shù)和株高等都與植株的磷含量有關(guān)，當磷含量超過植物自身的磷元素需求量時會產(chǎn)生葉片黃化、壞死，抑制植株生長等磷過量毒害癥狀。這與本研究中擬南芥Atpho2突變體的表型相似。AUNG等[8]研究表明，磷元素在Atpho2突變體中大量積累是由于AtPHO2編碼的泛素結(jié)合酶UBC24的第671個氨基酸發(fā)生了終止突變，即由色氨酸(TGG)轉(zhuǎn)變?yōu)榻K止密碼子(TAG)，最終導致UBC24失去功能。而AtPHO2是通過泛素化途徑，調(diào)控下游基因磷酸鹽轉(zhuǎn)運蛋白，由于AtPHO2發(fā)生了突變，導致磷酸鹽的吸收及轉(zhuǎn)運不受調(diào)控，打破磷的代謝平衡，磷酸鹽在地上部持續(xù)積累，引起植株早衰。本研究中，crispr-Atpho2突變體的第8 個外顯子編碼鏈插入了1個堿基(T)，使AtPHO2的閱讀框發(fā)生移碼突變，最終導致AtPHO2失去活性。野生型中AtPHO2編碼907 個氨基酸，其中，第770個氨基酸是異亮氨酸，而crispr-Atpho2突變體的第770 個氨基酸發(fā)生異亮氨酸的同義突變，從第771 個氨基酸開始移碼，并且在第784 個氨基酸由谷氨酸(GAG)轉(zhuǎn)變?yōu)榻K止密碼子(TGA)，造成AtPHO2的翻譯過早終止，生成功能缺失的蛋白質(zhì)。AtPHO2的表達受抑制，造成磷酸轉(zhuǎn)運蛋白不能通過泛素化途徑被降解。植株地上部分最終積累大量無機磷，加速了其衰老進程。

PHO2除了在植物磷代謝調(diào)控中起到關(guān)鍵作用。敲除或干擾PHO2的表達，在不同的植物會產(chǎn)生不同的影響。擬南芥中，過量施用磷肥或植株中積累大量磷元素，也會產(chǎn)生與本研究Atpho2突變體相似的黃化等早衰現(xiàn)象[34]。水稻中，敲除OsPHO2基因?qū)е铝自卦诘厣喜窟^量積累，生長發(fā)育延遲[35]。OUYANG等[35]在普通小麥中敲除TaPHO2-A1，低磷時能促進磷的吸收而增加小麥產(chǎn)量；高磷時對小麥產(chǎn)量沒有明顯影響，這就為小麥等作物新品種選育提供可靠的理論依據(jù)。此外，PHO2還與非生物脅迫相關(guān)。PACAK等[37]的結(jié)果顯示，高溫脅迫使大麥地上部分HvPHO2表達量降低，從而增加磷的吸收，并反饋調(diào)控磷代謝相關(guān)基因的表達來響應高溫脅迫。KIM等[31]研究表明，AtPHO2可通過調(diào)控TWINSISTEROFFT(TSF)的表達來影響開花，但該調(diào)控途徑同時受控于外界溫度的變化。這不僅表明PHO2的生物學功能在單子葉與雙子葉間存在差異，而且PHO2基因功能具有冗余性。

本研究成功地運用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)，產(chǎn)生了新的Atpho2突變體，為進一步研究PHO2在磷代謝精細調(diào)控、脅迫響應等方面的研究提供了新的突變體材料。

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GeneknockoutandfunctionalanalysisofAtPHO2byCRISPR/Cas9-inducedmutagenesis

WANG Zhaohui, SHI Chaonan, YANG Tianxiao，XUE Yadong, SUN Huwei, TANG Guiliang, ZHANG Zhanhui

(College of Agronomy， Henan Agricultural University， Zhengzhou 450002， China)

We constructed CRISPR/Cas9-mediatedAtPHO2 knock-out vector, then transformed inArabidopsis. In the transgenic descendants, threeAtpho2 positive mutants were screened. In the transgenic mutant, the gene expression ofAtPHO2 was significantly down-regulated, only one in ten of the wild type. The phosphorus contents in mutants and in the wild types were tested, the results of which revealed that Pi gradually accumulated in the new leaves with the aging process. The leaf phosphorus contents of the mutantAtpho2 were 2～4 times for the wild type. The results implied that more phosphorus accumulated inAtpho2 mutants for the phosphorus metabolism blocking. Additionally,AtPHO2 is probably associated with abiotic stress through regulating phosphorus metabolism andArabidopsissenescence.

Arabidopsis; genome editing technology; CRISPR/Cas9; UBC24; phosphorus homeostasis

2016-12-30

省部共建小麥玉米作物學國家重點實驗室項目(39990002)

王釗輝(1989-)，男，河南魯山人，碩士研究生，主要從事玉米遺傳育種研究。

張戰(zhàn)輝(1984-)，男，河南伊川人，講師，博士。

1000-2340(2017)04-0554-07

Q 754

A

(責任編輯：常思敏)