抑制劑BYL719防治卵巢切除致骨質(zhì)疏松癥的研究

何曉剛

上海策乘生物技術(shù)服務(wù)公司(上海，200437)

抑制劑BYL719防治卵巢切除致骨質(zhì)疏松癥的研究

何曉剛

上海策乘生物技術(shù)服務(wù)公司(上海，200437)

目的 PI3K信號通路在破骨細(xì)胞前體細(xì)胞增殖、 破骨細(xì)胞分化中均發(fā)揮重要功能。BYL719是經(jīng)典的PI3K通路抑制劑， 但其對骨代謝的影響， 目前未見報(bào)道。方法 通過構(gòu)建卵巢切除后小鼠骨質(zhì)疏松癥模型， 運(yùn)用microCT進(jìn)行骨組織形態(tài)學(xué)分析， 研究BYL719對骨質(zhì)疏松癥的治療作用。在此基礎(chǔ)上， 通過體外研究BYL719對破骨細(xì)胞前體細(xì)胞活性、 破骨細(xì)胞分化、 破骨細(xì)胞特異性基因表達(dá)以及破骨細(xì)胞骨吸收功能， 明確BYL719對破骨細(xì)胞的功能。結(jié)果 BYL719在5 mg/kg和10 mg/kg濃度下， 均可有效防治小鼠卵巢切除導(dǎo)致的骨丟失， 可以抑制破骨細(xì)胞前體細(xì)胞活性， 抑制破骨細(xì)胞分化以及破骨細(xì)胞特異基因表達(dá)。結(jié)論 PI3K-mTOR抑制劑BYL719可通過影響破骨細(xì)胞前體細(xì)胞活性、 破骨細(xì)胞分化， 最終達(dá)到治療骨質(zhì)疏松癥的作用。

骨質(zhì)疏松癥； PI3K抑制劑； BYL719

0 引言

骨質(zhì)疏松癥是一種影響中老年人健康的骨代謝性疾病， 以骨組織顯微結(jié)構(gòu)損傷， 骨密度下降， 骨質(zhì)量降低為特征， 最終可因骨密度和骨質(zhì)量的同時(shí)下降， 導(dǎo)致脆性骨折發(fā)生， 骨質(zhì)疏松癥患者脆性骨折的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)高達(dá)40%[1]。目前我國約有骨質(zhì)疏松癥患者9 000萬人， 已成為世界上擁有骨質(zhì)疏松癥患者最多的國家[2]。隨著社會發(fā)展和人口老齡化趨勢加劇， 骨質(zhì)疏松癥的發(fā)病率進(jìn)一步增高， 已成為威脅我國老年人群健康的重要慢性疾病。

導(dǎo)致骨質(zhì)疏松癥發(fā)生的主要病理機(jī)制， 包括成骨細(xì)胞骨形成功能的下降， 以及破骨細(xì)胞骨吸收功能的上升， 導(dǎo)致機(jī)體骨重建失衡， 凈骨量減少， 造成骨質(zhì)的凈丟失。破骨細(xì)胞來源于骨髓單核-巨噬細(xì)胞系， 在RANKL(核因子κB受體活化因子配體)的刺激下， 激活NF-κB信號通路、 MAPK(JNK、 p38、 ERK)信號通路、 NFAT信號通路、 Src/PI3K/AKT信號通路等[3-6]， 促使破骨細(xì)胞分化成熟并發(fā)揮吸收骨質(zhì)的作用。因此， 針對RANKL下游的信號通路， 研發(fā)抑制這些信號通路的小分子藥物， 進(jìn)而抑制破骨細(xì)胞骨吸收功能， 減少骨量丟失， 是治療骨質(zhì)疏松的一個方向。

PI3K-Akt-mTOR信號通路在破骨細(xì)胞分化成熟中發(fā)揮重要作用， 激活的PI3K 可磷酸化Akt蛋白， 進(jìn)而通過下游效應(yīng)器AFX/FOX04來抑制破骨細(xì)胞的凋亡[7-8]。因此， PI3K信號活化對于破骨細(xì)胞的存活至關(guān)重要， 但目前針對PI3K-Akt-mTOR靶點(diǎn)治療骨質(zhì)疏松的報(bào)道仍較少。BYL719是一種已知的PI3K抑制劑， 能夠抑制腫瘤的PI3K活性從而達(dá)到治療腫瘤的作用， 但其在破骨細(xì)胞中的作用， 未見報(bào)道。本研究旨在明確PI3K抑制劑BYL719在治療破骨細(xì)胞相關(guān)骨質(zhì)疏松癥中的治療作用， 以期為骨質(zhì)疏松癥的治療提供新思路。

1 材料和方法

實(shí)驗(yàn)所用的α-MEM培養(yǎng)基、 胎牛血清購自Gbico公司； BYL719抑制劑購自Selleck公司， 在二甲基亞砜(DMSO)中溶解。MTS檢測試劑盒購自Promega公司； 重組巨噬細(xì)胞集落刺激因子(M-CSF)和重組RANKL購自R&D公司。

1.1 去卵巢骨質(zhì)疏松小鼠模型的建立和藥物治療

取12周齡C57BL6小鼠32只， 隨機(jī)分成4組， 包括假手術(shù)組， 去卵巢手術(shù)組， 去卵巢加低劑量(5 mg/kg)BYL719治療組， 去卵巢加高劑量(10 mg/kg)BYL719治療組。去卵巢手術(shù)采用背側(cè)入路,依次切開皮膚, 皮下和肌層, 暴露腹腔, 切除雙側(cè)卵巢, 以絲線將殘端結(jié)扎, 再逐層縫合關(guān)閉傷口。在成功去卵巢后1周， 結(jié)合文獻(xiàn)BYL719在腫瘤動物實(shí)驗(yàn)中體內(nèi)給藥濃度， 按照5 mg/kg(低劑量組)和10 mg/kg(高劑量組)BYL719的濃度進(jìn)行給藥， 對照組給予無菌生理鹽水。給藥4周后， 小鼠處死并獲取骨組織標(biāo)本， microCT(ScanCoμ-100)按照10 μm分辨率掃描脛骨， 并分析脛骨骨小梁的骨體積分?jǐn)?shù)(BV/TV)、 骨小梁數(shù)量(Tb.N)、 骨小梁厚度(Tb.Th)和骨小梁間距(Tb.Sp)。

1.2 破骨細(xì)胞前體細(xì)胞體外增殖實(shí)驗(yàn)

取4到6周的C57BL6小鼠， 取股骨和脛骨， 沖出骨髓腔內(nèi)細(xì)胞后， 將細(xì)胞種在T75 培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)， 培養(yǎng)基為含30 ng/mL的M-CSF， 10%胎牛血清的alpha MEM， 隔天換液， 培養(yǎng)3～5 d， 可獲得骨髓來源的單核巨噬細(xì)胞(BMM細(xì)胞)。按照8 000 個/孔的細(xì)胞密度， 接種到96孔板上， 給予不同濃度的BYL719， 并用MTS試劑盒觀察BYL719對其增殖影響。

1.3 破骨細(xì)胞分化實(shí)驗(yàn)

按照6 000個/孔的細(xì)胞密度接種破骨細(xì)胞前體細(xì)胞， 細(xì)胞在含50 ng/mL RANKL、 30 ng/mL的M-CSF及10%胎牛血清的alpha MEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)， 用不同濃度(0 nM～250 nM)的BYL719隔天刺激細(xì)胞， 培養(yǎng)5～7 d， 當(dāng)對照組有明顯的破骨細(xì)胞形成時(shí)， 終止培養(yǎng)， 用4%多聚甲醛固定細(xì)胞后， 抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)染色， 在顯微鏡下， 計(jì)算多于3個細(xì)胞核， TRAP染色陽性的破骨細(xì)胞的數(shù)量。

1.4 破骨細(xì)胞特異基因表達(dá)實(shí)驗(yàn)

按照50萬個/孔的細(xì)胞密度， 在6孔板中接種破骨細(xì)胞前體細(xì)胞， 同樣采用RANKL、 M-CSF和不同濃度的BYL719刺激破骨細(xì)胞5～7 d， 至對照組中成熟的破骨細(xì)胞分化形成后， 提取RNA， 并用realtime PCR擴(kuò)增破骨細(xì)胞特異的TRAP， Cathepsin K(Ctsk)， NFATc1， Calcitonin Receptor(CTR)等基因表達(dá)情況。

1.5 RT-PCR與Realtime-PCR

使用Trizol試劑分離細(xì)胞中的總RNA后， 用逆轉(zhuǎn)錄酶、 1 μg RNA模板和Oligo-dT引物合成cDNA， 隨后PCR擴(kuò)增破骨細(xì)胞相關(guān)基因， 或用SYBR Green(雙鏈嵌合熒光染色)實(shí)時(shí)定量PCR檢測破骨細(xì)胞相關(guān)基因表達(dá)。使用下列特定引物組織蛋白酶K(CTSK)(5'-GGGAGAAAAACCTGAAGC-3'; 5'-ATTCTGGGGACTCAGAGC-3')， 降鈣素受體;( 5'-TGGTTGAGGTTGTGCCCA-3'; 5'-CTCGTGGGTTTGCCTCATC-3';), NFATc1(5'-CAACGCCCTGACCACCGATAG-3'， 5'-GGCTGCCTTCCGTCTCATAGT-3')；TRAcP (Acp5)(5'-TGTGGCCATCTTTATGCT-3'， 5'-GTCATTTCTTTGGGGCTT-3')；GAPDH(5'-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3' 5'-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3')。

1.6 統(tǒng)計(jì)分析

所有的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分析采用Student'st檢驗(yàn)方法，P值小于0.05被認(rèn)為具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 BYL719保護(hù)卵巢切除后骨丟失

BYL719是一種特異性的PI3K抑制劑， 在動物體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中， 可抑制腫瘤PI3K， 從而發(fā)揮治療腫瘤的作用。但其在抗骨質(zhì)疏松中的作用， 未見報(bào)道。我們首先建立了小鼠卵巢切除導(dǎo)致的骨質(zhì)疏松癥模型。如圖1所示， 在對照組， 小鼠骨小梁骨量正常， 但是， 切除卵巢后5周， micro CT數(shù)據(jù)顯示， 小鼠骨體積分?jǐn)?shù)顯著降低， 骨小梁厚度下降， 骨小梁數(shù)量減少， 骨小梁間距增加， 提示骨質(zhì)疏松模型構(gòu)建成功(圖1(a)和圖1(b))。在此基礎(chǔ)上， 我們發(fā)現(xiàn)5 mg/kg和10 mg/kg的BYL719體內(nèi)給藥濃度， 給藥4周后， 低劑量和高劑量的BYL719均可有效抑制卵巢切除導(dǎo)致的骨丟失， 與卵巢切除組相比， BYL719給藥組骨量顯著增高， 骨小梁數(shù)量增加， 骨小梁間距減少， 表明BYL719可以有效抑制卵巢切除的骨丟失(圖1)。

(a) MicroCT掃描分析對照組(Sham),卵巢切除組(OVX),低劑量BVL719組(5 mg/kg)和高劑量BYL719組(10 mg/kg)對小鼠骨小梁的影響 (b)microCT分析上述四組骨形態(tài)參數(shù)， 表明BYL719能有效防治骨丟失， Sham組與OVX組比較。*P<0.05； OVX組與BYL719組進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，#P<0.05

(a) MicroCT scan of the control group (Sham) and (OVX) demonstrated the successful generation of OVX-induced bone loss model. In addition, low dose and high dose of BVL719 prevented OVX-induced bone loss. (b) Analysis of the BV/TV and trabecular number, trabecular thickness, trabecular separation of the 4 groups indicated BYL719 can effectively prevent bone loss. *, Sham group and OVX group,P<0.05; #, OVX group and BYL719 group,P<0.05

圖1 BYL719防治卵巢切除后骨丟失。
Fig.1 BYL719 prevents OVX-induced bone loss after OVX

2.2 BYL719對破骨細(xì)胞前體細(xì)胞增殖的影響

為了明確BYL719是否通過影響破骨細(xì)胞而發(fā)揮保護(hù)骨質(zhì)疏松的作用， 我們首先在體外研究其對破骨細(xì)胞前體細(xì)胞活性的影響。如圖2所示， 在500 nM的作用48 h和96 h后， BYL719均能有效抑制破骨細(xì)胞前體細(xì)胞活性， 表面破骨細(xì)胞前體細(xì)胞在500 nM及以上濃度時(shí)， 細(xì)胞增殖被抑制。但是， 在250 nM及以下濃度時(shí)， 細(xì)胞活性未受影響。該研究表明， BYL719能在500 nM以上濃度， 抑制破骨細(xì)胞前體細(xì)胞增殖， 但在500 nM以下濃度， 則無細(xì)胞毒性(圖2)。

2.3 BYL719抑制破骨細(xì)胞分化

在此基礎(chǔ)上， 我們進(jìn)一步研究BYL719對破骨細(xì)胞分化的影響。在RANKL刺激下， 骨髓來源的單核巨噬細(xì)胞能夠有效形成破骨細(xì)胞(對照組)， 而在無細(xì)胞毒性的濃度下， 低至62.5 nM， 125 nM以及250 nM的BYL719呈現(xiàn)濃度依賴性的抑制破骨細(xì)胞分化的趨勢， 表面BYL719能有效抑制破骨細(xì)胞分化(圖3)。

2.4 BYL719抑制破骨細(xì)胞基因表達(dá)

進(jìn)一步基因表達(dá)研究表明， BYL719在不同濃度作用下， 可以有效抑制破骨細(xì)胞相關(guān)的基因(TRAP，CTSK，NFATc1和CTR)表達(dá)， 且呈現(xiàn)濃度依賴性趨勢， 佐證了BYL719能有效抑制破骨細(xì)胞分化(圖4)。

(a) 不同濃度BYL719對破骨細(xì)胞前體細(xì)胞刺激48小時(shí)后， MTS檢測細(xì)胞活性 (b)不同濃度BYL719對對破骨細(xì)胞前體細(xì)胞刺激96小時(shí)后， MTS檢測細(xì)胞活性(*,與對照組相比，P<0.05)

(a) The proliferation of osteoclast precursor was analyzed after 48hrs stimulation with different concentration of BYL719 (b) The proliferation of osteoclast precursor was analyzed after 96hrs stimulation with different concentration of BYL719. (*, comparing with control group,P<0.05).

圖2 BYL719對破骨細(xì)胞前體細(xì)胞活性的影響。

Fig.2 The effect of BYL719 on osteoclast precursor proliferation

(a)不同濃度BYL719對破骨細(xì)胞分化的影響， TRAP染色檢測形成的破骨細(xì)胞的數(shù)量(b)統(tǒng)計(jì)不同濃度BYL719處理后， 破骨細(xì)胞數(shù)量(*,與對照組對比，P<0.05)

(a) The effect of BYL719 on osteoclast differentiation (b) TRAP positive osteoclast number after the treatment with different concentration of BYL719 (*, comparing with control group,P<0.05)

圖3 BYL719對破骨細(xì)胞分化的影響。

Fig.3 The effect of BYL719 on osteoclast differentiation

3 討論

PI3K-Akt-mTOR信號通路在腫瘤中廣泛研究， H1047R， E545K和H701P是三與腫瘤發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)的PI3K突變， 因此， 針對PI3K的新型化合物研發(fā)是治療腫瘤的一個重要方向， 目前有包括BYL719, NVP-BEZ235等在內(nèi)的PI3K-mTOR特異性小分子抑制劑被不斷研發(fā)并報(bào)道用于腫瘤的治療。

PI3K-mTOR不僅僅在腫瘤中發(fā)揮重要作用， 其在破骨細(xì)胞相關(guān)的骨吸收中也發(fā)揮重要作用。PI3K被激活后， 可促使Akt活化并抑制凋亡基因的表達(dá)和增強(qiáng)抗凋亡基因的表達(dá)， 最終調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖、 分化、 存活和遷移等； Ke K等發(fā)現(xiàn)， TRAF6 可通過激活c-src從而刺激PI3K， 激活的PI3K 使Akt活化， Akt又通過下游效應(yīng)器AFX/FOX04來抑制破骨細(xì)胞的凋亡[7-8]。因此， 抑制PI3K信號通路， 進(jìn)而抑制破骨細(xì)胞的功能， 是治療骨質(zhì)疏松癥的一個研究方向。

圖4 不同濃度BYL719破骨細(xì)胞特異性基因表達(dá)的影響 Fig.4 The effecct on osteoclast specific gene expression affected by different concentration of BYL719

為此， 我們研究了PI3K抑制劑BYL719對破骨細(xì)胞相關(guān)的骨質(zhì)疏松的作用。我們發(fā)現(xiàn)， 在有效治療腫瘤的體內(nèi)劑量下， BYL719也能在體內(nèi)有效保護(hù)卵巢切除導(dǎo)致的骨丟失。進(jìn)一步體外實(shí)驗(yàn)研究表明， 高濃度的BYL719處理下， 破骨細(xì)胞前體細(xì)胞活性明顯受影響， 提示高濃度的BYL719通過抑制PI3K-Akt信號通路， 激活破骨細(xì)胞前體細(xì)胞凋亡而發(fā)揮部分作用。在此基礎(chǔ)上， 在沒有細(xì)胞毒性的低濃度BYL719作用下， 仍可有效抑制破骨細(xì)胞分化， 減少TRAP染色陽性的破骨細(xì)胞形成， 降低破骨細(xì)胞特異性的基因表達(dá)， 從而進(jìn)一步發(fā)揮抑制破骨細(xì)胞相關(guān)骨丟失的作用。

綜上所述， 本研究發(fā)現(xiàn)抑制腫瘤的PI3K抑制劑BYL719可通過抑制破骨細(xì)胞前體細(xì)胞增殖、 抑制破骨細(xì)胞分化等多方面作用， 發(fā)揮防止卵巢切除后骨丟失的作用。因此， PI3K抑制劑是治療骨質(zhì)疏松藥物研發(fā)的一個新方向。

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Inhibitor BYL719 Prevented OVX-induced Osteoporosis

HE Xiaogang

Shanghai Cersheng Biotechnology Service Company(Shanghai，200437)

Objective PI3K signaling pathway plays a pivotal role in osteoclast precursor proliferation, osteoclast differentiation. In addition, PI3K-mTOR specific inhibitor BYL719 hasn't been shown to affect bone metabolism. Methods In this study, we generated OVX-induced osteoporosis mice model and administrated 5 mg/kg and 10 mg/kg BYL719 in these mice. In addition, the effect of BYL719 on osteoclast precursor cell proliferation, osteoclast differentiation, osteoclast specific gene expression and bone-resorption was investigated. Results Both low and high dose BYL719 prevented OVX-induced osteoporosis, which can inhibit osteoclast precursor cell proliferation, osteoclast differentiation and gene expression. Conclusion PI3K-mTOR specific inhibitor BYL719 can prevent osteoporosis by inhibiting osteoclast precursor proliferation and osteoclast differentiation, indicating BYL719 as a potential candidate for the treatment of osteoporosis.

osteoporosis, PI3K inhibitor, BYL719

10.3969/j.issn.1674-1242.2017.03.003

何曉剛，E-mail:18958307777@189.cn

R587.7

A

1674-1242(2017)03-0140-05

2017-06-28)