人參核盤菌侵染對(duì)參根不同部位細(xì)胞壁降解酶及防御酶活性的影響

車喜慶，傅俊范，李自博，周如軍，桑海旭，邢亞楠

(1.遼寧省鹽堿地利用研究所，遼寧 盤錦 124010; 2.沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué) 植物保護(hù)學(xué)院，遼寧 沈陽 110866)

人參核盤菌侵染對(duì)參根不同部位細(xì)胞壁降解酶及防御酶活性的影響

車喜慶1,2，傅俊范2*，李自博2，周如軍2，桑海旭1，邢亞楠1

(1.遼寧省鹽堿地利用研究所，遼寧 盤錦 124010; 2.沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué) 植物保護(hù)學(xué)院，遼寧 沈陽 110866)

為了明確人參不同部位對(duì)人參核盤菌的敏感性，在溫室分別對(duì)人參蘆頭部和須根部接種病菌，觀察不同部位發(fā)病情況，并對(duì)人參不同部位細(xì)胞壁降解酶活性及寄主防御酶活性進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果表明，人參菌核病蘆頭部發(fā)病時(shí)間早于根須部。人參蘆頭部多聚半乳糖醛酸酶(PG)、果膠甲基半乳糖醛酸酶(PMG)、果膠甲基反式消除酶(PMTE)活性在侵染過程中大于根須部，而多聚半乳糖醛酸反式消除酶(PGTE)活性在侵染中期及羧甲基纖維素酶(Cx)、β-葡萄糖苷酶活性在侵染后期出現(xiàn)蘆頭部小于根須部的現(xiàn)象。人參根須部過氧化氫酶(CAT)、過氧化物酶(POD)活性在侵染前期，超氧化物歧化酶(SOD)活性在侵染中期大于蘆頭部?？梢?，人參蘆頭部對(duì)菌核病較根須部敏感，可能主要是蘆頭部在病菌侵染前期細(xì)胞壁降解酶(PG、PMG、PMTE)活性較高,而防御酶(POD、CAT)活性較低造成。

人參菌核病； 細(xì)胞壁降解酶； 植物防御酶； 侵染過程

人參(PanaxginsengC.A.Mey.)屬五加科多年生藥用植物，具有極高的藥用和經(jīng)濟(jì)價(jià)值。人參菌核病是由土壤傳播的最嚴(yán)重的人參病害之一，病原為人參核盤菌(SclerotiniaginsengWang et Chen)，最早于1912年從人參根腐病株上分離得到。以往該病發(fā)生較輕，對(duì)人參產(chǎn)量及質(zhì)量影響小，然而近年來由于非林地栽參面積的日益擴(kuò)大，人參菌核病發(fā)生普遍，危害嚴(yán)重。田間調(diào)查發(fā)現(xiàn)，病田率在90%以上，發(fā)病率達(dá)到5.7%，菌核病已經(jīng)成為長白山區(qū)人參主要病害之一[1]。該病害前期發(fā)生在人參蘆頭部，在蘆頭部壞死之后逐漸擴(kuò)張到根須部，但根須部病害發(fā)生相對(duì)較輕，發(fā)病時(shí)間也延后，最后整株腐爛死亡。由于蘆頭部壞死后植株的根部與地上的頸部分離，嚴(yán)重影響人參的產(chǎn)量。迄今，國內(nèi)外僅對(duì)人參菌核病病原學(xué)、病菌生態(tài)型和致病性分化以及藥劑防治等方面進(jìn)行研究[2]，未見關(guān)于不同部位發(fā)病時(shí)間不一致現(xiàn)象的研究報(bào)道。

細(xì)胞壁是植物重要的物理性防御屏障，在抵御真菌侵染過程中起著重要作用[3]。核盤菌在侵入植物過程中，主要通過分泌果膠酶、纖維素酶等水解酶瓦解寄主細(xì)胞壁等防衛(wèi)體系，抑制寄主相關(guān)抗性反應(yīng)，最終達(dá)到侵染目的[4]?；钚匝踉诓≡c植物互作過程中能夠起到激發(fā)寄主抗性反應(yīng)的作用，但活性氧過量時(shí)也會(huì)使寄主細(xì)胞受到傷害，寄主細(xì)胞可以通過產(chǎn)生一系列抗氧化酶，如超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)、過氧化物酶(POD)等清除活性氧，降低危害[5]。為明確人參菌核病在不同部位發(fā)病時(shí)間不一致這一現(xiàn)象產(chǎn)生的原因，對(duì)人參核盤菌在侵染人參根不同部位過程中細(xì)胞壁降解酶及防御酶的活性進(jìn)行分析，以此來探討酶活性變化對(duì)產(chǎn)生這一現(xiàn)象的作用，為了解該病菌在田間的侵染過程及生產(chǎn)上安全防控人參菌核病提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1供試菌株與人參

人參核盤菌采自吉林省集安市榆林鎮(zhèn)人參病株，采用常規(guī)分離法分離鑒定后，保存于沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)藥用植物病害研究室。供試2年生人參來源于遼寧省撫順市新賓縣，在沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)溫室盆栽種植。

1.2材料處理及取樣

選擇外觀整齊、健康并無損傷的人參栽于營養(yǎng)土與楊樹林下土1∶1均勻混合的盆中，每盆2株，置于溫室內(nèi)。緩苗后對(duì)根部進(jìn)行針刺接種：分別在蘆頭部和根須部使用大頭針刺扎10下，然后在PDA培養(yǎng)基上20 ℃培養(yǎng)5 d的人參核盤菌菌落邊緣打取直徑為4 mm的菌餅，每個(gè)部位接種1個(gè)菌餅，將長滿菌絲的一面接種到根上，噴灑無菌水并覆蓋保鮮膜保濕，分別在接種后0、1、2、3、5、7、9、15 d取樣，其中接種后0、1、2 d直接去除菌餅取樣，接種3 d后用鑷子除去接種的菌餅并用無菌水輕度清洗。根據(jù)預(yù)試驗(yàn)，POD活性測(cè)定的取樣時(shí)間選擇0.5 d替代1 d。經(jīng)液氮冷凍后于-80 ℃下保存待用。并以每個(gè)處理隨機(jī)抽取10株進(jìn)行病害調(diào)查，計(jì)算發(fā)病率。

1.3細(xì)胞壁降解酶及防御酶提取

細(xì)胞壁降解酶的提取參照高增貴等[6]方法：將取樣的每株人參分別在病健交界處的蘆頭部和主根根須部稱質(zhì)量1 g，加入5 mL 0.25 mol/L NaCl提取液及適量石英砂，冰浴中研磨成勻漿，經(jīng)紗布過濾后，4 ℃、10 000 r/min離心20 min。取上清液(粗酶液)用于酶活性測(cè)定。每個(gè)處理重復(fù)4次。

防御酶提取參照倪郁等[7]方法并改進(jìn)：將每株取樣的植株分別稱取蘆頭部和根須部各0.5 g，加入0.05 mol/L pH值7.8的磷酸緩沖液5.0 mL、PVP 0.05 g，于冰浴中研磨成勻漿， 4 ℃、10 000 r/min下離心20 min，上清液即為待測(cè)粗酶液。每個(gè)處理重復(fù)4次。

1.4細(xì)胞壁降解酶及防御酶活性測(cè)定

細(xì)胞壁降解酶活性測(cè)定參照蘇丹[8]的方法進(jìn)行。多聚半乳糖醛酸酶(PG)、果膠甲基半乳糖醛酸酶(PMG)、羧甲基纖維素酶(Cx)與β-葡萄糖苷酶于520 nm處測(cè)定反應(yīng)混合液釋放的還原糖含量，以30 ℃下每小時(shí)每克酶液催化底物釋放1.0 μg還原糖為1個(gè)酶活性單位；多聚半乳糖醛酸反式消除酶(PGTE)、果膠甲基反式消除酶(PMTE)于232 nm處測(cè)定反應(yīng)混合液釋放的還原糖含量，以30 ℃下每分鐘每克酶液催化底物釋放1.0 μmol還原糖為1個(gè)酶活性單位。

CAT活性測(cè)定參照Dhindsa等[9]的方法進(jìn)行，以每分鐘OD240值變化0.01的酶量定義為1個(gè)酶活性單位；POD活性測(cè)定參照張志良等[10]的方法進(jìn)行，以O(shè)D470值變化0.1為1個(gè)酶活性單位；SOD活性測(cè)定參照孫群等[11]的方法進(jìn)行，以反應(yīng)抑制氮藍(lán)四唑(NBT)光氧化還原50%的酶量作為1個(gè)酶活性單位。

2 結(jié)果與分析

2.1人參核盤菌接種人參根后發(fā)病情況

通過圖1及表1可知，人參菌核病在不同部位發(fā)病時(shí)間有所不同，蘆頭部早于根須部3 d，隨著接種后時(shí)間變化，根須部病害發(fā)生也加重。從圖1可以看出，在接種后2 d蘆頭部位出現(xiàn)輕微侵入，3 d出現(xiàn)明顯菌絲生長，5 d開始產(chǎn)生菌核。而根須部位在接種前3 d并未出現(xiàn)明顯菌絲生長，接種后5 d出現(xiàn)少量菌核。在侵染9 d后，整個(gè)根部均發(fā)生嚴(yán)重病害。

圖1 接種人參核盤菌后人參根部發(fā)病癥狀

由表1可知，蘆頭部在接種后2 d開始發(fā)病，發(fā)病率為10%，接種后5 d發(fā)病率達(dá)100%；根須部在接種后5 d才開始發(fā)病，發(fā)病率為50%，接種后9 d發(fā)病率達(dá)100%。

表1 接種人參核盤菌后人參根部發(fā)病調(diào)查結(jié)果

2.2人參核盤菌接種人參根后細(xì)胞壁降解酶活性變化

2.2.1 PG與PMG活性 由圖2可知，人參核盤菌在侵染植株過程中蘆頭部PG、PMG活性一直高于根須部。前期PG活性在人參蘆頭部與根須部都處于上升階段，蘆頭部PG活性在接種后5 d達(dá)到峰值，之后有所下降，而根須部在5 d達(dá)到峰值后急速下降，但在7 d后開始再次上升。在蘆頭部，PMG活性前期升高較快，在接種后2 d達(dá)到峰值后開始緩慢降低；在根須部，PMG活性在接種后1 d降到最低值后迅速升高，并在接種后5 d達(dá)到最大值，之后下降，而9 d后開始再次上升。

不同小寫字母表示同一部位不同時(shí)間之間差異顯著(P<0.05)，下同圖2 接種人參核盤菌后PG與PMG活性變化

2.2.2 PGTE與PMTE活性 由圖3可知，在侵染過程中除接種后7 d外，PGTE活性在蘆頭部一直大于根須部，蘆頭部PGTE活性在接種后1 d達(dá)到最大值，隨后持續(xù)下降在接種后7 d降到最小值，并且小于根須部，之后再次上升并在接種后9 d開始平穩(wěn)。PMTE活性在蘆頭部變化較大，先后在接種后1、3、9 d出現(xiàn)峰值，并在9 d達(dá)到最大值，而在根須部PMTE活性幾乎無變化。

圖3 接種人參核盤菌后PGTE與PMTE活性變化

2.2.3 Cx與β-葡萄糖苷酶活性 由圖4可知，蘆頭部Cx與β-葡萄糖苷酶活性在侵染前7 d一直高于根須部，之后開始改變。蘆頭部Cx活性在病菌侵染植株前期一直增強(qiáng)，在接種后7 d達(dá)到最大值后下降。前期根須部Cx活性除在接種后3～5 d有所下降外均增強(qiáng)，并在9 d達(dá)到峰值。蘆頭部β-葡萄糖苷酶活性前期一直上升，在接種后7 d達(dá)到峰值后開始下降，根須部β-葡萄糖苷酶活性在接種前5 d一直上升，在5 d達(dá)到第1個(gè)峰值后下降，7 d后其活性再次上升。

圖4 接種人參核盤菌后Cx與β-葡萄糖苷酶活性變化

2.3人參核盤菌接種人參根后防御酶活性變化

2.3.1 SOD活性 由圖5可知，在侵染過程中，只有在接種后7 d根須部SOD活性大于蘆頭部。侵染前期，蘆頭部SOD活性顯著升高，在接種后1 d達(dá)到最大值，之后開始下降，在接種后7 d降到最低后再次上升；根須部SOD活性分別在接種后1 d和7 d達(dá)到峰值。

圖5 接種人參核盤菌后SOD活性變化

2.3.2 POD活性 由圖6可知，侵染過程中，根須部POD活性僅在接種后0.5 d大于蘆頭部。蘆頭部POD活性分別在接種后3、9 d達(dá)到峰值，并在 9 d達(dá)到最大值后顯著下降；根須部分別在接種后0.5 d和3 d達(dá)到峰值，其中接種后3 d為最大值。

2.3.3 CAT活性 由圖7可知，在病菌侵染前期，根須部CAT活性明顯大于蘆頭部，5 d之后發(fā)生改變，蘆頭部酶活性升高并大于根須部。蘆頭部CAT活性前期顯著降低，2 d后快速升高并于接種后7 d達(dá)到最大值，之后下降。根須部酶活性前期呈下降趨勢(shì)，3 d后開始出現(xiàn)多次連續(xù)變化。

圖6 接種人參核盤菌后POD活性變化

圖7 接種人參核盤菌后CAT活性變化

3 結(jié)論與討論

人參菌核病在蘆頭部發(fā)病時(shí)間比根須部早，這與田間調(diào)查結(jié)果相一致。本次試驗(yàn)采用的是針刺接種，而在田間，蘆頭部位在上，越冬過程中可能更容易受到凍害的影響出現(xiàn)自然傷口，同時(shí)田間管理中蘆頭部位也會(huì)受到人為影響，因此，田間環(huán)境及越冬條件對(duì)傷口的影響有待進(jìn)一步研究。田間蘆頭部早于根須部的發(fā)病時(shí)間更長(1周)，這可能是由于田間相對(duì)于溫室環(huán)境更加復(fù)雜，多種因素共同作用所導(dǎo)致的。

細(xì)胞壁降解酶是植物的主要致病因子之一。本試驗(yàn)對(duì)主要的細(xì)胞壁降解酶活性測(cè)定分析發(fā)現(xiàn)，PG、PMG活性最高，Cx與β-葡萄糖苷酶活性其次，這與楊志敏等[12]報(bào)道的馬鈴薯干腐病、陳捷等[13]報(bào)道的玉米紋枯病致病過程相似。PG、PMG作用強(qiáng)于其他酶，這與吳潔云等[14]報(bào)道的灰葡萄孢侵染番茄的結(jié)果一致，可能是果膠酶在侵染過程中起著更加重要的作用，但與劉志恒等[15]報(bào)道的棒孢葉斑病菌侵染中纖維素酶活性高于果膠酶不同，可能是細(xì)胞壁降解酶在不同病原菌與寄主互作過程中存在差異。在病原菌侵染人參植株根部過程中，蘆頭部的細(xì)胞壁降解酶活性明顯高于根須部，蘆頭部PG、PMG和PMTE活性在整個(gè)過程中一直大于根須部，PGTE活性在侵染中期及Cx與β-葡萄糖苷酶活性在侵染后期出現(xiàn)小于根須部的情況，這可能是植株在侵染5 d后，蘆頭部組織已壞死，其相關(guān)酶活性下降，而根須部受到病原菌的持續(xù)侵染，相關(guān)酶活性已經(jīng)上升所導(dǎo)致的。PG、PMG、Cx及β-葡萄糖苷酶活性在侵染根須部和蘆頭部過程中顯著升高，PGTE與PMTE活性在侵染蘆頭部過程中也發(fā)生較大變化，但PGTE活性在侵染根須部的過程中波動(dòng)相對(duì)較小且PMTE無變化，其中蘆頭部在前期細(xì)胞壁主要降解酶PG、PMG、PMTE活性高于根須部，對(duì)細(xì)胞壁的降解程度大，這可能是蘆頭部病害發(fā)生較早的主要原因。病原侵染寄主是一個(gè)復(fù)雜的過程。張敬澤等[16]報(bào)道，柿樹炭疽病菌侵染不同部位發(fā)病情況不同，可能菌絲的形成和擴(kuò)展是寄主上致病性差異的重要機(jī)制之一。人參蘆頭比根須部的體積大，菌絲生長量在蘆頭部大于根須部也可能影響細(xì)胞壁降解酶的產(chǎn)生。

對(duì)植物抗病機(jī)制研究表明，H2O2參與抗病反應(yīng)信息傳遞，激發(fā)植物的防衛(wèi)反應(yīng)并產(chǎn)生系統(tǒng)獲得性抗性。植物體內(nèi)POD、SOD均與抗性反應(yīng)有關(guān),是植物體內(nèi)的主要保護(hù)酶系，參與木質(zhì)素合成、自由基消除等，其活性的增加有利于木質(zhì)素合成，是與植物抗病相關(guān)的重要酶；CAT是植物降解H2O2的主要酶，在植物防衛(wèi)反應(yīng)過程中能保持活性氧的體內(nèi)平衡[16]。本研究發(fā)現(xiàn)，根須部POD、CAT活性在侵染前期高于蘆頭部，與蘆頭部發(fā)病時(shí)間早于根須部相一致，因此，可能是由于抗性相關(guān)酶的產(chǎn)生導(dǎo)致根須部的抗病性增強(qiáng)，但SOD活性只有在侵染中期根須部大于蘆頭部，這可能是由于3種酶活性變化不是同步的，在侵染的不同階段發(fā)揮作用，這與王勇等[17]報(bào)道的辣椒青枯病相關(guān)研究結(jié)果相似。

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Effects ofSclerotiniaginsengon Cell Wall Degrading Enzymes and Defense Enzymes in Different Position of Ginseng

CHE Xiqing1,2,FU Junfan2*,LI Zibo2,ZHOU Rujun2,SANG Haixu1,XING Yanan1

(1.Liaoning Provincial Saline-Alkali Land Utilization and Research Institute,Panjin 124010,China; 2.College of Plant Protection,Shenyang Agricultural University,Shenyang 110866,China)

In order to clarify the sensitivity of different parts of ginseng toSclerotiniaginseng,heads and roots were separately inoculated with the pathogen in greenhouse,the disease development was observed，and the activities of cell wall degrading enzymes and defense enzymes in different parts were measured.The results showed that the disease onset time on the heads was earlier than the roots.The activities of polygalacturonase(PG),polymethylgalacturonase(PMG),pectin methyltranseliminase(PMTE) in heads were higher than the roots in the whole process of infection,but polygalacturonic acid transeliminase(PGTE) activity in the middle of infection and carboxymethylcellulose(Cx),β-glucosidase activities in the late stage of infection showed lower in the heads than in the roots.The catalase(CAT) and peroxidase(POD) activities in the early stage of infection,superoxide dismutase(SOD) activity in the middle of infection were higher in the roots than in the heads.Therefore,the main reasons for the higher sensitivity of heads than roots to sclerotinia rot were that in the early stage of infection the activities of cell wall degrading enzymes(PG,PMG,PMTE) were higher and the activities of defense enzymes(POD,CAT) were lower in heads.

sclerotinia rot of ginseng; cell wall degrading enzymes; plant defense enzymes; infection process

S435.675

A

1004-3268(2017)10-0066-05

2017-03-13

公益性行業(yè)(農(nóng)業(yè))科技專項(xiàng)(201303111)

車喜慶(1988-)，男，遼寧營口人，研究實(shí)習(xí)員，碩士，主要從事植物病理學(xué)研究。E-mail:chexiqing@126.com

*通訊作者：傅俊范(1958-)，男，遼寧朝陽人，教授，主要從事藥用植物病理學(xué)研究。E-mail:fujunfan@163.com